Inhibítor farnesyltransferázy LNK-754 zmierňuje axonálnu dystrofiu a znižuje amyloidovú patológiu u myší, časť 3

Výsledky

Znížená záťaž amyloidnými plakmi a hyperfosforylácia tau v mozgoch LNK-754- chronicky liečených 5XFAD myší

LNK-754 a lonafarnib sú FTI s malou molekulou, ktoré boli predtým testované na ľuďoch v klinických štúdiách rakoviny a je známe, že prechádzajú hematoencefalickou bariérou [8, 9, 41, 42]. -synukleín [8] a inklúzie tau [9] sú redukované LNK-754 a lonafarnibom, v tomto poradí, ale zatiaľ neboli hodnotené voči amyloidnému fenotypu AD. V tejto štúdii sme skúmali ich účinky na amyloidnú patológiu na myšom modeli 5XFAD. U myší 5XFAD sa vytvárajú depozity A začínajúce vo veku 2 mesiacov [36, 37] a dystrofické neurity sa pozorujú v najskorších štádiách ukladania amyloidu [39, 43].

Hematoencefalická bariéra a imunita sú dve veľmi dôležité časti ľudského tela a sú neoddeliteľne spojené. Hematoencefalická bariéra je ochranná bariéra medzi mozgom a krvou, ktorá chráni mozog pred škodlivými látkami zvonku. Imunita je dôležitým mechanizmom, ktorým ľudské telo odoláva chorobám. Aký je teda špecifický vzťah medzi hematoencefalickou bariérou a imunitou?

Po prvé, hematoencefalická bariéra môže zabrániť niektorým škodlivým baktériám a vírusom vstúpiť do mozgu, čím chráni mozog pred poškodením. Okrem toho hematoencefalická bariéra môže kontrolovať aj priepustnosť určitých látok, čo im umožňuje vstúpiť do mozgu len v obmedzenej miere. To je rozhodujúce pre ochranu zdravia nervového systému, pretože príliš veľa určitých vnútorných látok vstupujúcich do mozgu môže spôsobiť poškodenie nervových buniek.

Imunita zároveň môže zohrávať úlohu aj pri ochrane mozgu. Imunitný systém ľudského tela dokáže rozpoznať patogény a škodlivé látky a potom produkovať zodpovedajúce protilátky, aby odolal ich invázii, čím chráni telo pred chorobami. Keď však určité patogény alebo látky prekročia hematoencefalickú bariéru a dostanú sa do mozgu, imunitný systém zareaguje rýchlo a vytvorí protilátky, ktoré ich napadnú a eliminujú.

Preto hrá hematoencefalická bariéra a imunita veľmi dôležitú úlohu pri udržiavaní ľudského zdravia. Hematoencefalická bariéra zabraňuje vstupu škodlivých látok do mozgu, zatiaľ čo imunita odstraňuje patogény a iné škodlivé látky, ktoré obchádzajú hematoencefalickú bariéru a dostávajú sa do mozgu. Obaja spolupracujú na zabezpečení zdravého fungovania mozgu.

Stručne povedané, hematoencefalická bariéra a imunita spolupracujú prostredníctvom svojich príslušných mechanizmov, aby zohrávali dôležitú úlohu v ľudskom zdraví. Mali by sme sa zamerať na ochranu ich zdravia, aby sme zabezpečili celkové zdravie organizmu. Je vidieť, že si musíme zlepšiť pamäť. Cistanche deserticola môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola je tradičný čínsky liečivý materiál s mnohými jedinečnými účinkami, z ktorých jedným je zlepšenie pamäte. Účinnosť mletého mäsa pochádza z mnohých aktívnych zložiek, ktoré obsahuje, vrátane kyselín, polysacharidov, flavonoidov atď. Tieto zložky môžu podporovať zdravie mozgu rôznymi spôsobmi.

Kliknite na vedieť doplnky na zlepšenie pamäte

Preto, aby sa zhodoval s vývojom amyloidnej patológie u myší 5XFAD, liečili sme myši chronicky počas 3 mesiacov vehikulom, LNK-754 a lonafarnibom, počínajúc vo veku 2 mesiacov. LNK-754 a lonafarnib boli rozpustené vo vehikule 0,5% sodnej soli karboxymetylcelulózy a ip injekčne podávané denne s dávkou 1 mg/kg [8, 44].

Najprv sme sa snažili určiť účinky chronickej liečby LNK{0}} a lonafarnibom na plakovú záťaž A u myší 5XFAD pomocou imunofluorescenčnej mikroskopie pre A 42, ktorá deteguje difúzny aj agregovaný amyloid a tiazínovú červeň (TR), ktorá deteguje iba fibrilárny plak jadrá (obr. 1A; obr. S1). Zistili sme významný pokles pokrytej oblasti v kortikálnych oblastiach mozgu myší liečených LNK754-v porovnaní s kontrolami liečenými vehikulom (obr. 1B). V hipokampe bola pokrytá oblasť významne znížená u myší liečených LNK-754-v porovnaní s myšami liečenými lonafarnibom a existoval trend k poklesu počtu myší liečených LNK{10}} v porovnaní s myšami liečenými vehikulom (obr. 1C).

Pokrytá oblasť u myší liečených lonafarnibom sa významne nelíšila od myší liečených vehikulom ani v kôre, ani v hipokampe (obr. 1A, B). Veľkosť plaku bola znížená v kortikálnych a hipokampálnych oblastiach mozgu liečbou LNK-754 v porovnaní s liečbou vehikulom; tento rozdiel bol štatisticky významný v hipokampe (obr. 1D, E; obr. S2A, B). Významný rozdiel vo veľkosti plakov medzi lonafarnibom a liečbou LNK-754 bol tiež pozorovaný v hipokampe (obr. 1D, E; obr. S2A, B).

Veľkosť plaku bola nezmenená u myší liečených lonafarnibom v porovnaní s myšami liečenými vehikulom v kortikálnych alebo hipokampálnych oblastiach mozgu (obr. 1D, E; obr. S2A, B). Výsadba plakov bola kvantifikovaná analýzou počtu plakov farbením TR. Počet plakov významne klesol v kortexe, ale nie v hipokampe, LNK-754 v porovnaní s myšami liečenými vehikulom (obr. S2C, D). Znížená záťaž plakmi bola potvrdená meraním A42 pomocou ELISA v PBS a homogenátoch hemimozgu rozpustných v guanidíne (obr. 1F, G). Podobne ako v prípade našich výsledkov imunofluorescenčnej mikroskopie, existoval trend smerom k menšiemu počtu A42 vo frakciách guanidínu a PBS u myší liečených lonafarnibom, zatiaľ čo výrazne nižšia hladina A42 vo frakciách guanidínu sa dosiahla pri liečbe LNK-754 (obr. 1. F, G).

Keďže účinky založené na pohlaví v myšom modeli 5XFAD boli hlásené pre hladiny APP v rovnovážnom stave a zaťaženie plakmi [45, 46], vykonali sme imunobloty samcov a samíc myší liečených vehikulom, LNK-754 alebo lonafarnibom oddelene na expresiu transgénneho APP (obr. S3A). Hladiny transgénneho APP sa merali imunoblotom s protilátkou APP 6E10, ktorá rozpoznáva iba ľudský APP, a boli nezmenené u samcov alebo samíc myší liečených LNK-754, lonafarnibom alebo vehikulom (obr. S3B-D). Druhým definujúcim znakom AD je prítomnosť hyperfosforylovaných inklúzií tau v mozgu a spolu s ukladaním plakov je endogénny myšací tau hyperfosforylovaný u myší 5XFAD [47, 48].

Aby sa určilo, či bola hyperfosforylácia tau ovplyvnená liečbou FTI v modeli myší s amyloidom, vykonala sa imunoblotová analýza pre fosfo-tau na seríne 404 (obr. 1H; obr. S3E), epitop, o ktorom je známe, že je hyperfosforylovaný v mozgoch AD a myšiach 5XFAD [ 47, 49]. Tu sme zistili znížené hladiny fosfo-tau ser404 v mozgoch myší liečených lonafarnibom a LNK-754 (obr. 1I), zatiaľ čo celková hladina tau zostala nezmenená (obr. 1J; obr. S3F). Celkovo naše výsledky ukazujú, že zaťaženie amyloidnými plakmi a patogénna fosforylácia tau sú znížené v myšom modeli 5XFAD farmakologickou liečbou pomocou FTI, hoci liečba LNK-754 bola podstatne účinnejšia ako lonafarnib.

Chronická liečba LNK-754 inhibuje proteínovú farnezyláciu v mozgoch myší 5XFAD

Aby sme potvrdili, že zacielenie FTázy pomocou LNK{0}} a lonafarnibu ip injekciou inhibovalo proteínovú farnezyláciu v mozgoch myší 5XFAD, hodnotili sme rôzne substráty FTázy a downstream markery inhibície FTázy v hemimozgových homogenátoch myší 5XFAD chronicky liečených vehikulom, LNK -754 alebo lonafarnib imunoblotovou analýzou. Najprv sme analyzovali prelamín A, ktorý sa hromadí, keď je FTáza inhibovaná [50]. Zvýšenie prelaminu A bolo pozorované v mozgoch myší liečených LNK-754 v porovnaní s vehikulom, zatiaľ čo u myší liečených lonafarnibom nedošlo k žiadnej zmene (obr. S4A, D). Ďalej sme sa zamerali na HDJ-2, chaperónový proteín, ktorý prechádza vzostupnou pohyblivosťou po liečbe FTI a je široko používaný ako marker inhibície FTázy [50]. V súlade s prelaminom A bola pomalšia migrujúca forma HDJ-2 prítomná u myší liečených LNK{11}}, ale nie u myší liečených lonafarnibom (obr. S4B, E). Významný nárast pomalšie migrujúcich druhov HDJ-2 sa zistil u myší LNK754 v porovnaní s myšami liečenými vehikulom alebo lonafarnibom (obr. S4E).

Farnezylácia navyše aktivuje Ras, takže sme merali aj fosforyláciu jeho downstream efektorovej molekuly ERK1 (P44/P42) (obr. S4C). Zatiaľ čo HDJ -2 a prelamín A sa liečbou lonafarnibom nezmenili, pozoroval sa trend k zníženiu pERK1 (obr. S4F). pERK1 bol tiež znížený u myší liečených LNK-754 (obr. S4F). Naše výsledky naznačujú, že 1 mg/kg LNK-754 inhibovalo FTázu v mozgu, avšak lonafarnib bol menej účinný. Mohlo by to byť spôsobené nižšou účinnosťou a IC50 lonafarnibu, ako bolo uvedené vyššie [41, 51], alebo možno zníženou expozíciou mozgu.

Znížená akumulácia LAMP1 v dystrofických neuritoch u LNK-754 chronicky liečených 5XFAD myší

V zdravých neurónoch sú lyzozomálne zložky dodávané do endozómov a autofagických organel v distálnych neuritoch, ktoré sa okysľujú a dozrievajú počas retrográdneho prenosu smerom k neurónovému sómu [52, 53]. Amyloidné plaky narušujú tento proces, čo vedie k dystrofickým neuritom, ktoré zachytávajú dysfunkčné autofagické a endolyzozomálne organely.

Dystrofické neurity blokujú axonálny transport BACE1, čo vedie ku generácii A v rámci dystrofických neuritov a k ukladaniu extracelulárnych plakov [16–18]. Je známe, že FTI zvyšujú lyzozomálnu funkciu a stabilitu mikrotubulov, takže aby sme ďalej skúmali, ako FTI znižujú záťaž plakmi, zamerali sme sa špecificky na dystrofické neurity u myší 5XFAD.

Na kvantifikáciu akumulácie dystrofických neuritov okolo plakov sme hodnotili lyzozomálny membránový proteín 1 (LAMP1), marker heterogénnych endolyzozomálnych a autofagických organel. Hipokampálne a kortikálne mozgové tkanivá z 5XFAD myší liečených vehikulom, LNK-754 a lonafarnibom sa spoločne farbili na LAMP1 a A42 a uskutočnila sa konfokálna imunofluorescenčná mikroskopia (obr. 2A, B).
Bol nastavený prah na elimináciu fluorescenčných signálov LAMP1 z vezikúl v zdravých neuritoch a somách na špecifickú analýzu dystrofických neuritov. Oblasť pokrytá LAMP1 bola významne znížená v kortikálnych a hipokampálnych oblastiach mozgu myší liečených LNK-754 (obr. 2C, D), zatiaľ čo u myší liečených lonafarnibom nebol pozorovaný žiadny rozdiel v porovnaní s liečbou vehikulom (obr. 2C, D). . Ukladanie amyloidných plakov iniciuje rozvoj dystrofií v blízkych neuritoch, hlavne axónoch a presynaptických zakončeniach.

V súlade s tým sú účinky LNK-754 a lonafarnibu na dystrofické neurity v súlade s ich účinkami na záťaž plakmi (obr. 1). Ďalšia analýza účinku liečby FTI na dystrofické neurity sa uskutočnila kvantifikáciou pomeru oblasti pokrytej LAMP1 k oblasti A42, aby sa určilo, či FTI obmedzujú veľkosť dystrofie okolo plakov. Zníženie pomeru LAMP1:A42 bolo pozorované u myší liečených LNK{6}} v porovnaní s myšami s vehikulom a liečby LNK{7}} a lonafarnibom boli významne odlišné (obr. 2E, F), čo naznačuje, že LNK -754 myší spojených s menším počtom dystrofických neuritov.
Zvýšené hladiny LAMP1 sa našli v hemimozgových homogenátoch myší liečených buď LNK-754 alebo lonafarnibom (obr. S5A, B), čo je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami, ktoré ukazujú, že lonafarnib a LNK-754 zvyšujú počet autolyzozómov a hladiny lyzozomálnych membránových proteínov a hydroláz [8, 9]. V súlade s výsledkami imunoblotovej analýzy pre LAMP1 (obr. S5A, B) bola priemerná intenzita fluorescencie celkového imunofarbenia LAMP1 významne zvýšená v mozgoch myší liečených LNK-754 a lonafarnibom v porovnaní s myšami liečenými vehikulom (obr. S5C, D).

Na rozdiel od celkovej úrovne fluorescencie LAMP1 bola priemerná intenzita fluorescencie LAMP1 v dystrofických neuritoch medzi vehikulom, LNK -754 a myšami liečenými lonafarnibom (obr. S5E, F) nezmenená. V kôre myší liečených LNK-754 intenzita fluorescencie LAMP1 u dystrofií a plakovej záťaže vysoko korelovala, zatiaľ čo žiadna korelácia medzi intenzitou LAMP1 u dystrofií a plakovou záťažou sa nenašla u myší liečených lonafarnibom alebo vehikulom (obr. 2G, H), odhaľujúce spojenie medzi akumuláciou dystrofického neuritu LAMP1 a plakovou záťažou u myší LNK{11}}. V hipokampe sa pozoroval trend smerom ku korelácii medzi intenzitou LAMP1 pri dystrofiách a plakovou záťažou. Naše výsledky spoločne ukazujú, že liečba LNK{13}} zvyšuje celkovú hladinu LAMP1, no zároveň zmierňuje patologickú akumuláciu LAMP1 v dystrofických neuritoch, ktoré sú zvyčajne prítomné u myší 5XFAD.

Znížená akumulácia BACE1 v dystrofických neuritoch u LNK-754 chronicky liečených 5XFAD myší

LAMP1 sa nachádza na membránach endolyzozomálnych organel, ktoré sa zameriavajú na axonálny BACE1 na zrelé lyzozómy na degradáciu. Preto by FTI mohli inhibovať tvorbu A a ukladanie extracelulárnych plakov znížením tvorby axonálnej dystrofie a akumulácie BACE1 okolo plakov. Na podporu tejto hypotézy hladina dystrofického neuritu LAMP1 a záťaž plakmi vysoko korelovali v kortikálnych oblastiach mozgu u LNK-754 myší.

Naša analýza imunofarbenia LAMP1 odhalila, že v porovnaní s liečbou vehikulom alebo lonafarnibom boli plaky u myší 5XFAD liečených LNK{1}} spojené s menším počtom dystrofických neuritov (obr. 2). Aby sme určili, či hladina BACE1 v dystrofických neuritoch bola podobne znížená na plak, okrem LAMP1 a A 42 sme vykonali konfokálnu imunofluorescenčnú mikroskopiu kortikálnych a hipokampálnych mozgových tkanív myší liečených vehikulom, LNK{5}} a lonafarnibom pre BACE1. (Obr. 3A, B).

Tu bola oblasť pokrytá BACE1 významne znížená v kortikálnych oblastiach mozgu myší liečených LNK{1}} a trend bol pozorovaný u myší liečených lonafarnibom (obr. 3C). Analýza oblasti pokrytej BACE1 v dystrofických neuritoch v hipokampe bola sťažená vysokou úrovňou expresie BACE1 v presynaptických zakončeniach dráhy CA3 hipokampálnych machových vlákien [17]. Ďalej sme analyzovali, či sa menej BACE1 lokalizovalo do endolyzozómov v dystrofických neuritoch meraním Pearsonovho korelačného koeficientu pre BACE1 a LAMP1 u dystrofií. Významné zníženie ko-lokalizácie BACE1 a LAMP1 na plak sa zistilo v kortikálnych oblastiach mozgu u myší liečených LNK{14}}v porovnaní s liečbou vehikulom (obr. 3D).

V hipokampe sa zistil významný pokles spoločnej lokalizácie BACE1 a LAMP1 na plak pre LNK-754 v porovnaní s lonafarnibom a trend smerom k poklesu bol pozorovaný pri liečbe LNK-754 v porovnaní s vehikulom (obr. 3E). Výsledky testu sú v súlade s našimi zisteniami o zaťažení plakmi a oblasti pokrytej LAMP1 a ďalej podporujú myšlienku, že liečba LNK-754 zmiernila tvorbu dystrofických neuritov, čím sa znížilo hromadenie poškodených endolyzozomálnych organel, ktoré sa zameriavajú na degradáciu BACE1.

Akútna liečba LNK-754 redukuje neskorú akumuláciu endozómov a lyzozómov v dystrofických neuritoch u myší 5XFAD na živých rezoch mozgu

Ďalej sme testovali akútne účinky LNK{0}} a lonafarnibu na dystrofické neurity pomocou konfokálneho zobrazenia živých mozgových tkanív. V tomto experimente sa 5-mesačným myšiam 5XFAD podávalo denne počas 3 týždňov vehikulum, LNK-754 alebo lonafarnib. Tkanivá sme zafarbili LysoTracker-Green (LT), sondou bežne používanou na sledovanie a selektívnu identifikáciu acidifikovaných neskorých endozómov a lyzozómov v živých bunkách [53]. Vzor farbenia LT a tiazínovou červenou bol konzistentný s našimi výsledkami imunofarbenia pre markery dystrofických neuritov u 5XFAD myší (obr. 2A, B; obr. 3A, B); LT-pozitívne neskoré endozómy a lyzozómy boli vysoko koncentrované v dystrofických neuritoch úzko spojených s amyloidnými plakmi v živých mozgových tkanivách (obr. 4A).

Akútna 3-týždňová liečba 5-mesačných myší 5XFAD pomocou LNK-754 alebo lonafarnibu nestačila na zmenšenie veľkosti plaku (obr. 4B), hoci liečba LNK-754 spôsobila signifikantný pokles pomeru LT:TR na plak a veľkosti dystrofických neuritov (obr. 4C, D). Je zaujímavé, že na rozdiel od našich zistení pre LAMP1 alebo BACE1, akútna liečba lonafarnibom tiež znížila veľkosť dystrofie a pomer LT:TR na plak (obr. 4C, D). Veľkosť dystrofických neuritov a veľkosť plaku vysoko korelovali u myší 5XFAD liečených LNK{11}} (obr. 4F) a významná korelácia sa pozorovala aj u myší liečených lonafarnibom (obr. 4G). U myší liečených vehikulom neexistovala žiadna korelácia (obr. 4E). Naše výsledky potvrdzujú, že LNK-754 znížila axonálnu dystrofiu a naznačujú, že FTI môžu zmierniť neskorú akumuláciu endozómov a lyzozómov okolo plakov, a to aj po rozsiahlom ukladaní plakov a degenerácii axónov.

Zlepšenie deficitu učenia a pamäte u myší hAPP/PS1 po krátkodobej liečbe LNK-754

LNK-754 zabránila akumulácii LAMP1, BACE1 a LT v dystrofických neuritoch u myší 5XFAD, čo naznačuje, že liečba LNK-754 chráni pred synaptickou dysfunkciou spojenou s A. Aby sme vyhodnotili, či liečba LNK-754 mala priaznivý vplyv na kognitívne funkcie, hodnotili sme krátkodobú účinnosť perorálnej liečby LNK-754 na priestorové učenie a pamäť na myšom modeli hAPP/PS1 AD [40] . Priestorová pamäť hAPP/PS1 myší sa zlepšila po 12 dňoch perorálnej liečby LNK-754, ako to vyhodnotil Morris Water Maze (MWM).

Počas školenia skrytej platformy sa myši hAPP/PS1 liečené LNK{0}} naučili lokalizovať platformu rýchlejšie ako myši hAPP/PS1 liečené vehikulom, čo viedlo k krivke učenia, ktorá je výrazne odlišná od krivky hAPP liečenej vehikulom. /PS1 kontrolné myši (obr. 5A). Myšiam hAPP/PS1 liečeným vehikulom trvalo nájdenie platformy výrazne viac času v porovnaní s kontrolami divokého typu liečenými vehikulom na 4. a 7. deň tréningových skúšok, zatiaľ čo medzi hAPP/ liečenými LNK-754 neboli nájdené žiadne významné rozdiely. PSI myši a myši divokého typu ošetrené vehikulom (obr. 5A-C).

Počas testu sondy vykazovali zvieratá hAPP/PS1 liečené LNK{0}} zvýšený čas strávený v cieľovom kvadrante (obr. 5D) a zvýšenú frekvenciu kríženia plošiny (obr. 5E), čo je porovnateľné so zvieratami divokého typu liečenými vehikulom . Hladiny A 42 sa merali pomocou ELISA a boli nezmenené v rozpustných a nerozpustných mozgových homogenátoch z myší hAPP/PS1 liečených vehikulom alebo LNK{8}} (obr. 5F, G), čo naznačuje, že zlepšená pamäť a priestorové učenie neboli výsledkom zníženej amyloidovej záťaže u myší hAPP/PS1 liečených LNK{11}}.

For more information:1950477648nn@gmail.com