Experimentálna štúdia mechanizmov účinku proti športovej únave Cistanche Deserticola

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

YANG Hong-xin1, YANG Yong2, YAN Xiao-hong1 (1. Katedra cytobiológie, Inner Mongolia Medical College, Hohhot 010059, Čína; 2. Katedra onkológie, Nemocnica autonómnej oblasti Vnútorné Mongolsko, Huhhot 010017, Čína)

Abstrakt:Cieľ Študovať účinokcistanche deserticolana izoenzým laktátdehydrogenázy (LDH), glykogén a syntázu oxidu dusnatého 3 (NOS3) pečene u myší zaťažuje plávanie a skúma relevantné molekulárne mechanizmy proti športovej únave. Metódy Myši boli rozdelené do normálnej kontrolnej skupiny, športovej kontrolnej skupiny acistanche deserticolaexperimentálna skupina. Každej myši z bežnej kontrolnej skupiny a športovej kontrolnej skupiny bol podávaný fyziologický roztok 0,2 ml denne. Každá myš z experimentálnej skupiny cistanche deserticola dostala vodný odvarcistanche deserticola0,2 ml (3 g/kg) denne. Podávanie trvalo 15 dní. Záťažové plávanie počas 90 minút sa uskutočnilo na myšiach športovej kontrolnej skupiny a experimentálnej skupiny cistanche deserticola 1 hodinu po poslednom podaní. Pečene myší boli odstránené po 10 hodinách plávania. Jedna časť pečene sa fixovala v neutrálnom formalíne na prípravu parafínových rezov a ostatné sa použili na meranie aktivity LDH. Štruktúra pečene sa pozorovala farbením HE a pečeňový glykogén sa meral farbením glykogénu. NOS3 bol vyšetrený SP imunohistochemickou metódou. Výsledky Štruktúra pečene športovej kontrolnej skupiny bola vážne zranená, izoenzýmy LDH4 a LDH5 boli vyššie, pečeňový glykogén bol slabý, NOS3 bol znížený v porovnaní s normálnou kontrolnou skupinou (P<0.05). the="" liver="" structure="" of="" the="" cistanche="" deserticola="" experimental="" group="" was="" good,="" ldh5="" isoenzyme="" was="" low,="" the="" glycogen="" was="" rich="" and="" expression="" of="" nos3="" was="" upregulated="" compared="" with="" the="" sport="" control="" group="" (p=""><0.05). conclusions="">Cistanche deserticolaby mohli znížiť LDH5, chrániť pečeň pri zaťažení plávaním myší a urýchliť akumuláciu glykogénu zvýšením expresie NOS3 na ochranu pečene a zlepšením obnovy fyzickej kapacity.

Kľúčové slová:cistanche deserticolapečeňový glykogén; syntáza oxidu dusnatého 3; myši.

Obrázok Cistanche

Cistanche,tiež známy ako Dayun, je dvojročná parazitická bylina z čeľade Ledanaceae. Má suché dužinaté stonky so šupinami. Vyrába sa hlavne na piesočnatých pôdach a polopiesočnatých trávnatých plochách vo Vnútornom Mongolsku, Gansu, Xinjiangu, Qinghai a na iných miestach. Vnútorné MongolskoCistanchemá najlepšiu kvalitu spomedzi všetkých výrobných oblastí.Cistanchemá sladkú, slanú a hrejivú povahu. Vstúpi doobličkya meridián hrubého čreva. Jeho hlavnými funkciami je vyživovať obličky a posilňovať jang, vyživovať esenciu a krv a zvlhčovať črevá. Často sa používa na liečbu impotencie, neplodnosti, slabého pásu a kolien, slabosti svalov a kostí, suchých čriev a zápchy. Cieľom tejto štúdie je sledovať účinkyCistanchena záťažových plávajúcich myšiach pečeňovú laktátdehydrogenázu (LDH), pečeňový glykogén a syntázu oxidu dusnatého 3 (NOS3) prostredníctvom testu záťažového plávania u myší a na preskúmanie jej ochranného mechanizmu na pečeni. Preto môže poskytnúť teoretický základ pre hĺbkový výskum, vývoj a využitieCistanche v športovej zdravej výžive.

1 Experimentálne materiály

1.1 Zvieratá

3 0 samce krýs Kunming, čistý stupeň, telesná hmotnosť (20±0,5) g, poskytnuté Animal Center of Inner Mongolia University.

1.2 Lieky

Cistanche deserticolaYCMa, vyrábaný v Ejina Banner, Vnútorné Mongolsko a bol identifikovaný. Podľa pôvodného liečivého materiálu: voda=100 g: 400 ml, najskôr namočiť na 30 minút, zohriať a povariť a potom 30 minút lúhovať na teplom ohni. Tekutý liek vylejte a znovu rozvarte v pomere 100 g: 200 ml. Tieto dva odvary sa zmiešali a prefiltrovali dvoma vrstvami gázy a potom sa skoncentrovali na ekvivalent 1 g pôvodného liečivého materiálu na mililiter vodného odvarového zásobného roztoku, skladovaného v chladničke pri teplote 4 °C.

1.3 Činidlá a nástroje

NOS3 polyklonálna protilátka bola zakúpená od Wuhan Boster Bioengineering Co., Ltd. Súprava SP bola zakúpená od Fujian Maixin Reagent Company. Súprava izoenzýmu laktátdehydrogenázy bola zakúpená od spoločnosti Inner Mongolia Tongri Reagent Company (výhradne vlastnená Nissanom). Analyzátor farebných obrázkov Nanjing JD-80. Americký systém UVP gélovej analýzy obrazu.

2 Experimentálna metóda

2.1 Zoskupovanie a dávkovanie

Kunming myši boli náhodne rozdelené do normálnej kontrolnej skupiny, kontrolnej skupiny pri cvičení aCistancheexperimentálna skupina s 10 myšou v každej skupine. Normálna kontrolná skupina a kontrolná skupina pri cvičení dostávali normálny fyziologický roztok raz denne, 0,2 ml/čas; aCistanchebola daná experimentálna skupinacistancheodvar (vezmite 3 ml pôvodného vodného odvaru a pridajte vodu na 10 ml). Raz denne, 0,2 ml/čas, denná dávka je 3 g/kg a 15 dní v rade. Jednu hodinu po poslednej dávke sa myši v kontrolnej skupine pri cvičení aCistancheexperimentálna skupina bola zaťažená 1 g oloveným závažím na chvoste a bola umiestnená do bazéna s výškou 50 cm, dĺžkou 50 cm a šírkou 35 cm, aby mohli plávať pri teplote (30 ± 0,5) stupňa , Neustále myši pozorujte, ak sa zistí, že prestávajú plávať, pomocou drevenej palice stimulujte ich pohyb po dobu 90 minút. Po cvičení jedzte normálnu stravu, odpočívajte 10 hodín a potom myši usmrtte s normálnymi myšami z kontrolnej skupiny. Vyberte pečeň, zafixujte časť 10 percentným neutrálnym formaldehydom a po dehydratácii, priehľadnosti, ponorení do vosku a zaliatí urobte z nej hrúbku 4 µm. Na pozorovanie štruktúry pečeňového tkaniva každej skupiny použite metódu farbenia HE. Druhá časť bola premytá normálnym fyziologickým roztokom a skladovaná zmrazená pri -20 stupňoch a počas merania bola rozmrazená pri izbovej teplote. Osušte filtračným papierom a odvážte, potom pripravte pečeňový homogenát s normálnym fyziologickým roztokom, centrifugujte pri 3 500 ot./min. počas 15 minút. Vezmite supernatant a zmerajte aktivitu izoenzýmu laktátdehydrogenázy elektroforézou.

2.2 Stanovenie aktivity laktátdehydrogenázy

Pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli sa izoenzýmy LDH separujú podľa rozdielov v ich elektroforetickej pohyblivosti. Koncentrácia separačného gélu vo vzorke je 7 percent, pH 8,9, a koncentrácia koncentrovaného gélu je 4 percentá, pH 6,8. 10 ul vzorky sa zmieša s 1 kvapkou glycerolu a indikátorom brómfenolovej modrej. Elektródovým tlmivým roztokom je Tris-glycín (pH 8,7), začnite stabilizovať napätie pri 100-150 V, po 30 minútach pridajte na 200-250 V a elektroforézujte 4 hodiny. Po elektroforéze sa zafarbil laktátdehydrogenázovou izoenzýmovou súpravou a farbil pri 37 stupňoch počas 30 minút, pričom sa ukázal modrý pás izoenzýmu laktátdehydrogenázy, potom sa opláchol vodou a fixoval ľadovou kyselinou octovou. Nakoniec použite na analýzu údajov systém UVP gélovej analýzy obrazu.

2.3 Farbenie glykogénom

Sériové rezy s hrúbkou 4 um sa rutinne deparafinujú na vodu. vložte do 1% roztoku kyseliny jodistej pri 37 stupňoch na 15 minút. opláchnutý tečúcou vodou. vložiť do Schiffovho roztoku na 60 min. opláchnuté tečúcou vodou, dehydratované gradientovým etanolom, transparentným xylénom a pripevnené neutrálnou gumou. Potom pozorujte výsledky farbenia pod mikroskopom.

2.4 Imunohistochemické farbenie

Rezy sa rutinne zbavia parafínu vo vode a antigén sa opraví mikrovlnami s citrátovým pufrom. Pôsobte roztokom A počas 10 minút, aby ste odstránili endogénnu peroxidázu, a blokujte roztokom B (zriedené kozie sérum) počas 10 minút. Pridajte primárnu protilátku do zvlhčeného boxu pri 4 stupňoch cez noc a na druhý deň premyte roztokom PBS s pH 7,4 počas 5 minút x 3-krát. Potom pridajte biotínom označený roztok C (pracovný roztok sekundárnej protilátky) a inkubujte 10 minút, premyte roztokom PBS 5 minút x 3-krát. Pridajte roztok D označený chrenovou peroxidázou a inkubujte 10 minút, premyte roztokom PBS 5 minút x 3-krát. Nakoniec sa vyvíjal v roztoku DAB počas 5 minút, premyl sa vodou z vodovodu, kontrastne sa zafarbil HE, dehydratoval sa gradientom etanolu, priehľadný xylénom a nasadil sa neutrálnou gumou. Po nasadení fólie pozorujte pod svetelným mikroskopom. V každej sérii experimentov sa ako negatívna kontrola namiesto primárnej protilátky použil fyziologický roztok pufrovaný fosfátom (PBS).

2.5 Analýza expresie syntázy 3 oxidu dusnatého

Predbežné pozorovanie vizuálnou semikvantitatívnou metódou pod svetelným mikroskopom, NOS3 pozitívny produkt je tmavohnedý alebo hnedý. Pozitívny produkt sa nachádza v cytoplazme hepatocytov alebo endotelových buniek medzi hepatocytmi a modré pozadie je negatívne. Potom použite systém analýzy farebného obrazu na meranie sivej hodnoty pozitívneho reaktantu. Pod šošovkou objektívu 40x sa náhodne merajú parametre 4 zorných polí pre každý film a berie sa priemerná hodnota. Tento parameter sa používa na vyjadrenie zmeny intenzity farbenia NOS3.

2.6 Štatistické metódy

Všetky údaje sú vyjadrené ako x-±s a SPSS11.0 štatistický softvérový balík sa používa pre t-test a P<0.05 is="" considered="" as="" significant="">

3 Výsledky

3.1 Pozorovanie štruktúry tkaniva pod optickým mikroskopom

Štruktúra pečeňových lalokov v normálnej skupine je jasná, bunkové šnúry sú usporiadané úhľadne, pečeňové sínusoidy sú normálne, pečeňové bunky nemajú žiadne zjavné lézie a jadrová štruktúra je jasná. Normálna tkanivová štruktúra kontrolnej skupiny cvičenia zmizla, hranice lalokov boli nejasné a bunková šnúra bola narušená, väčšina pečeňových sínusoidov zmizla a rozsiahla vakuolárna degenerácia hepatocytov sa prejavuje zvýšeným objemom buniek. Cytoplazma je voľná, mierne sfarbená, dokonca číra a priehľadná a niektoré pečeňové bunky vykazujú typickú balónovú zmenu s malým množstvom fokálnej alebo bodkovanej nekrózy. Pečeňové bunkyCistancheexperimentálna skupina boli mierne zakalené, ale boli usporiadané pravidelne. V bunkách neboli žiadne zjavné vakuoly a uvoľnenie, bunkové šnúry boli usporiadané úhľadne a štruktúra jadra bola jasná.

3.2 Účinky na aktivitu pečeňových izoenzýmov laktátdehydrogenázy u myší pri záťaži (pozri tabuľku 1)

3.3 Pozorovanie farbenia pečeňového glykogénu pod optickým mikroskopom

Hoci obsah glykogénu v normálnej kontrolnej skupine nie je vysoký, v každej pečeňovej bunke je glykogén, distribúcia je rovnomerná a nedochádza k fenoménu vakuoly. Kontrolná skupina pri cvičení mala menej glykogénu, rozptýleného v pečeňových bunkách a v niektorých oblastiach sa objavili vakuoly; experimentálna skupina Cistanche bola bohatá na glykogén, ale nazbieralo sa veľa na jednej strane bunky.

3.4 Pozorovanie expresie syntázy oxidu dusnatého 3 optickým mikroskopom a kvantitatívna analýza obrazu

Existuje silná pozitívna expresia v cytoplazme hepatocytov v normálnej kontrolnej skupine, ktorá je difúzne distribuovaná, najmä v binukleárnych bunkách, a pozitívna expresia v endotelových bunkách. Expresia v cytoplazme hepatocytov a endotelových buniek v kontrolnej skupine pri cvičení bola oslabená.Cistancheexperimentálna skupina mala pozitívnu expresiu v cytoplazme hepatocytov a silnú pozitívnu expresiu v endotelových bunkách. Výsledky analýzy analyzátora farebných obrázkov sú uvedené v tabuľke 2.

4. Diskusia

Pohyb ľudského tela potrebuje energiu a telo potrebuje energiu aj v procese metabolizmu Bunkový metabolizmus priamo využíva energiu z rozkladu adenozíntrifosfátu (ATP) a energiu potrebnú na syntézu ATP v konečnom dôsledku zabezpečuje hlavne katabolizmus cukru . Štúdie ukázali, že po namáhavom cvičení si telo vytvorí veľké množstvo H plus, voľných radikálov, kyseliny mliečnej a ďalších látok, ktoré ovplyvňujú normálny metabolizmus buniek. Nedostatok glukózy v bunkách zároveň vedie k únave z cvičenia a poškodeniu buniek. Výsledky tejto štúdie ukazujú, že poškodenie štruktúry pečeňového tkaniva je veľmi vážne po veľkom cvičení a ovplyvňuje aj bunkový anabolizmus, ako je zníženie syntézy pečeňového glykogénu. U myší užívajúcich Cistanche možno pozorovať, že znižujú poškodenie pečene po veľkom cvičení, najmä v dôsledku zníženia LDH5, a obsah pečeňového glykogénu je výrazne vyšší ako u kontrolnej skupiny pri cvičení, čo naznačuje, žeCistanchemôže dosiahnuť ochranu pečene a udržať normálnu fyziológiu znížením funkcie LDH5. Z výsledkov farbenia glykogénom sa zistil obsah glykogénu vCistancheexperimentálnej skupiny je vyšší ako u normálnej kontrolnej skupiny. robíCistanchezvýšiť zásoby glykogénu v pečeni pred cvičením alebo urýchliť syntézu glykogénu v strese po cvičení? Nedá sa vyvodiť žiadny záver, pretože neexistuje žiadna kontrolná skupina, ktorá by necvičilaCistanchev experimente. Ešte to musí byť potvrdené v ďalšom kroku, ale ochranný účinok Cistanche na pečeň a podpora syntézy glykogénu po veľkom cvičení sú zrejmé.

NO je látka s malou molekulou, ktorá je v posledných rokoch športovou komunitou vysoko cenená. NOS je hlavným faktorom limitujúcim rýchlosť produkcie NO. Bolo potvrdené, že NOS má 3 typy izoenzýmov. NOS1 sa nazýva neuronálna syntáza oxidu dusnatého. Existuje v neurónových bunkách, bunkách kostrového svalstva atď. a podieľa sa hlavne na neurovývoji, neurosekrécii, procesoch učenia a pamäti. NOS2 je indukovateľná syntáza oxidu dusnatého, ktorá sa nachádza hlavne v bunkách hladkého svalstva, makrofágoch a lymfocytoch. Akonáhle je tento enzým indukovaný, môže pokračovať v syntéze NO, kým sa substrát nevyčerpá alebo bunka nezomrie. V súčasnosti sa predpokladá, že sa podieľa na poškodení buniek; NOS3 je endoteliálna syntáza oxidu dusnatého, ktorá je distribuovaná hlavne v endotelových bunkách a hepatocytoch. Produkovaný NO sa podieľa najmä na fyziologických funkciách. Výsledky tejto štúdie ukazujú, že expresia NOS3 v endotelových bunkách a hepatocytoch je po veľkom cvičení oslabená a výsledný NO je znížený, takže krvné cievy nie je možné efektívne rozširovať, prietok krvi je znížený a suroviny na syntetický glykogén nemôže byť transportovaný do pečeňových buniek, takže syntéza glykogénu je znížená.

Funkcia proti únave Cistanche

Cistanchemôže upregulovať expresiu NOS3 v endotelových bunkách a pečeňových bunkách. Reaktívne roztiahnite krvné cievy. Zvýšte prietok krvi, urýchlite schopnosť transportu surovín na syntézu glykogénu. Urýchlite syntézu glykogénu a udržujte telo na normálnej fyziologickej metabolickej úrovni. Preto zníženie LDH5 na ochranu pečene a upregulácia expresie NOS3 na podporu glukoneogenézy kyseliny mliečnej môže byť dôležitým mechanizmom preCistanchechrániť pečeň a podporovať fyzické zotavenie. Tento výskum poskytuje vedecký experimentálny základ pre ďalší vývoj a využitieCistanchev oblasti športovej medicíny, a tiež kladie základy pre rozvoj a čistenieCistancheov efektlátok.

Artical z: "Experimentálna štúdia mechanizmov protišportového únavového efektu Cistanche Deserticola" od YANG Hong-xin1 atď.

-----Čínsky časopis informácií o TCM, apríl 2008, zväzok 15 č. 4