Hodnotenie intestinálneho transportu extraktu bohatého na fenyletanoidné glykozidy z Cistanche Deserticola cez model monovrstvy Caco-2 buniek

Úvod

Bunková línia Caco{0}}, ktorá bola odvodená z ľudských adenokarcinómov hrubého čreva, vykazuje vlastnosti podobné enterocytom. Za normálnych podmienok sa Caco-2 bunky spontánne diferencujú od zrelých buniek a tvoria intaktné monovrstvy [1]. Susedné bunky adherujú prostredníctvom tesných spojení vytvorených na apikálnej strane monovrstvy, ktoré môžu rozlišovať pasívne a aktívne transportované liečivá cez epitelovú vrstvu [2]. Vzhľadom na morfologickú a biochemickú podobnosť s normálnymi enterocytmi slúžia monovrstvy Caco{5}} buniek ako dobre akceptovaný in vitro model na štúdium intestinálneho absorpčného potenciálu a transportných charakteristík liečiv [3, 4].

Na rozdiel od chemikálií sú rastlinné extrakty (PE) zmesi, ktorých biologická aktivita a aktívne zložky často nie sú dobre identifikované [5]. Okrem toho vlastnosti črevného transportu PE, na rozdiel od vlastností jeho zložiek, úzko súvisia s klinickým použitím. Merania toku testovanej vzorky cez monovrstvu Caco{1}} buniek bežne zahŕňajú chemické metódy, ako je HPLC, LC/MS atď. Hoci sú tieto metódy výkonnými nástrojmi, sú zložité, časovo náročné, drahé a vyžadujú sofistikované vybavenie. Ešte dôležitejšie je, že ani jedna ani menšinová zložka nemôže odrážať PE ako celok. Preto je potrebné zaviesť nový prístup nezávislý od určenia zložiek na identifikáciu a vyhodnotenie transportných charakteristík PE.

Cistanche deserticola YC Ma (CD), holoparazitická rastlina, je bežná tradičná čínska medicína používaná najmä na liečbu nedostatku obličiek, telesnej slabosti a zápchy a tieto použitia boli oficiálne zaznamenané v Čínskom liekopise [6]. Fenyletanoidové glykozidy (PhGs), vrátaneechinakozid (EC), akteozid (AC) a izoakteozid(IS) atď., sú triedou polyfenolových zlúčenín [7]. Sú považované za jedny z hlavnýchbioaktívne zložky druhov Cistanche[8]. Farmakologické štúdie ukázali, že bioaktivita PhGs je rôznorodá a zahŕňa antioxidačné [9], proti únave [10], hepatoprotektívne [11], imunomodulačné [12], protizápalové [7, 13] a neuroprotektívne účinky [ 14]. Charakteristiky črevného transportu PhG však neboli skúmané. V tejto štúdii sme skúmaličrevnú permeabilitu extraktu bohatého na PhG (PRE) z CDako integrovaný systém a priepustnosť troch hlavných PhG (AC, IS a EC) v diferencovaných Caco-2 bunkách. Naše výsledky ukázali, že PRE sa primárne transportuje prostredníctvom zle absorbovanej pasívnej difúzie po koncentračnom gradiente bez efluxu, čo poskytuje farmakokinetický základ pre klinickú aplikáciu PhG v CD.

PRÍRODNÉ BYLINKY CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiály a metódy

Materiály

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98 %) bolo zakúpených od spoločnosti Must Biotechnology Co. (Chengdu, Čína). Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM), fetálne bovinné sérum (FBS) a neesenciálne aminokyseliny (NEAA) boli vyrobené spoločnosťou Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). 6-jamkové doštičky TranswellTM (plocha rastu membrány 4,67 cm2) boli získané od Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA). Kolagén z potkaních chvostov bol získaný od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Všetky činidlá a chemikálie pre HPLC analýzu boli analytickej kvality.

Príprava PRE z CD

Vzduchom vysušený CD materiál sa rozprášil a extrahoval perkoláciou 70 % etanolom. Frakcia bohatá na PhG sa pripravila tak, ako bolo opísané vyššie [10] a extrahovala sa vodou nasýteným n-butylalkoholom. Extrakt sa skoncentroval a vysušil za zníženého tlaku. Makroporézna živica-UV spektrofotometria [15] namerala obsah PhG 78,4 %. Konečná vzorka predstavovala 1,75 % výťažok suroviny na suchú hmotnosť. Získaná vzorka sa skladovala pri -20 stupňoch až do ďalšieho použitia.

Stanovenie AC, IS a EC pomocou HPLC

Na testovanie obsahu AC, IS a EC v PRE sa použil systém Shimadzu HPLC vybavený softvérom LC roztoku. Použila sa kolóna Intersil C18 s reverznou fázou (4,6 mm x 25 0 mm, 5 μm) a udržiavala sa pri teplote miestnosti. Mobilnými fázami boli acetonitril a voda obsahujúca 0,1 % kyselinu fosforečnú (v/v) s gradientovou elúciou (tabuľka 1) pri prietoku 1,0 ml/min. Detektor UV spektrofotometra bol nastavený na 334 nm. Na presné určenie toku AC a IS sme vyvinuli novú metódu HPLC-fluorescenčnej detekcie (HPLC-FLD). Po štruktúrnej analýze a fluorescenčnom skenovaní vlnovej dĺžky (údaje nie sú uvedené) sme získali optimálne podmienky fluorescenčnej detekcie pre AC (Ex: 338 nm, Em: 448 nm) a IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm).

Analytická metóda HPLC bola validovaná pomocou nasledujúcich výkonnostných charakteristík: stabilita, linearita, citlivosť, presnosť (vnútrodenná a medzidenná variabilita) a presnosť. Analyty v transportnom pufri sa skladovali pri 25 stupňoch v tme počas 24 hodín a merala sa ich stabilita. Analyty boli vysoko stabilné v prítomnosti vitamínu C (0,4 %), pretože hodnoty relatívnej štandardnej odchýlky (RSD) v oblastiach píkov boli < 3,5 %. Rovnica lineárnej regresie, korelačný koeficient, rozsah linearity, LOD a LOQ pre AC, IS a EC sú uvedené v tabuľke 2. Hodnoty LOD (18–30 nM) a LOQ (60–100 nM) Hodnoty ukazujú, že metódy HPLC-FLD a HPLC-UV sú vysoko citlivé. Hodnoty RSD, ktoré vyjadrujú presnosť metódy, boli všetky < 2 % pre intra- a inter-dennú variabilitu, čo naznačuje dobrú presnosť. Na vyhodnotenie regenerácie sa do transportného pufra pridali AC, IS a EC, čím sa získali tri (vysoké, stredné a nízke) úrovne koncentrácie. Hodnoty výťažnosti metódy pre analyty sú zhrnuté v tabuľke 3. Priemerné výťažky sa pohybovali od 90,0 % do 96,4 %, čo naznačuje dobrú presnosť. Záverom možno povedať, že zavedené metódy HPLC sú uspokojivé, pokiaľ ide o linearitu, citlivosť, presnosť a presnosť na kvantifikáciu AC, IS a EC v transportnom pufri.

PRÍRODNÝ EXTRAKT CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Stanovenie PRE systémom biotestov

Biologický test (celková antioxidačná kapacita) bol založený na teste FRAP (železitá redukujúca/antioxidačná sila), ktorý sme už opísali [16] a validovaný z hľadiska linearity a presnosti (vnútrodenná a medzidenná variabilita). Linearita metódy biotestu bola stanovená na základe kalibračných kriviek. Koncentračný rozsah linearity bol 0.{16}}625 − 40 ug/ml (y=0,0258x+0,0968, R2=0,996). Presnosť zavedenej metódy biologického testu bola stanovená z hľadiska intra- a inter-dennej variability pre analýzu PRE (10,0 ug/ml). Vnútrodenná opakovateľnosť metódy bola stanovená na základe piatich po sebe nasledujúcich stanovení v ten istý deň. Medzidenná opakovateľnosť bola meraná na základe piatich po sebe idúcich stanovení v troch rôznych dňoch. Hodnoty RSD pre presnosť metódy boli 1,014 % a 4,72 % pre vnútrodennú a medzidennú variabilitu, čo naznačuje dobrú presnosť. Zavedená metóda biologického testu je teda uspokojivá, pokiaľ ide o linearitu, presnosť a presnosť na kvantifikáciu PRE v transportnom pufri.

Bunková kultúra

Bunky Caco{0}} sa kultivovali pri 37 stupňoch a 95 % relatívnej vlhkosti v atmosfére obsahujúcej 5 % CO2 a médium pozostávajúce z DMEM, 10 % FBS, 1 % NEAA, 1 % L-glutamínu, penicilínu (100 U/ml) a streptomycín (100 ug/ml). Médium sa menilo každý druhý deň počas bunkového rastu a diferenciácie. Bunky rástli v 75- cm2 plastových fľašiach a zbierali sa každých 3 až 5 dní s 0,05 % EDTA-trypsínom. Pre transportné experimenty boli bunky nasadené v hustote 1 x 105 buniek/cm2 na vložky Transwell potiahnuté kolagénom. Približne 21 dní po nasadení sa monovrstvy použili na transportné experimenty. Ich integrita bola stanovená meraním transepiteliálneho elektrického odporu (TEER) naprieč monovrstvami pomocou EVOM vybaveného ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., USA). Hodnoty TEER monovrstvy buniek Caco-2 museli prekročiť 500 O∙cm2.

Transportné experimenty

Monovrstva sa premyla transportným tlmivým roztokom (P-tlmivý roztok obsahujúci 10 mM HEPES, 1 mM pyruvát sodný, 10 mM glukózu, 3 mM CaCl2 a 145 mM NaCI, pH 7,4) a potom sa preinkubovala 20 minút pri 37 stupňoch. Po odstránení transportného tlmivého roztoku sa čerstvý transportný tlmivý roztok obsahujúci testované vzorky pridal do apikálnej (AP) komory (1,5 ml) v AP až bazolaterálnych (BL) smerových štúdiách alebo do BL komôrky (2,5 ml) v BL na AP smerových štúdiách. Pre AC, IS a EC testy s použitím HPLC sa alikvót (300 ul) odoberal z každej prijímacej komory v rôznych časových intervaloch (30, 60, 90 a 120 minút). Prijímacia komora bola doplnená rovnakým objemom čerstvého predhriateho (37 stupňov) transportného pufra po každom odbere vzoriek. Zozbierané vzorky sa skladovali pri teplote -20 stupňov na ďalšie použitie. Na stanovenie PRE pomocou biologického testu sa odobrali iba vzorky po 120 minútach. V dôsledku nestability PRE, AC, IS a EC bolo 0,4 % (w/v) vitamínu C

pridaný na stabilizáciu vzoriek na stanovenie obsahu AC, IS a EC pomocou HPLC a vzorky na biotest PRE sa testovali ihneď po odbere vzoriek. Vypočítala sa hodnota koeficientu zdanlivej permeability (Papp alebo 'Papp) každej vzorky.

Analýza dát

Hodnoty Papp v smeroch AP BL alebo BLAP AC, IS a EC boli vypočítané na základe nasledujúcej rovnice: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), kde Papp je koeficient zdanlivej permeability (cm/s) stanovený pomocou HPLC. (4Q/4t) je rýchlosť objavenia sa testovanej zlúčeniny (AC, IS alebo EC) na strane prijímača (μmol/s); A je plocha povrchu vložky (cm2); CO je počiatočná koncentrácia testovanej zlúčeniny na strane darcu (μmol/ml). Konkrétne sa pri výpočte hodnôt 'Papp' použila jednotka hmotnosti "ug" namiesto "μmol". Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD.

Výsledky

Zloženie AC, IS a EC v PRE z CD

Pretože AC, IS a EC sa považujú za hlavné bioaktívne látkyPhG druhov Cistanche[8] sme ich obsah v PRE analyzovali pomocou HPLC-UV. Reprezentatívny chromatogram je znázornený na obr. 1. Identifikácia týchto zložiek bola založená na porovnaní retenčných časov a UV spektra s retenčnými časmi autentických štandardov pri vlnovej dĺžke 334 nm. Obsah AC, IS a EC v PRE bol 26,60 %, 1,84 % a 32,83 %. Tieto tri zlúčeniny teda predstavujú 61,27 % PRE; ďalej uvedené výsledky ukazujú, že obsah PhG v PRE je 78,4 %. Preto AC, IS a EC predstavujú približne 80 % PhG v PRE.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE FUNKCIE OBLIČIEK PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Celkové antioxidačné kapacity PRE, AC, IS a EC

Boli publikované štúdie antioxidačnej aktivity PhG z CD [9] a AC, IS a EC predstavujú približne 80 % PhG v PRE. Celkové antioxidačné kapacity PRE, AC, IS a EC boli teda testované a vyjadrené pomocou hodnôt FRAP (× 10–6 mmol). Ako je znázornené na obr. 2, keď hodnota FRAP bola 8 × 10–6 mmol, konečné koncentrácie PRE, AC, IS a EC boli 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml a 4,89 ug. /ml, v tomto poradí, čo naznačuje, že celková antioxidačná kapacita týchto štyroch vzoriek bola hodnotená nasledovne: AC > EC > PRE > IS. Bioaktivita PRE sa pripisuje skupinám aktívnych zložiek (AIG). Pre približne 60 % PRE, AC a EC vykazovali silnejšiu celkovú antioxidačnú aktivitu ako PRE a IS. Pretože IS (1,84 %) predstavuje veľmi malú časť PRE, ostatné zložky, ako napríklad slabo antioxidačný IS, sú tiež jasne aktívne v PRE. Prekvapivo sa celková antioxidačná aktivita medzi AC a jeho izomérom IS líšila takmer 7-krát, čo naznačuje, že nielen počet fenolických hydroxylových skupín [9], ale aj poloha fenolických hydroxylových skupín v molekule ovplyvnili antioxidačný účinok.

Overenie monovrstiev Caco{0}}

Na overenie systému monovrstvy buniek Caco{0}} boli hodnoty Papp pre propranolol (dobre transportovaný marker) a Lucifer yellow (zle transportovaný marker) z AP do BL cez monovrstvy Caco{2}} stanovené ako 1,51 × 10–5 cm/sa 2,8 × 10–7 cm/s, v uvedenom poradí, a tieto hodnoty súhlasili s hodnotami publikovanými v predchádzajúcich správach [17, 18]. Test aktivity alkalickej fosfatázy tiež potvrdil, že monovrstvy buniek Caco-2 boli kvalitatívne porovnateľné s epitelom tenkého čreva [19].

Priepustnosť AC, IS a EC

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), zatiaľ čo hodnoty slabo absorbovaných liekov boli nízke (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2 [20]. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

Priepustnosť PRE

Vyššie uvedené výsledky naznačujú, že celková antioxidačná kapacita PRE je spôsobená minimálne 61,27 % AIG z PRE. Hodnotili sme teda TR PRE na základe jeho krivky koncentrácia-účinok celkovej antioxidačnej kapacity a vypočítali sme hodnoty Papp, aby odrážali transportné charakteristiky PRE. 'Papp hodnoty PRE pre AP!BL a BL!AP boli (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/sa (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, čo naznačuje, že táto zlúčenina bola slabo priepustná. Okrem toho eflux alebo aktívny transport neboli evidentné, pretože pomer „Papp BL k AP / „Papp AP k BL pre PRE bol 1,45 [20]. Okrem toho sa obojsmerný TR PRE zvyšoval lineárne medzi približne 300 a 900 ug/ml (obr. 5). Nedostatok smerovej preferencie výsledkov naznačuje, že pasívna difúzia je hlavným transportným mechanizmom PRE.

Diskusia

V porovnaní s vysoko purifikovanými liečivými produktmi sú PE vo všeobecnosti zmesi, ktoré pozostávajú zo stoviek zložiek s veľmi odlišnými fyzikálno-chemickými vlastnosťami. Preto PE vykazuje systematické, viaccieľové a viackanálové synergické pôsobenie v dôsledku ich komplexného AIG [21], čo bráni analýze transportných charakteristík PE. Aby sa transportné vlastnosti PE zhodnotili vedeckejšie, niektorí výskumníci identifikovali v PE viacero zložiek, a nie jednu zložku [22–24]. Obmedzený počet zložiek však nemôže odrážať PE ako celok. Určenie všetkých zložiek v PE je však nemožné. Navyše, ak rôzne komponenty v PE vykazujú úplne odlišné transportné charakteristiky, holistické transportné charakteristiky PE bude ťažké identifikovať.

V deväťdesiatych rokoch sa na hodnotenie TR antimikrobiálnych látok použili systémy biotestov [25]. Do roku 2005 Eguchi a jeho kolegovia [26] vyhodnotili antioxidačnú aktivitu mrkvového extraktu pomocou BL média z diferencovaných Caco-2 buniek; tento prístup je vhodnejší na zohľadnenie situácií in vivo.

Na základe predchádzajúcej správy o aktivite PhGs [9] a našich výsledkov (obr. 2) možno TR AIG v PRE vyhodnotiť stanovením celkovej antioxidačnej kapacity média v prijímacej komore. Po transportných experimentoch sme zistili, že TR PRE bol podobný v oboch smeroch a tento transport bol nenasýtený a slabo absorbovaný ('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s) [3] a neindikoval eflux, čo naznačuje, že pasívna difúzia po koncentračnom gradiente je hlavným transportným mechanizmom PRE (obr. 5). Okrem toho, transportné charakteristiky PRE sú konzistentné s charakteristikami AC, IS a EC, účinných zložiek, ktoré vykazujú antioxidačnú aktivitu v PRE (obr. 4 a tabuľka 4). Tento výsledok sa očakával a naznačil, že súčasný systém biotestov je vhodný a spoľahlivý na vyhodnotenie transportných charakteristík AIG v PRE v diferencovaných Caco{12}} bunkách.

Na rozdiel od kanonickej hodnoty Papp, ktorá sa bežne používa na vyjadrenie transportu jednej zlúčeniny, „hodnota Papp získaná z TR na základe krivky koncentrácie a účinku nemusí odrážať len zložky, ktoré prenikajú cez monovrstvy s neporušenou štruktúrou, ale zahŕňajú aj ďalšie faktory súvisiace s cieľovou aktivitou, ako sú metabolity zložiek, chemicky degradované produkty a dokonca aj niektoré cytokíny vylučované z buniek Caco{1}} v reakcii na stimuláciu, ktorá môže ovplyvniť cieľovú biologickú aktivitu. Hodnotu „Papp“ teda určuje skôr uvedený multifaktor než len transportované neporušené komponenty. Preto môže Papp silnejšie korelovať so situáciami in vivo ako kanonická hodnota Papp [26]. V tejto štúdii sme objasnili pasívne rozptýlenú a slabo absorbovanú povahu PRE na základe jej „hodnoty Papp“ a táto povaha môže súvisieť s vysokým dávkovaním a dlhým obdobím klinickej liečby CD [27]. Tieto zistenia však poskytnú systematickejšie usmernenie pre lekárov pri aplikácii CD, keď boli identifikované iba transportné charakteristiky väčšiny AIG v CD, nielen PhG.

PRÍRODNÝ EXTRAKT CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Vybraná položka bioaktivity však musí byť dostatočne citlivá, aby bola detegovaná v médiu prijímacej komory, čo predstavuje výzvu na vytvorenie systému biologického testu na vyhodnotenie transportných charakteristík PE. Okrem toho by biologická aktivita mala závisieť od čo najväčšieho počtu zložiek. V našej štúdii bol test celkovej antioxidačnej kapacity vhodnejší ako niekoľko iných metód (obr. S1). Ale aj tak môže náš test detegovať TR PRE pri 120 minútach.

Súhrnne táto štúdia vytvorila nový systém biologických testov na vyhodnotenie intestinálnej permeability PRE v diferencovaných Caco{0}} bunkách. Získané výsledky ukázali, že slabo absorbovaná pasívna difúzia po koncentračnom gradiente bez efluxu je hlavným transportným mechanizmom PRE (obr. 5), ktorý poskytuje farmakokinetický základ pre klinickú aplikáciu PhG pri CD. Použitie nového systému biologických testov na vyhodnotenie TR a tým na výpočet „hodnot Papp na posúdenievlastnosť transportu črievAIG v PE je možné. Tento prístup môže byť vhodný aj pre inú PE za predpokladu vhodnej bioaktivity.