Hodnotenie perorálne podávaného aerogélu alginátu vápenatého na zmeny črevnej mikrobioty a funkcie pečene a obličiek potkanov Wistar

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

Mohammad AA Al-Najjar a kol

Abstraktné

Táto štúdia hodnotí účinok aerogélu alginátu vápenatého ako potenciálneho nosiča liečiva na pečeň afunkcie obličieka na črevnú mikroflóru potkanov Wistar. Štúdie alginátového aerogélu boli pripravené vo forme nanočastíc pomocou techniky tryskového rezania a boli charakterizované z hľadiska špecifických povrchových plôch, vonkajšej morfológie a distribúcie veľkosti častíc. Na in vivo štúdiu sa aerogél alginátu vápenatého podával orálne a pečeň afunkcie obličiekboli testované počas jedného týždňa a počas štyroch týždňov v dvoch odlišných štúdiách. Počas krátkodobej štúdie in vivo sa odobrali vzorky výkalov na extrakciu bakteriálnej DNA, po ktorej nasledovali analýzy sekvenovania génu 16S rRNA na detekciu zmien v črevnej mikroflóre. Výsledky ukázali, že pripravený alginátový aerogél má priemernú BET-špecifickú plochu povrchu okolo 540 m2/g, s objemom pórov 7,4 cm3/g a šírkou pórov 30–50 nm. Štúdia in vivo odhalila, že hladiny študovanýchobličkya pečeňové enzýmy neprekročili najvyššiu hladinu normálneho rozmedzia. Štúdia črevnej mikrobioty ukázala rôzne vzory; určité skupiny baktérií, ako sú Clostridia a Bacteriodia, sa zvýšili počasaerogélyrežimu a po vysadení aerogélu sa naďalej zvyšovali. Zatiaľ čo iné skupiny, ako napríklad Erysipelotrichia a baktérie Candidatus Sacha, sa v priebehu zvýšiliaerogélyliečby a potom sa po mesiaci opäť znížila. Členovia triedy Bacilli vykazovali jedinečný trend, to znamená, že po tom, čo boli najpočetnejšou skupinou (63 percent ) v čase 0, ich relatívna abundancia dramaticky klesala, až kým nedosiahla < 5="" percent;="" čo="" bolo="" aj="" po="" ukončení="" liečby="">

Cistanchetubulosa zabraňujeobličkychoroba,cistanche vedľajšie účinky,klik.

Úvod

Aerogélyterminológiu prvýkrát objavil v roku 1931 Samuel Kistler, ktorý ich definoval ako materiály, ktoré si zachovávajú svoju pórovitú a sieťovú štruktúru neporušenú pri výmene ich pórovej kvapaliny plynom [1]. Po 60 rokoch od ich objavenia organickéaerogélyboli navrhnuté pre biomedicínske aplikácie a aplikácie na dodávanie liekov kvôli ich veľkému vnútornému povrchu a štruktúre otvorených pórov [2]. Vynikajúce vlastnosti tejto triedy materiálov umožňujú nielen zvýšiť účinnosť zaťaženia, ale aj zlepšiť biologickú dostupnosť, stabilitu a kinetiku uvoľňovania nabitých molekúl

Výskum naaerogélyna perorálne podávanie liečiv sa pôvodne zameriavalo na použitie oxidu kremičitéhoaerogélypre ich flexibilnú a dobre známu sol-gélovú chémiu, ako aj možnosti derivatizácie [3]. Napriek tomu použitie aerogélov oxidu kremičitého vo farmaceutických prostriedkoch určených na orálne podávanie stále vyvoláva určité obavy z dôvodu ich obmedzenej biologickej odbúrateľnosti. Preto vzniká ďalšia potreba vyvinúť aerogélový nosič, ktorý je biokompatibilný aj biodegradovateľný. To je možné dosiahnuť použitím prírodných organických materiálov alebo biodegradovateľných polymérov, ako je alginát [4] kyselina hyalurónová [5], chitosan, celulóza [6] a proteíny [7].

Alginát (Alg), extrahovaný z hnedých rias, je lineárny kopolymér zložený z monomérov ß-1,4-kyseliny D-manurónovej a kyseliny -L-gulurónovej, ktoré sú rozptýlené homogénnymi alebo heterogénnymi blokovými vzormi. . Algináty sa používajú v potravinárskom a farmaceutickom priemysle, pretože sú netoxické, lacné, biologicky odbúrateľné a biokompatibilné [8, 9]. Polyvalentné katióny, ako je Ca2plus, Ba2plus alebo Sr2plus, môžu indukovať iónové zosieťovanie Alg, transformujúc ho z rozpustnej na nerozpustnú (gélovú) formu.

Alg sa široko používa v potravinárskych výrobkoch a ako farmaceutická prísada, ako je gélovacie činidlo a dezintegračné činidlo na tablety [10, 11]. Používa sa aj v biomedicínskych aplikáciách vrátane dodávania liekov a tkanivového inžinierstva [12]. Rovnako ako ostatné jedlé potravinové vlákniny, Alg a jeho oligomérne deriváty sú odolné voči tráveniu ľudskými endogénnymi enzýmami. Ľudská črevná mikroflóra ho však môže významne stráviť [13]. Napriek jej dôležitosti je málo známe o črevnej mikroflóre, ktorá je zodpovedná za degradáciu Alg.

Európsky úrad pre bezpečnosť potravín (EFSA) deklaroval bezpečnosť kyseliny algínovej a jej solí, ako aj produktov ich fermentácie. In vivo testy absorpcie a vylučovania vodných roztokov a suspenzií kyseliny algínovej a jej solí na zvieratách ukázali, že nie sú schopné absorbovať alebo metabolizovať enzýmy prítomné v gastrointestinálnom trakte bez ohľadu na formu použitú počas podávania. Boli by však čiastočne degradované fermentáciou počas prechodu cez hrubé črevo pôsobením anaeróbnej črevnej mikroflóry, čo by spôsobilo zväčšenie slepého čreva, čo EFSA považoval za adaptačný proces súvisiaci s vysokými dávkami testovanými ako potravinové prísady [14]. . Napriek tomu žiadna predchádzajúca štúdia in vivo neskúmala účinok alginátu vápenatého (Ca-Alg) vo forme aerogélu napečeň, obličky,alebo bakteriálne spoločenstvo v črevách.

Črevná mikroflóra je nevyhnutnou zložkou tráviaceho systému človeka, pretože pomáha pri degradácii prijímanej potravy, najmä takej, na ktorú ľudské telo nemá potrebné enzýmy [15, 16]. Črevná mikroflóra môže tiež inhibovať kvitnutie patogénnych mikroorganizmov tým, že s nimi súťaží o zdroje živín alebo produkciou chemických látok, ktoré inhibujú ich rast. Ukázalo sa však, že k degradácii požitej stráviteľnej vlákniny, ako je Alg, dochádza najmä fermentovanými baktériami v hrubom čreve [17]. Produktom tohto procesu sú mastné kyseliny s krátkym reťazcom (SCFA), ktoré sú prospešné pri zápaloch hrubého čreva a pôsobia protirakovinovo. Brownlee a kol. uviedli, že inkubácia Alg a ľudskej fekálnej mikroflóry preukázala, že väčšina degradácie Alg je sprevádzaná zmenou črevnej mikroflóry. Takáto inkubácia tiež vedie k produkcii SCFA a plynu po 24 hodinách [17].

Materiály a metódy

Materiály

Sodnú soľ kyseliny algínovej dodala BASF, Nemecko. Chlorid vápenatý (CaCl2) bol zakúpený od Th. Geyer GmbH & Co. KG, Nemecko. Oxid uhličitý (čistota 99,5 percenta) dodal Praxair (Nemecko), etanol 99,8 percent získal od Carl Roth (Nemecko). Všetky chemikálie boli použité tak, ako boli dodané. Komerčné diagnostické súpravy boli použité na meranie ALP a súpravy kreatinínu boli zakúpené od Biostsystems SA, Španielsko. MO BIO'S PowerMax SoilDNA Isolation Kit bola zakúpená od MO BIO Laboratories, USA. Počas štúdie bola použitá deionizovaná voda.

Metódy

Príprava aerogélových častíc.

Prvým krokom pri príprave aerogélových častíc bola príprava zásobného roztoku; na to sa prášok alginátu sodného (Alg) pridal do destilovanej vody v koncentrácii 1 % hmotn. a udržiaval sa za miešania magnetickým miešadlom cez noc pri teplote miestnosti. Na prípravu hydrogélových častíc sa použil prístup opísaný v Preibisch et al. [18] bol sledovaný pomocou Jet Cutter Type S od genia Lab, Braunschweig (Nemecko). V procese tryskového rezania bol alginátový roztok vytlačený cez dýzu (priemer 350 μm) stlačeným vzduchom (1–3 bar), aby sa vytvoril prúd (hmotnostný prietok 1 g/s). Prúd bol rozrezaný na samostatné častice pomocou rotujúceho kotúča (40 drôtov s priemerom drôtu rezacích kotúčov 100 μm, pomer valcov 5). Po prechode cez disk padol roztok polyméru smerom nadol do gélovacieho kúpeľa s roztokom CaCl2 5 g/l. Aby sa zabránilo aglomerácii gélových častíc, objem gélovacieho kúpeľa bol aspoň štvornásobok celkového objemu spracovaného roztoku biopolyméru a obsah kúpeľa sa miešal magnetickou tyčinkou (60 otáčok za minútu). Oddeľovacia vzdialenosť medzi dýzou a gélovacím kúpeľom bola udržiavaná na 50–70 cm. Po zozbieraní gélových častíc sa v miešaní pokračovalo počas 60 minút, aby sa zabezpečilo úplné zgélovatenie a aby sa zabránilo aglomerácii. Gélové častice sa potom oddelili z gélovacieho kúpeľa filtráciou a pokračovali výmenou rozpúšťadla.

Výmena rozpúšťadla (voda za etanol) sa uskutočňovala na zozbieraných časticiach postupne (30, 60, 90, 100 percent v/v etanolu). Aby sa zabezpečila úplná výmena, merala sa hustota namáčacej kvapaliny po poslednom kroku výmeny rozpúšťadla pomocou hustomera (DMA4500, Anton PaarCompany, Rakúsko). Hustota sa potom prepočítala na obsah etanolu. Výsledné častice alkogélu boli nakoniec zabalené do filtračného papiera a vysušené superkritickým CO2 v autokláve pri konštantnej teplote 50 °C a tlaku 120 barov. Nastavil sa kontinuálny prietok CO2 (20–80 g/min), kým sa neuskutočnila úplná extrakcia etanolu (2–4 hodiny). Potom sa vykonalo pomalé odtlakovanie autoklávu (1–3 bar/min). Po dosiahnutí okolitého tlaku sa autokláv otvoril a aerogélové mikroguľôčky alginátu vápenatého (ďalej označovaného ako Ca-Alg) sa zozbierali a skladovali v dobre utesnených nádobách za sucha.

Charakterizácia častíc aerogélu

špecifické plochy povrchu aerogélových častíc sa merali pomocou nízkoteplotnej adsorpcie/desorpcie dusíka (BET) (Quantachrome Nova 3000e, Odelzhausen, Nemecko a Micromeritics TriStar II 3020, Nemecko). Pred meraním sa vzorky sušili 20 °C vo vákuu (< 1="" mpa)="" at="">

Skúmanie vonkajšej morfológie pripravených aerogélových častíc sa uskutočnilo pomocou analýzy rastrovacím elektrónovým mikroskopom (SEM) (Zeiss Supra VP55, Jena, Nemecko) pri akceleračnom napätí 3 kV a pracovnej vzdialenosti 9.0– 9,4 mm. Vzorky boli pred snímkovaním nastriekané zlatom (hrúbka 10 nm), aby sa minimalizovalo nabíjanie a zlepšil sa kontrast obrazu.

Merania distribúcie veľkosti častíc sa uskutočňovali trikrát pre každú vzorku pozostávajúcu z približne 10,000 častíc. Dynamická analýza obrazu sa uskutočnila pomocou aCamsizer XT s modulom X-Jet (Retsch GmbH, Nemecko) so vzduchom stlačeným na 50 kPa.

Štúdie funkcie pečene a obličiek a črevnej mikroflóry

Uskutočnila sa pilotná štúdia na malom počte zvierat rozdelených do rôznych skupín, aby sa pokryli štyri úrovne dávok ošetrovaných látok. Uskutočnila sa krátkodobo (1 týždeň), aby sa zistila maximálna možná dávka Ca-Alg aerogélov, ktorá nemá žiadne významné účinky na funkcie obličiek alebo pečene a ktorá nevykazuje známky chorobnosti alebo mortality. Dávky boli starostlivo vybrané s ohľadom na hlásené perorálne LD50 alginátu (viac ako 5,000 mg/kg telesnej hmotnosti) [19]. Avšak maximálna možná dávka dosiahnutá pri minimálnom rozrušení zvieraťa bola 2,000 mg/kg telesnej hmotnosti.

V druhej časti štúdie boli zvieratá vystavené fixnej ​​dávke počas dvoch týždňov. Čo sa týka vekových a hmotnostných variácií a podmienok chovu počas tejto štúdie, boli dodržané usmernenia Organizácie pre hospodársku spoluprácu a rozvoj (OECD) (kód č. 206). Všetky experimentálne protokoly boli schválené etickou komisiou (IRB, číslo schválenia: 2019-PHA-12, priložené v súbore S1) súkromnej univerzity aplikovanej vedy (ASU), Jordánsko. Všetci zamestnanci zvernice v ASU sú dobre vyškolení na sledovanie akýchkoľvek zmien, ktoré by sa mohli u zvieraťa vyskytnúť v dôsledku zásahu. Konkrétne sledujú parametre ako zmeny hmotnosti, abnormálne správanie, naježená srsť, znížená pohyblivosť, držanie tela alebo expresia špecifických markerov telesných tekutín. V prípade akýchkoľvek závažných abnormálnych zmien v stave zvieraťa môžu použiť protokol humánneho koncového bodu, ktorý je schválený etickou komisiou pri ASU. Na konci experimentov boli potkany usmrtené vykrvácaním v celkovej anestézii s použitím 2,5 % tiopentalu sodného (Abbott Laboratories, North Point, Hong Kong) v dávke 20 mg/kg intravenózne.

Zviera

V krátkodobých aj dlhodobých štúdiách in vivo boli desaťtýždňové zdravé potkany Wistar s priemernou hmotnosťou 240 ± 37 g chované pri teplote 21 – 23 ˚C a vlhkosti 35 až 70 percent. v kontrolovaných miestnostiach s cyklom 12 h svetlo – 12 h tma. Potkany boli identifikované a umiestnené jednotlivo do klietok s priehľadnými stenami, aby sa uľahčilo pozorovanie bez narušenia ich správania. Ako podstielka boli použité drevené hobliny. Potkany boli kŕmené komerčne dostupnou stravou (kliešte Local Sup, Jordánsko) a voľne bola ponúkaná sladká voda.

Počet potkanov na skupinu v rôznych experimentoch sa vybral podľa predtým publikovanej práce (príklady; [20–22]) a v závislosti od prísnych predpisov o „starostlivosti o zvieratá a ich používaní“ na národnej a medzinárodnej úrovni, ktoré kladú dôraz na minimalizáciu počet zvierat použitých vo výskumných štúdiách. Patria sem okrem iného „Program starostlivosti o zvieratá a ich používanie“ na Kalifornskej univerzite v Berkeley (https://acuc.berkeley.edu/about.html) a nórske usmernenia pre používanie zvierat (https:// www.forskningsetikk.no/en/guidelines/ science-and-technology/ethical-guidelines-for-the-use-of-animals-in-research/).

Pilotná štúdia in vivo (7 dní opakované dávky)

Opakovaná perorálna dávka počas jedného týždňa sa uskutočnila na definovanie maximálnej možnej dávky aerogélov demonštrujúcej bezpečnosť u potkanov Wistar. Ca-Alg aerogél sa podával orálne v štyroch dávkových hladinách 50, 100, 250 a 500 mg, čo zodpovedá priemernej dávke 200, 400,1000 a 2000 mg/kg (hmotnosť telesnej hmotnosti). Výsledky boli porovnané s dvomi pozitívnymi kontrolnými skupinami, ktorým bolo podaných 50 a 500 mg nedotknutého alginátu sodného (Na-Alg), čo zodpovedá priemerným úrovniam dávok 200 a 2000 mg/kg telesnej hmotnosti. Nakoniec boli všetky predchádzajúce skupiny ošetrenia aerogélom Ca-Alg a Na-Alg odkázané na kontrolnú skupinu (placebo). Posledná skupina dostala fosfátový pufor v dávke ekvivalentnej maximálnej dávke, keď sa podával ako vehikulum pre testované látky. Kontrolná a liečebná skupina pre pilotnú štúdiu pozostávala zo 4 potkanov/skupina (dve samice a dvaja samci/skupina). Pevné prášky aerogélu Ca-Alg a Na-Alg boli suspendované vo fosfátovom tlmivom roztoku (pH 7,4) a dobre premiešané priamo pred orálnym podaním, pretože potkany ich odmietali jesť v suchom stave. Vo všetkých skupinách sa podávanie potkanom začalo každý deň v rovnakom čase pomocou orálnej sondy.

Štúdia dlhodobej expozície in vivo (15-dňová štúdia s opakovanou dávkou)

Na základe výsledkov z predchádzajúcej časti sa vybrala dávka 250 mg aerogélu Ca-Alg, aby sa ďalej hodnotila v štúdii dlhodobej (15-dňovej) expozície U potkanov Wistar sa pozorovali akékoľvek okamžité alebo oneskorené nežiaduce účinky na obličky a/alebo pečeň účinky, ktoré sa môžu vyskytnúť pri vystavení Ca-Alg aerogélu alebo pri vystavení Na-Alg. z Pre každú testovanú látku sa použili tri skupiny zvierat, ktoré zahŕňali kontrolnú, liečenú a satelitnú skupinu. Kontrolná skupina pozostávala zo 6 potkanov Wistar/skupina (3 samci a 3 samice), zatiaľ čo liečená a satelitná skupina pozostávala z 10 potkanov Wistar/skupina (5 samcov a 5 samíc). Potkany Wistar v liečených skupinách dostávali dennú dávku 250 mg testovaných látok (Ca-Alg aerogél alebo Na-Alg) počas 15 dní a boli usmrtené v deň 16. Zatiaľ čo satelitné skupiny boli liečené rovnako dlho ako v liečebných skupinách, ale radšej sa držali na pozorovaní ďalších 15 dní po liečbe a usmrtili sa na 30. deň.

Stojí za zmienku, že nebolo možné vykonať dve štúdie aerogélu Ca-Alg a Na-Alg paralelne. Z tohto dôvodu nebolo vhodné použiť jednu kontrolnú skupinu pre obe. Tieto kontrolné skupiny dostávali orálny fosfátový pufor len počas 15 dní a následne sa monitorovali ďalších 14 dní. Keďže ide o krátkodobý experiment, pevné prášky aerogélu Ca-Alg a Na-Alg boli tiež suspendované vo fosfátovom pufri (pH 7,4) a dobre premiešané priamo pred perorálnym podaním. Vo všetkých skupinách sa podávanie potkanom začalo každý deň v rovnakom čase pomocou orálnej sondy.

Klinické a behaviorálne pozorovanie

V súlade s usmerneniami OECD 407 boli zvieratá denne monitorované na akékoľvek abnormálne klinické príznaky alebo zmeny v správaní počas trvania štúdie, s osobitnou pozornosťou počas prvých štyroch hodín po podaní testovanej látky. Zvieratá v satelitnej a kontrolnej skupine boli ďalej pozorované ďalších 15 dní bez podávania liečby. Satelitná skupina umožňuje detekciu akýchkoľvek neskorých klinických príznakov naznačujúcich vplyv na pečeň a/alebo obličky prostredníctvom merania hladín alkalickej fosfatázy (ALP) a kreatinínu.

Biochémia séra a analýzy výkalov

Španielsko. Vzorky krvi sa odobrali z orbitálnych sínusových žíl potkanov Wistar, ktoré sa potom použili na rozdelenie séra. Toto odobraté sérum zo vzoriek sa potom prenieslo do sterilných Eppendorfových skúmaviek a skladovalo sa v hlbokom zmrazení na ďalšie testovanie biochemických parametrov. Vzorky výkalov sa tiež odoberali každý druhý deň, aby sa preskúmala zmena v štruktúre mikrobiálnej komunity. Výkaly sa zhromaždili v čistých sterilných 15 ml skúmavkách so skrutkovacím uzáverom a priamo sa udržiavali pri -20˚C, kým sa nezobrali všetky vzorky. V 15-dňovej štúdii s opakovanými dávkami sa týždenne odoberali iba vzorky krvi na meranie hladín alkalickej fosfatázy (ALP) a kreatinínu, teda v deň 0, 7. deň, 14. deň, deň 21 a deň 30 (deň 21 a deň 30 sa týkali len kontrolnej a satelitnej skupiny).

Analýza črevnej mikrobiálnej komunity

Extrakcia DNA z odobratých vzoriek výkalov bola vykonaná pomocou MO BIO'S PowerMaxSoil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, USA), podľa pokynov výrobcu. Purifikácia a sekvenovanie genómovej DNA (gDNA) pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) sa potom uskutočnili pomocou laboratória Mr. DNA Lab (Molecular Research LP, USA). PCR amplifikácia génu 16S rRNA a jeho následné sekvenovanie sa uskutočnilo pomocou Illumina. PCR primery ill27F mod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG)/ill519R a mod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) s čiarovým kódom na forward primeru ill27F mod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG)/ill519R a mod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) na forward primeru boli použité v 30 cykloch s použitím súpravy HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA). Po amplifikácii boli produkty PCR skontrolované v 2% agarózovom géli, aby sa určila úspešnosť amplifikácie a relatívna intenzita pásov.

Potom sa spojené a purifikované PCR produkty použili na prípravu Illumina DNA knižnice. Sekvenovanie sa uskutočnilo s MR DNA na sekvenovaní mikrobiómov (MiSeq) podľa pokynov výrobcu. Sekvenované dáta boli spracované pomocou MR DNA analytického potrubia. Stručne povedané, sekvencie boli spojené, potom boli ochudobnené o čiarové kódy, potom boli odstránené sekvencie < 150="" bpas,="" ako="" aj="" sekvencie="" s="" nejednoznačným="" volaním="" báz.="" sekvencie="" boli="" odšumované="" a="" boli="" vytvorené="" prevádzkové="" taxonomické="" jednotky="" (out)="" a="" odstránené="" chiméry.="" otu="" boli="" definované="" zhlukom="" pri="" 3-percentnej="" divergencii="" (97-percentná="" podobnosť).="" finálne="" otu="" boli="" taxonomicky="" klasifikované="" pomocou="" blastn="" oproti="" kurátorskej="" databáze="" odvodenej="" z="" rdp-ii="" a="" ncbi.="" na="" hierarchické="" klastrovanie="" sa="" použil="" balík="" rôznych="" štatistických="" analýz="" zahrnutých="" v="" softvéri="" „r“="" (verzia="" 3.5.1,="" vegan="">