Favonoidy a fyto-oxylipínové reakcie v listoch granátového jablka (Punica Granatum L.) 1. časť

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Abstrakt:Metyljasmonát (MeJA) produkovaný v rastlinách môže sprostredkovať ich reakciu na environmentálne stresy. Ukázalo sa tiež, že exogénna aplikácia MeJA aktivuje signálne dráhy a indukuje akumuláciu fytoalexínu v mnohých rastlinných druhoch. Aby sme pochopili, ako rastliny granátového jablka biochemicky reagujú na environmentálne stresy, analýza metabolitov sa uskutočnila v listoch granátového jablka podrobených aplikácii MeJA a odhalila jedinečné zmeny v hydrolyzovateľných tanínoch, flavonoidoch a fyto-oxylipínoch. Okrem toho transkriptómové a qPCR analýzy v reálnom čase falošne a MeJA ošetrených listov granátového jablka identifikovali odlišne exprimované metabolické gény a transkripčné faktory, ktoré sa potenciálne podieľajú na kontrolehydrolyzovateľnétanínové, flavonoidové a fyto-oxylipínové dráhy. Molekulárna, biochemická a bioinformatická charakterizácia jedinéholipoxygenázas trvalou, MeJA-indukovanou expresiou ukázala, že je schopná oxidovať polynenasýtené mastné kyseliny, aj keď sa nenachádzajú v subcelulárnom kompartmente, kde boli produkované nejasmonátové (non-JA) fyto-oxylipíny. Tieto výsledky spoločne naznačujú, že zatiaľ čo široká supresia flavonoidov a antokyanov je aspoň čiastočne kontrolovaná na transkripčnej úrovni, indukovaná biosyntéza non-JAFyto-oxylipínypravdepodobne nie je transkripčne regulovaný. Celkovo lepšie pochopenie toho, ako listy granátového jablka reagujú na environmentálne stresy, nielenže podporí zdravie a produktivitu rastlín, ale bude mať vplyv aj na ľudské zdravie, pretože plody vyrobené z rastlín granátového jablka sú bohatým zdrojom nutričných zlúčenín.

Kľúčové slová:Metyljasmonát.Flavonoid·Antokyanín · Mastná kyselina.Fyto-oxylipín· Lipoxygenáza

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Úvod

Keď sú zranené alebo napadnuté bylinožravcami a patogénmi, rastliny produkujú a emitujú metyljasmonát (MeJA), ktorý neporanené rastlinné tkanivá a susedné rastliny vnímajú, aby aktivovali obrannú reakciu (Cheong a Choi 2003). Okrem toho sa ukázalo, že exogénna aplikácia MeJA na rastlinu vyvoláva signálne dráhy, ako aj produkciu proteínov súvisiacich s patogenézou a obranných chemikálií známych ako fytoalexíny. Fenolické fytoalexíny, napr. flavonoidy a antokyány, vykazovali zvýšenú akumuláciu v reakcii na liečbu MeJA v rôznych rastlinách, ako je Arabidopsis thaliana, hrozno (Vitis vinifera), banán (Musa acuminate), jablko (Malus Domestica) a červená malina (Rubus idaeus )(Pandey a kol. 2016; Portu a kol. 2015; De Geyteret a kol. 2012; Shafiq a kol. 2011; Flo-res a Ruiz del Castillo 2014). Biosyntéza flavonoidov a antokyanov začína tvorbou naringenínového chalkónu z kumaroyl CoA a troch molekúl malonylového CoA katalyzovaných chalkónsyntázou (CHS) a následnou izomerizáciou naringenínchalkónu na naringenín chalkón izomerázou (CHalkon izomeráza). Naringenín sa potom používa na vytvorenie základných flavonoidových a antokyánových skeletov, ktoré sú ďalej modifikované glykozylovými, metylovými, hydroxylovými a prenylovými funkčnými skupinami, aby vznikli rôzne štruktúry a funkcie (Tian et al. 2008).

Cistanche môže zlepšiť imunitu

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75-percentná podobnosť) a neobsahujú signálny peptid, zatiaľ čo LOX typu II majú celkovo nízku sekvenčnú podobnosť (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

Granátové jablko (Punica granatum L.) je špeciálna záhradnícka plodina cenená pre množstvo fenolových zlúčenín v ovocí, ako sú flavonoidy, antokyaníny a hydrolyzovateľné taníny (HT), ktoré pochádzajú z medziproduktu šikimátovej dráhy (Ono et al. 2016 ). Mnohé štúdie sa doteraz zamerali na úlohu fenolových látok z granátového jablka pri zmierňovaní stresu a chorôb u ľudí (Wu a Tian 2017). Naproti tomu o funkcii fenolových látok a iných fytochemikálií pri obrane granátového jablka proti abiotickým a biotickým faktorom je známe len málo (napr. poranenia, patogény, indukcia MeJA) v listoch a plodoch. Dve nedávne správy hodnotili ošetrenie MeJA pred zberom na kvalitu plodov granátového jablka po zbere (Koushesh Saba a Zarei 2019; Garcia-Pastor et al. 2020). Celkové antokyány, flavonoidy a fenoly plodov ošetrených MeJA, ale nie listov, sa analyzovali spoločne pomocou spektrofotometra. Jedna zo štúdií analyzovala aj jednotlivé antokyány pomocou hmotnostnej spektrometrie (Garcia-Pastor et al.2020). Zostáva však nejasné, ako tkanivá rastlín z granátového jablka, či už listy alebo plody, reagujú na environmentálne stresy pred nasadením ovocia.

Aby sme začali rozoberať interakcie medzi rastlinami granátového jablka a environmentálnymi faktormi, skúmali sme metabolickú odpoveď listov granátového jablka na exogénnu aplikáciu MeJA pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) a tandemovej hmotnostnej spektrometrie s ionizáciou kvapalinovou chromatografiou a elektrosprejom (LC-ESI-MS/MS) . V listoch granátového jablka ošetrených MeJA boli pozorované jedinečné zmeny v HT, flavonoidoch a antokyanoch, ako aj zmeny v lipidoch, mastných kyselinách a fyto-oxylipínoch. Porovnávacia analýza transkriptómu, overená analýzou qPCR v reálnom čase, odhalila, že štrukturálne a / alebo regulačné gény zapojené do metabolizmu HT, flavonoidov, antokyanov a fyto-oxylipínu boli rozdielne exprimované v listoch granátového jablka ošetrených falošne a MeJA. Jediný gén LOX, ktorý vykazoval trvalú upregulovanú expresiu v listoch ošetrených MeJA, bol podrobený ďalšej molekulárnej, biochemickej a fylogenetickej charakterizácii.

Materiály a metódy

Štandardy -glukogalín a pentagalloylglukóza boli zakúpené od Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Shanghai, Čína). Chemikálie použité v teste LOX boli získané od nasledujúcich predajcov: kyselina 3-(dimetylamino)benzoová (DMAB) (Adamas Reagent, Co., Ltd., Shanghai, Čína), kyselina linolová (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA),3-metyl-2-benzotiazolinón (MBTH) a hemoglobín (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Čína).

Rastlinné materiály Plody a semená granátového jablka (cv. Wonderful) štedro poskytla Panzhihua Academy of Agricultural and Forest Sciences a identifikoval ich Dr. Binjie Ge v Shanghai Chenshan Botanical Garden. Vzor poukážky (č. CSHO173966) bol uložený v herbári Shanghai Chenshan Botanical Garden, Šanghaj, Čína. Sadenice granátového jablka sa pestovali v rastovej miestnosti s kontrolovanou teplotou počas 6 týždňov pri teplote 25 stupňov a 16 hodín svetlo/8 hodín tma. Koncentrácia MeJA pre aplikáciu postrekom na rastlinné tkanivá sa údajne pohybuje od 100 do 250 μM（Ku et al.2014; Hickman a kol. 2017). Rôzne koncentrácie MeJA sa pôvodne aplikovali na listy granátového jablka, z ktorých 200 μM MeJA viedlo k rozoznateľnej metabolickej reakcii v predbežnej analýze a použilo sa na analýzy metabolitov a génovej expresie opísané v tejto štúdii. Pred ošetrením MeJA bola polovica rastlín granátového jablka premiestnená do inej pestovateľskej miestnosti s podobnými podmienkami. Zatiaľ čo rastliny v jednej rastovej miestnosti boli postriekané 200 μM MeJA, rastliny v druhej rastovej miestnosti boli postriekané vodou (t. j. falošná kontrola). O 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h,72-h po ošetrení, odchody z 3 do 5 falošne alebo MeJA ošetrených rastlín sa spojilo, čo predstavuje jeden biologický replikát. Zhromaždili sa tri biologické replikáty pre pokusy s falošnou liečbou a s MeJA; každý biologický replikát bol rozdelený na alikvóty na profilovanie metabolitov a analýzy génovej expresie.

Analýza profilovania metabolitov

Listy granátového jablka boli lyofilizované, odvážené a rozomleté ​​na jemný prášok s použitím guľôčok zirkónia v perličkovom šľahači (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Nemecko) počas 90. rokov pri 30 Hz. Na analýzu HPLC sa vzorka listov extrahovala v 70 percentnom metanole počas 60 minút pod sonikáciou a centrifugovala sa pri 13, 000 otáčkach za minútu počas 10 minút. Supernatant sa preniesol do HPLC fľaštičky, z ktorej sa 30 μl vstreklo do HPLC s reverznou fázou (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) a analyzovalo sa, ako už bolo opísané (Wil-son et al. 2019). Metabolity sa detegovali UV absorpciou pri 254 nm, 280 nm, 320 nm a 360 nm. Boli skonštruované štandardné kalibračné krivky -glukogalínu a pentagalloylglukózy; boli použité na konverziu oblastí píkov, ktoré zodpovedajú retenčným časom a absorpčným spektrám -glukogalínu a pentagalloylglukózy na príslušné koncentrácie.

For LC-ESI-MS/MS analysis, the homogenized leaf sample(100 mg) was extracted in 1 mL of 70% methanol at 4℃Covernight.On the following day, the methanolic extract was centrifuged at 10,000×g for 10 min and the supernatant was passed through a CNWBOND Carbon-GCB SPE cartridge（ANPEL, Shanghai, China） and a 0.22-μm syringe filter(ANPEL) prior to metabolite analysis. The extract （2 μL） was analyzed using LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)and a reverse phase C1s column(ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 βm, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, USA).Metabolites were eluted using solvents(A)water containing 0.04%acetic acid,and(B)acetonitrile containing0.04% acetic acid at a gradient of 0-11 min,95-5%A;11-12 min,5% A;12-12.1 min,5-95%A;12.1-15min,95%A.The flow rate was maintained at 0.4 mL min-1. Linear ion trap (LIT) and triple quadrupole(QQQ)MS scans were acquired in positive-and negative-ion modes. The turbo spray ion source was operated at 500℃C with an ionization voltage of 5500 V. The ion source gas I, gas I, and curtain gas were set at 55 psi,60 psi, and 25 psi, respectively. The collision gas (nitro-gen) was set at 5 psi. For the MRM analysis, declustering potential (DP)and collision energy(CE) were optimized for each precursor-product ion transition. For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values, and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 boli považované za výrazne zmenené.

Analýza transkriptómu

Celková RNA bola extrahovaná z listov granátového jablka pomocou činidla TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a kvantifikovaná pomocou Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Integrita vzoriek RNA bola overená separáciou na agarózovom géli (žiadna viditeľná degradácia) a stanovením pomeru OD20/28o (medzi 1,8 a 2,2) pomocou Nanodrop2000. Obohatenie mRNA z celkovej RNA sa uskutočnilo pomocou oligo (dT) magnetických guľôčok (Invitrogen). Knižnice mRNA-Seq sa skonštruovali pomocou súpravy na prípravu knižnice Truseq RNA (Illumina, San Diego, CA, USA). Analýza transkriptómu bola vykonaná na Illumina HiSeq4000 a pre každú vzorkovú knižnicu sa získalo 55-60 miliónov 150-bp párových odčítaní (PE150). Nespracované sekvenčné dáta boli spracované odstránením adaptorových sekvencií, ako aj short(<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS: GitHub. com/Joshi/sickle). Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1 a upravená hodnota P<>

Analýza qPCR v reálnom čase

Celková RNA bola extrahovaná z falošne a MeJA ošetrených listov granátového jablka pomocou súpravy RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen Biotech Co., Ltd., Peking, Čína). Reverzná transkripcia (RT) sa uskutočnila s použitím celkovej RNA a súpravy PrimeScriptTM RT Reagent Kit (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japonsko). Kvantitatívna PCR (qPCR) sa uskutočnila pomocou súpravy TB GreenTM Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) ( Takara) a StepOnePlus Real-Time PCR System (Ther-moFisher Scientific). Uskutočnila sa analýza krivky topenia a ukázala jeden amplifikačný produkt pre každý pár primérov. Na analýzu RT-qPCR sa skúmali tri biologické replikáty a každý s tromi technickými replikátmi na falošné vzorky a vzorky ošetrené MeJA. Génová expresia bola analyzovaná pomocou porovnávacej C,(△AC) metódy (Livak a Schmittgen 2001) a hladiny významnosti boli stanovené pomocou dvojstranného Studentovho t-testu. Sekvencie primérov pre analýzu qPCR v reálnom čase a účinnosti amplifikácie párov primérov sú uvedené v tabuľke S1.

Expresia a purifikácia rekombinantných proteínov a enzýmové testy

Otvorený čítací rámec Pgr025417 (kódujúci domnelý LOX) bol syntetizovaný na optimálne využitie kodónu v E. coli (Genewiz, Suzhou, Čína) a klonovaný v pET28a. Rekombinantný plazmid bol transformovaný do E. coli BL21 (DE3) bunky. Kultúra 5-ml Luria Bertani (LB) s 50ug ml-ikanamycínu sa začala z jednej kolónie a inkubovala sa cez noc za trepania pri 37 °C. Kultúra cez noc sa použila na inokuláciu 100-ml LB média s 50 ug ml-kanamycínu a nechala sa rásť na OD600 0,5. Potom sa pridal izopropyl- -D-tiogalaktozid (IPTG) do konečnej koncentrácie 0,1 mM na vyvolanie expresie proteínu. Po inkubácii s trepaním pri 16 stupňoch počas 18 hodín sa bunky zozbierali centrifugáciou. Bunkové pelety boli resuspendované v lyzovacom pufri (50 mM NaH, PO, pH 7,4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol) a homogenizované s použitím bunkového disruptora (Constant Systems Ltd, Northants, UK). His-značené proteíny boli purifikované použitím Guľôčky Ni-NTA (ThermoFisher Scientific) s premývacím pufrom (50 mM NaH,PO, pH 7,4 300 mM NaCl, 25 mM imidazol) a elučným pufrom (50 mM NaH, PO, pH 7,4 300 mM NaCl, 500 mM Purifikované proteíny sa separovali na 10 percentnom SDS-PAGE géli na vizualizáciu čistoty proteínu. Koncentrácia purifikovaných proteínov bola stanovená pomocou Bradfordovho testu (Bradford 1976).

Na test LOX sa ako substrát použila kyselina linolová v dvojkrokovej kolorimetrickej metóde s miernymi modifikáciami (Anthon a Barrett 2008）). 500-μl reakčná zmes vrátane 50 mM fosforečnanu sodného, ​​pH 6, 10 mM DMAB, 0,5 mM kyseliny linolovej a rôznych množstiev purifikovaných rekombinantných proteínov (1,5 mg ml -), sa inkuboval pri 25 stupňoch počas 10 minút. Do reakčnej zmesi sa pridal druhý roztok (500 ul) obsahujúci 0,2 mM MBTH a 0,1 mg ml-hemoglobínu a zmes sa inkubovala ďalších 5 minút. Reakcia bola ukončená pridaním 500 ul 1 % (w/v) laurylsulfátu sodného. Bola stanovená absorpcia svetla pri 598 nm. Subcelulárna lokalizácia a fylogenetické analýzy Prehľadávanie anotovaného genómu granátového jablka (Qin et al. 2017) identifikovalo 1 l predpokladaných LOX s plnou dĺžkou (786 aa až 970 aa), vrátane Pgr025413,Pgr020032,Pgr025418,Pgr025418,Pgr025418,Pgr0189,Pgr0898817Pgr02 -dĺžka sekvencie v GenBank XP_031395793),Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 a Pgr013780. Subcelulárna lokalizácia a miesta štiepenia signálnych peptidov pre LOX z granátového jablka boli predpovedané pomocou TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/) (Almagro Armenteros et al.2019).

Analýza miesta viazania TF

Na predpovedanie väzbových miest TF sa 1000 bp upstream od štartovacieho kodónu ATG cieľových génov získalo z GenBank a hľadalo sa oproti TF Eucalyptus Grandis v PlantRegMap (verzia 5) (Tian et al. 2020). Prahová hodnota pre väzbu identifikácia lokality bola nastavená na P Menšie alebo rovné le-4. Štatistická analýza kvantifikácie metabolitu, transkriptómu a údajov qPCR v reálnom čase je opísaná v príslušných častiach.

Výsledky

MeJA moduluje bunkovú signalizáciu a metabolické dráhy v listoch granátového jablka

Na pochopenie celogenómovej transkripčnej odozvy granátového jablka na elicitáciu MeJA, transkriptómy listov granátového jablka o 2-h,6-h,24-h a 72-h po MeJA alebo falošná liečba (každý s tromi biologickými replikátmi) boli analyzované (obr. S1). Pre každý transkriptóm s obsahom GC okolo 52 percent a hodnotami Q30 v rozmedzí od 91,6 do 95 percent sa získalo približne 55 miliónov čítaní nespracovaných sekvencií (2 x 150 bp párový koniec) (tabuľka S2). Pre všetky transkriptómy bolo viac ako 96 percent prečítaných vyčistených sekvencií mapovaných do referenčného genómu granátového jablka (Qin et al. 2017) (tabuľka S3). Väčšina zozbieraných transkriptov mala menej ako 1000 bp (34,3 percenta), 1000 bp— 2 000 bp (32,9 percenta) alebo 2 000 bp – 3 000 bp (18,1 percenta) (tabuľka S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, upravené P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),="" a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="" s1d).="" shikimate="" and="" ht="" pathway="" genes="" and="" ht="" metabolites="" were="" induced="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leave="" as="" revealed="" in="" the="" transcriptome="" and="" kegg="" pathway="" enrichment="" analysis,="" three="" shikimate="" biosynthetic="" path-way="" genes="" showed="" upregulated="" expression="" in="" meja-treated="" leaves="" relative="" to="" mock="" controls="" at="" 6-h,="" including="" 3-deoxy-d-arabinose-heptulosonate-7-phosphate="" synthase="" (dahps),="" 3-dehydrogenate="" synthase(dhs),="" and="" the="" bifunctional="" 3-dehydrogenate="" dehydratase/shikimate="" dehydrogenase="" (dhq/sdh;="" abbreviated="" as="" sdh)(figs.s1b="" and="" la).in="" particular,="" three="" isoforms="" of="" pomegranate="" sdhs="" were="" identified="" and="" showed="" differential="" expression="" in="" the="" transcriptome="" analysis,="" pgr020271,="" pgr019030,="" and="">

Aby sa zistilo, či zmeny v množstve transkriptov shikimátu a biosyntetických génov HT môžu ovplyvniť hladinu metabolitov odvodených z týchto dráh, fenolové metabolity sa extrahovali z listov zozbieraných o 24- h, 30- h. 36-h,48-h a 72-h po MeJA alebo simulovanej aplikácii a analyzované pomocou HPLC (obr. 2). Je potrebné poznamenať, že tieto časové body boli zvolené tak, aby zohľadňovali čas potrebný na syntézu proteínov a produkciu a akumuláciu metabolitov po pozorovaných zmenách expresie génov biosyntézy šikimátu a HT o 6- h. Retenčné časy a absorpčné spektrá dvoch metabolitov eluovaných po 4,57 min (vrchol 1) a 24,98 min (vrchol 2) sa zhodovali s časmi medziproduktov HT dráhy - glukogalínom a zliatinami Penta - glukózou (obr. la a 2a). Oba píky vykazovali významné zmeny v integrovaných oblastiach píkov vo viacerých časových bodoch (obr. 2b). Konkrétne sa vrchol 1 zvýšil v listoch ošetrených MeJA v porovnaní s falošnými kontrolami o 30- h, 36- h a 48- h (obr. 2b). Je zaujímavé, že vrchol 2 v listoch ošetrených MeJA spočiatku klesol o 24- h, ale následne sa zvýšil o 30- h a 36- h, než sa vrátil na úroveň podobnú falošným kontrolám o 48- h a 72-h (obr. 2b). Zníženie väčšiny flavonoidov a antokyanov, ako aj zvýšenie metylovaných flavónov a flavonolov, bolo zjavné v listoch granátového jablka ošetrených MeJA

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; Tabuľky S5 a S6). V prípade rozdielne akumulovaných metabolitov došlo k celkovému obohateniu metabolitov zapojených do sekundárneho/špecializovaného metabolizmu rastlín (67 zo 102), najmä fenolových zlúčenín (63 zo 102) (tabuľka S6).

Medzi fenolickými látkami bolo v listoch ošetrených MeJA zjavné zosúladené zníženie širokého spektra flavonoidov a antokyanov (42 zo 73 znížených zlúčenín) (obr. 3; tabuľka S6). Je zaujímavé, že tri mono- alebo di-O-metylované flavóny a flavonoly, vrátane di-O-metyl kvercetínu, chryzoberyl-O-hexozyl-O-hexozidu a predajného 5-O-hexozidu, sa zvýšili v listoch ošetrených MeJA (obr. 3; tabuľka S6). Niekoľko medziproduktov flavonoidových a antokyanových dráh, vrátane luteolínu, chryzoberylu, dihydrokaempferolu, dihydrokvercetínu, dihydromyricetínu, epikatechínu, delfinidínu a pelargonidínu, bolo detegovateľných, ale nevykazovali významné zmeny v listoch ošetrených MeJA (obr. 3; tabuľka S5). Hydroxycín-namoylové deriváty, izoflavóny a kumaríny boli medzi ďalšími fenolmi, ktoré vykazovali zníženú akumuláciu po indukcii MeJA (tabuľka S6). Naproti tomu dve fenolové kyseliny, 2,3-kyselina dihydroxybenzoová a kyselina protokatechuová (3,4-kyselina dihydroxybenzoová), a kumarín, 6-metylkumarín, boli v listoch ošetrených MeJA zvýšené (Tabuľka S6).

V súlade s do značnej miery redukovanými flavonoidmi a antokyanmi v listoch granátového jablka ošetrených MeJA, transkripty dvoch kľúčových enzýmov pre biosyntézu flavonoidov a antokyanov. CHS(Pgr005566) a CHI (Pgr025966) boli významne znížené v 6-h a 24-h po aplikácii MeJA podľa analýzy transkriptómu (obr. 4). Uskutočnila sa analýza qPCR v reálnom čase, aby sa preskúmala expresia CHS a CHI s ďalšími časovými bodmi vrátane 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h,48-h a 72-h (obr. 4). Transkripty CHS klesli v listoch ošetrených MeJA o 3-h a zostali výrazne nižšie ako v prípade falošných kontroly do 72-h, s najväčším poklesom o 12-h. Na rozdiel od toho, zníženie expresie CHI bolo významné len po 24- h, 48- h a 72- h po liečbe MeJA (obr. 4).

Tento článok je prevzatý z Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9