Feristatín II účinne inhibuje replikáciu SARS-CoV-2 vo Vero bunkách

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktné

Ťažký akútny respiračný syndróm koronavírus 2 (SARS-CoV-2) má naďalej významný vplyv na globálne verejné zdravie. Bolo popísaných viacero mechanizmov vstupu do buniek SARS-CoV-2; avšak úlohe transferínového receptora 1 (TfR1) pri infekcii SARS-CoV-2 sa venovala malá pozornosť. Použili sme feritín II na vyvolanie degradácie TfR1 na povrchu buniek Vero a na štúdium dôsledkov takéhoto ošetrenia na životaschopnosť buniek a replikáciu SARS-CoV-2. Preukázali sme, že feritín II je netoxický pre Vero bunky v koncentráciách až do 400 uM. Podľa údajov z konfokálnej mikroskopie je distribúcia značeného transferínu a receptor viažucej domény (RBD) Spikeho proteínu významne ovplyvnená 18-hodinovým predbežným ošetrením 100 uM feritínu II v kultivačnom médiu. Príjem RBD proteínu je takmer úplne inhibovaný pôsobením feritínu II, hoci tento proteín zostáva viazaný na bunkovom povrchu. Zistenia boli dobre potvrdené významnou inhibíciou infekcie SARS-CoV-2 buniek Vero feritínom II s hodnotami IC50 27 µM (pre vírus Wuhan D614G) a 40 µM (pre vírus Delta). Významné zníženie infekčného titra variantu Omicron SARS-CoV-2 bolo zaznamenané pri koncentrácii feritínu II len 6,25 uM. Predpokladáme, že feritín II blokuje TfR1-sprostredkovaný SARS-CoV-2 vstup hostiteľskej bunky; sú však potrebné ďalšie štúdie na objasnenie úplných mechanizmov inhibície tohto vírusu vrátane účinku feritínu II na iné receptory SARS-CoV-2, ako sú ACE2, Neuropilín{30}} a CD147. Inhibícia vstupu vírusu zacielením na receptor na hostiteľských bunkách, a nie na proteín náchylný na vírusové mutácie, je sľubnou terapeutickou stratégiou COVID{33}}.

Kľúčové slová: SARS-CoV-2;transferínový receptor 1; feritín II; doména viažuca receptor (RBD); Vero bunky

Alexey Sokolov, Irina Isakova-Sivak *, Natalia Grudinina, Daria Mezhenskaya, Elena Litasova, Valeria Kostevich, Ekaterina Stepanova, Alexandra Rak, Ivan Sychev, Olga Kirik a Larisa Rudenko

Inštitút experimentálnej medicíny, 197376 Petrohrad, Rusko

1. Úvod

Pandémia koronavírusovej choroby 2019 (COVID{1}}) spôsobená koronavírusom 2 závažného akútneho respiračného syndrómu (SARS-CoV-2) naďalej predstavuje významnú sociálno-ekonomickú záťaž pre svetovú populáciu. Angiotenzín-konvertujúci enzým 2 (ACE2) sa považuje za hlavný receptor hostiteľskej bunky, ktorý SARS-CoV-2 využíva na vstup do buniek [1–4]; bolo však identifikovaných niekoľko alternatívnych receptorov a koreceptorov schopných uľahčiť vstup do buniek SARS-CoV{14}} a infekčnosť, ako napríklad neuropilín{15}}, CD147, tyrozín-proteínkinázový receptor UFO (AXL) a ďalšie [5 – 10]. Okrem toho sú potrebné dva kroky proteolytického štiepenia na účinný vstup SARS-CoV-2 do buniek po zapojení receptora hostiteľskej bunky vírusovým spike (S) proteínom. Prvý krok zahŕňa štiepenie hranice S1–S2 furínovou proteázou v infikovanej bunke, zatiaľ čo štiepenie miesta S20 závisí od proteáz cieľových buniek, ako sú TMPRSS2 a katepsín L, ktoré aktivujú proteíny S na plazmatickej membráne a v endolyzozóm (prehľad v [11]).

cistanche na predajpreimunitná schopnosť

Okrem dobre preštudovaných cieľov vstupu hostiteľskej bunky SARS-CoV{2}} existujú dôkazy, že transferínový receptor 1 (TfR1) môže byť alternatívnym koreceptorom pre vstup SARS-CoV-2 [12]. TfR1, 95 kDa homodimérny membránový glykoproteín typu II, je hojne exprimovaný na plazmatickej membráne väčšiny ľudských buniek a sprostredkováva vstup transferínu (Tf) do buniek na dodávanie železa [13]. V skutočnosti existuje široká škála ľudských a zoonotických vírusov, ktoré môžu napadnúť hostiteľské bunky prostredníctvom interakcie s TfR1 a ďalšími faktormi v dráhe príjmu železa, vrátane arenavírusov Nového sveta, vírusu ľudskej imunodeficiencie, parvovírusov, vírusu hepatitídy C, alfavírusov a ďalších. [14]. Zameranie sa na dráhu vstupu vírusu sprostredkovanú TfR{14}} preto predstavuje sľubnú terapeutickú stratégiu pre infekciu SARS-CoV{16}}. Včasné skríningové štúdie identifikovali dve zlúčeniny malej veľkosti (NCI11079 a NCI306711), ktoré mali významný inhibičný účinok na Tf-sprostredkované vychytávanie železa bunkami HeLa. Zlúčenina NCI306711 cieli na TfR1 indukciou jeho internalizácie a degradácie a bola pomenovaná „feritín“ kvôli svojej nezvyčajnej vlastnosti inhibovať transport železa cestou závislou od cholesterolu [15]. Ďalšia malá molekula, feritín II (NSC8679), pôsobí podobným spôsobom ako feritín a degraduje TfR1 prostredníctvom lipidovej raftovej dráhy citlivej na nystatín [16]. Vo svetle týchto údajov sme sa pokúsili posúdiť schopnosť feritínu II inhibovať replikáciu SARS-CoV-2 v bunkách Vero-CCL81 a preskúmať potenciálne mechanizmy tejto inhibície.

2. Materiály a metódy

2.1. Vírusy, proteíny a chemické zlúčeniny

SARS-CoV-2 izoluje hCoV-19/St_Petersburg-3524S/2020 (rod Wuhan D614G), hCoV-19 /Rusko/SPE-RII-32759V/2021 (rod Delta) a hCoV-19/Rusko/SPE RII-6086V/2021 (rod Omicron) boli získané z výskumného ústavu Smorodintsev Chrípka (Sankt Peterburg, Rusko). Všetky práce s infekčnými vírusmi sa vykonávali v laboratóriu úrovne biologickej bezpečnosti 3 (BSL-3). Rekombinantný proteín zodpovedajúci doméne viažucej receptor (RBD) proteínu SARS-CoV-2 S bol exprimovaný v eukaryotických bunkách spoločnosťou BIOCAD JSC (St.Petersburg, Rusko). Železom nasýtené ľudské sérum TF (Fe{20}}TF) bolo izolované z ľudského krvného séra iónovo-výmennou chromatografiou na DEAE-Toyopearl, UNOsphere S a gélovou filtráciou na Sephadex G-75 Superfine, ako už bolo opísané [17]. Feristatín II (obrázok 1) bol zakúpený od Sigma (C-1144, St. Louis, MO, USA). Zlúčenina sa zriedila v 150 mM NaCl, 10 mM Na-fosfátovom pufri, pH 7,4 (PBS) na konečnú koncentráciu 4 mm a roztok sa prefiltroval cez sterilnú membránu s veľkosťou pórov 0,22 um (Sartorius, Nemecko). .

2.2. Šírenie vírusu SARS-CoV{3}} a hodnotenie schopnosti inhibovať vírus Ferristatín II

Vírusy sa množili na bunkách Vero CCL81 s použitím DMEM doplneného 1x antibiotikom-antimykotikom, 10 mM HEPES a 2 percentami FBS (všetky od Capricorn, Ebsdorfergrund, Nemecko), (DMEM/2 percentá FBS). Infekčné titre sa stanovili testom 50 % infekčnej dávky tkanivovej kultúry (TCID50), ako je opísané v [18] a vyjadrené v lgTCID50/ml.

Na vyhodnotenie neutralizačnej kapacity vírusu feritínu sme použili modifikovaný mikroneutralizačný test. Deň pred experimentmi boli Vero bunky vysiate do {{0}}jamkových kultivačných platní (3 x 104 buniek na jamku) v DMEM doplnenom 1 x antibiotikom-antimykotikom a 10 percentami FBS. Nasledujúci deň sa médium odstránilo a bunky sa infikovali 100 TCID50 SARS-CoV-2 pripraveným na DMEM/2 percentá FBS počas 2 hodín pri 37 °C, 5 percent CO2. Niekoľko jamiek zostalo neinfikovaných ako negatívna kontrola. Potom sa inokulum odstránilo a bunky sa prekryli 150 ul dvojnásobného riedenia feritínu II pripraveného na DMEM/2 percentá FBS, zatiaľ čo jamky s negatívnou a pozitívnou kontrolou boli pokryté iba médiom. Každé riedenie feritínu II bolo hodnotené trojmo. Doštičky sa inkubovali 48 hodín (pre vírus Wuhan G614D) alebo 72 hodín (pre vírusy Delta a Omicron) pri 37 °C, 5 percent CO2, kým sa nepozoroval jasný cytopatický účinok v jamkách s pozitívnou kontrolou. Supernatanty sa opatrne odobrali do 0,2 ml skúmaviek na kvantifikáciu vírusového titra a bunky sa fixovali 10 percentným formaldehydom pri 4 °C počas 24 hodín.

Fixované doštičky sa preniesli do laboratória BSL{{0}} na bunkovú ELISA procedúru. To zahŕňalo premytie PBST (PBS s 0,05 percenta Tween 20), bunkovú permeabilizáciu s 0,1 percenta Triton X-100 pri izbovej teplote počas 15 minút, blokovanie 3 percentami odstredeného mlieka pri 37 ◦C 1 hodinu a intenzívne premytie PBST. Potom sa pridala purifikovaná polyklonálna králičia anti-RBD protilátka (BIOCAD JSC, Petrohrad, Rusko) v koncentrácii 1,5 ug/ml počas 1 hodiny, nasledovalo premytie PBST a pridanie sekundárnej anti-králičej anti-IgG HRP- konjugovanej protilátky (BioRad, Hercules, CA, USA) počas 1 hodiny pri 37 ◦C. Platne boli vyvinuté pomocou 1-Step Ultra TMB-ELISA substrátového roztoku (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Reakcia bola zastavená 1M roztokom H2S04 a výsledky boli odčítané pri 450 nm pomocou xMark Microplate Spectrophotometer (BioRad, Hercules, CA, USA). Na výpočet titra IC50 sa použila štvorparametrická nelineárna regresná analýza založená na hodnotách OD450 vírusovo-negatívnych a vírus-pozitívnych buniek, ako je opísané v [18].

kde kúpiť cistanche

Titre SARS-CoV-2 v bunkových supernatantoch sa vypočítali kvantitatívnou RT-PCR v reálnom čase. RNA bola purifikovaná zo 100 ul bunkového kultivačného média, ako aj zo SARS-CoV-2 so známymi titrami na vytvorenie štandardných kriviek testu. Vzorky RNA sa purifikovali pomocou súpravy na extrakciu RNA (Biolabmix, Novosibirsk, Rusko) podľa protokolu výrobcu. Reakcia RT-PCR sa uskutočnila v duplikátoch s forwardovým primérom 50 -CAATGGTTTAACAGGCACAGG-30 a reverzným primérom 50 -CTCAAGTGTCTGTG GATCACG-30 [19] pomocou jednoskúmavkového RT-PCR SYBR kit (Evrogen, Moskva, Rusko) na systéme Quantstudio 1 Real-Time PCR System (Thermofifisher Scientific, Waltham, MA, USA), s pridaním 50x Rox ako referenčného farbiva.

Prahový cyklus (Ct) sa vypočítal pre každú vzorku pomocou softvéru QuantStudio Design and Analysis Software v1.5.1 a na každej reakčnej platni sa vytvorila štandardná krivka. Titer vírusu v každej jamke sa vypočítal použitím Ct hodnôt normalizovaných na štandardné krivky vypočítané na základe štandardnej vírusovej titrácie a vyjadrené v lgTCID50/ml. Aby sa určilo, či feritín II môže inhibovať počiatočné kroky prichytenia vírusu k bunkám, 100 TCID50 SARS-CoV-2 sa zmiešalo s feritínom II a po 1 hodine inkubácie pri 37 ◦C sa táto zmes pridala do Vero buniek, nasledovala ďalšia 1 hodinová inkubácia pri 37 °C. Po absorpcii vírusu sa inokulum odstránilo a bunky sa prekryli 150 ul čerstvého média DMEM/2 percentá FBS. Po 48 hodinách inkubácie pri 37 °C, 5 percentách CO2 a viditeľnom CPE v pozitívnych kontrolných bunkách sa platne fixovali a podrobili bunkovej ELISA, ako je opísané vyššie.

2.3. Hodnotenie cytotoxického účinku Ferristatinu II

Cytotoxicita feritínu II pre bunky Vero bola hodnotená pomocou {{0}}}(4,{2}}dimetyltiazol- 2-yl)-2,5-difenyltetrazóliumbromidu ( MTT) redukčný test [20]. Dvojnásobné riedenia feritínu II sa pripravili v médiu DMEM/2 percentá FBS počínajúc koncentráciou 400 uM a pridali sa do jamiek 96-jamkových doštičiek s monovrstvami buniek Vero. Po 48 hodinách inkubácie sa médium odstránilo a bunky sa jemne premyli teplým PBS. Do každej jamky sa pridalo 0,5 mg/ml MTT činidlo v objeme 100 ul a doštička sa ďalej inkubovala pri 37 °C počas 2 hodín. Potom sa činidlo odstránilo a bunky sa premyli PBS a vysušili na vzduchu, potom sa pridalo 100 ul 96 percentného etanolu, aby sa rozpustili kryštály formazanu. Intenzita farby bola zaznamenaná pomocou spektrofotometra pri vlnovej dĺžke 535 nm. Ako negatívne kontroly sa použili jamky doštičky, ktoré neboli nasadené Vero bunkami. 50-percentná inhibícia bunkovej životaschopnosti (CC50) sa vypočítala štvorparametrovou nelineárnou regresnou analýzou s použitím softvéru GraphPad Prizm.

2.4. Označenie transferínu ľudského séra a rekombinantného proteínu RBD

Značkovacia reakcia sa uskutočnila pri plus 4 °C počas 12 hodín pridaním 5 mM roztoku NHS-esteru 5-TAMRA (Lumiprobe, #47120) v dimetylsulfoxide do 30 µM Fe2- TF alebo roztokov RBD v 200 mM NaHC03, pri dodržaní pomeru 5-TAMRA: proteín=8:1 (mol/mol). Po odstránení prebytočného farbiva sa stupeň značenia odhadol pomerom A541 a A280, čo bolo 3,5 a 3,2 mol TAMRA na mol Fe2-TF a RBD, v tomto poradí

2.5. Štúdia účinku feristatinu II na absorpciu TF a RBD bunkami Vero

Vero bunky sa kultivovali 18 hodín v DMEM/2 percent FBS bez feritínu II a s pridaním 100 μM feritínu II s krycími sklíčkami pre mikroskopiu, ktoré boli predtým umiestnené na spodok kultivačných platní. Potom sa médium nahradilo na 15 hodín médiom bez FBS obsahujúcim 1,2 μM Fe2-TF-TAMRA （0,25 mg/ml） alebo 1,2 μM RBD-TAMRA (0,1 mg/ml). Po inkubácii boli bunky jemne premyté dvakrát PBS, fixované 4 percentami paraformaldehydu (w/) v PBS počas 10 minút, premyté dvakrát PBS počas 30 minút. Potom boli jadrá buniek zafarbené 360 nM DAPI počas 5 minút, premyté PBS a krycími sklíčkami a pripevnené na sklíčka pomocou polymerizačnej živice pre fluorescenčnú mikroskopiu (DAKO, Glostrup, Dánsko). Snímky boli získané pomocou konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopu Axio Observer.Z1/7 (Carl Zeiss, Jena, Nemecko) s objektívom Plan-Apochromat 63×/1,40 Oil DIC M27. Na excitáciu fluorescencie TAMRA, { Na záznam fluorescencie sa použil {28}} nm filter, na excitáciu DAPI sa použil 405 nm laser. a na záznam fluorescencie sa použil 400-570 nm filter. Obrázky boli získané a spracované pomocou softvéru dodaného s mikroskopom.

3. Výsledky

Na posúdenie schopnosti feritínu II inhibovať replikáciu vírusu v bunkách Vero sme použili dva antigénne vzdialené kmene SARS-CoV{1}}. V prvom štádiu sme hodnotili vírusovú inhibíciu v konštantnej prítomnosti zlúčeniny v kultivačnom médiu. Detekcia vírusového antigénu v bunkovej ELISA zistila, že hodnoty IC50 pre feritín II boli 26,5 a 40,4 uM pre vírusy Wuhan D614G a Delta (obrázok 2A). Kvantifikácia titrov vírusu v kultivačnom médiu potvrdila, že uvoľňovanie vírusu z infikovaných buniek do kultivačného média bolo inhibované feritínom II, počnúc koncentráciou 25 uM a hodnoty IC50 vypočítané zo zníženia TCID50 titrov boli 24,0 a 25,2 uM pre vírusy Wuhan D614G a Delta. Okrem toho, keď sa zlúčenina pridala v koncentrácii 100 uM, nenastala v bunkách Vero žiadna vírusová replikácia (obrázok 2B).

cistanche a tongkat ali

Kvôli významným rozdielom v RBD proteínoch variantov Wuhan D614G a Omicron SARS-CoV-2 nebolo možné tieto varianty detegovať v bunkovej ELISA pomocou dostupnej anti-RBD protilátky, pretože bola zvýšená RBD pôvodného kmeňa SARS-CoV-2. Zníženie infekčných vírusových titrov v prítomnosti feritínu II však bolo ešte výraznejšie vo variante Omicron v porovnaní s ďalšími dvoma kmeňmi SARS-CoV-2: pri feritíne II bol zaznamenaný desaťnásobný pokles titra vírusu koncentrácii len 6,25 uM, pričom nedochádza k replikácii vírusu pri koncentráciách 50 uM a vyšších (obrázok 3). Je dôležité poznamenať, že k tejto inhibícii SARS-CoV-2 došlo iba vtedy, keď bol feritín II neustále prítomný v kultivačnom médiu, zatiaľ čo tento účinok nebol pozorovaný, keď boli bunky vopred ošetrené zlúčeninou alebo keď bol vírus/feritín Zmes II sa použila v adsorpčnom kroku, po ktorom nasledovala inkubácia bez látky (údaje nie sú uvedené).

We further assessed the cytotoxic effect of ferritin II on Vero-CCL81 cells. The presence of this compound in the culture medium at a concentration up to 400 µM had no negative effect on the viability of the cells, suggesting that the inhibition of SARS-CoV-2 replication was not due to the cell's metabolic dysfunctions (Figure 4). Therefore, the selectivity indices (determined as a ratio of CC50 to IC50 values) for ferritin II were >10, >15, and >64 pre kmene Wuhan D614G, Delta a Omicron SARS-CoV-2.

Aby sme preskúmali možné mechanizmy inhibície SARS-CoV-2 feritínom II, študovali sme účinok látky na vstup vírusu pomocou náhradného testu vychytávania RBD. Zistili sme teda, ako môže 100 uM netoxická koncentrácia feritínu II ovplyvniť vychytávanie tetrametylrodamínom značeného (TAMRA) RBD bunkami Vero. Je známe, že TfR1, cieľ pôsobenia feritínu II, sprostredkuje vstup Tf; preto sa ako pozitívna kontrola použil TF značený TAMRA. Kultivácia buniek Vero v prítomnosti 100 uM feritínu II počas 18 hodín bez pridania značených proteínov nemala žiadny významný vplyv na morfológiu bunkových jadier (obrázok 5, horný panel (Mock)), čo nepriamo naznačuje neprítomnosť bunkovej nekrózy a apoptózy. Inkubácia buniek s TF-TAMRA bez ošetrenia feritínom II viedla k akumulácii značených proteínov vo vnútri buniek bez ovplyvnenia jadrovej oblasti zafarbenej DAPI (ľavá stredná triáda obrázkov (TF-TAMRA) na obrázku 5). Ošetrenie buniek 100 uM feritínom II viedlo k významnému zníženiu zahrnutia značeného TF (pravá stredná triáda obrazov (TF-TAMRA) na obrázku 5). Inkubácia buniek s RBD-TAMRA bez ošetrenia feritínom II, ako v prípade značeného TF, viedla k akumulácii značených proteínov v bunkovej cytoplazme bez ovplyvnenia jadrovej oblasti (triáda vľavo dole (RBD-TAMRA) na obrázku 5 ). Keď boli bunky ošetrené 100 uM feritínu II, došlo k redistribúcii signálu TAMRA. Namiesto začlenenia značeného RBD do buniek bol signál TAMRA distribuovaný rovnomerne po bunkovom povrchu, pričom len malá časť značky vytvárala zhluky čiastočne prekrývajúce farbenie jadier DAPI, čo naznačuje povrchovú lokalizáciu značky TAMRA (spodná časť pravá triáda (RBD-TAMRA) na obrázku 5). Výsledky zobrazené na obrázku 5 ukazujú, že ošetrenie buniek Vero 100 uM feritínu II ovplyvňuje inkorporáciu značeného RBD do buniek. Vzhľadom na to, že v súčasnosti nie sú dostupné žiadne údaje o účinku feritínu II na receptor ACE2, nemožno vylúčiť, že pozorovaný účinok je spôsobený väzbou značeného RBD na povrch bunky, ale absencia TfR1 na bunkách bráni inkorporácii RBD v bunkách ošetrených feritínom II.

4. Diskusia

SARS-CoV-2 využíva viacero mechanizmov na napadnutie hostiteľských buniek a spôsobenie úspešnej vírusovej infekcie a v súčasnosti sa ako terapeutické stratégie COVID{2}} posudzuje široká škála inhibítorov vstupu hostiteľských buniek [21]. V tejto štúdii uvádzame predbežné výsledky inhibície replikácie SARS-CoV-2 in vitro ošetrením cieľových buniek feritínom II, molekulou malej veľkosti, ktorá dokáže selektívne degradovať transferínový receptor 1. Železom nasýtený transferín (Fe2-Tf alebo holo-Tf) má vysokú afinitu k svojim receptorom, ktorá je exprimovaná na povrchoch väčšiny ľudských buniek a je internalizovaná v komplexe s holo-Tf receptorom sprostredkovanou endocytózou. Tvorba komplexov medzi železom a Tf, ako aj medzi holo-Tf a TfR, je závislá od pH a poskytuje uvoľňovanie železa z Tf a Tf z TfR v kyslom prostredí endozómu. Recyklácia endozómu vedie k návratu TfR do plazmatickej membrány a uvoľneniu apo-formy Tf na ďalšie kolo dodávania železa do bunky. Príjem železa bunkami cicavcov je dôležitý proces na reguláciu rastu rakovinových buniek, ktorým chýbajú farmakologické činidlá so známymi mechanizmami účinku. Skríning 2 000 malých zlúčenín z knižnice Diversity Set knižnice National Cancer Institute identifikoval 10 inhibítorov transportu železa s hodnotami IC50 v rozmedzí od 5 do 30 µM [22]. Feristatín II sa použil ako blokátor TfR1 v štúdiách bunkovej infekcie prostredníctvom TfR1 s vírusom hepatitídy C [23,24], vírusom prenosnej gastroenteritídy [25] a reovírusom [26] (tabuľka 1). Je potrebné poznamenať, že pokusy o degradácii TfR1 feritínom II sa takmer vždy vykonávajú za stálej prítomnosti látky v médiu.

V podobnom usporiadaní testu sme zistili, že feritín II bol prakticky netoxický pre Vero bunky počas 48-hodinovej expozície koncentrácii 400 uM. Táto koncentrácia postačuje na úplnú degradáciu TfR1 na povrchu kultivovaných buniek [16]. Na jednej strane bol tento účinok potvrdený zníženým vychytávaním značeného Fe2-Tf bunkami Vero vopred ošetrenými 100 uM feritínu II počas 18 hodín. Neúplné blokovanie vychytávania značeného Tf v tomto prípade možno vysvetliť absenciou feritínu II v čase pridania značených proteínov. Na druhej strane, ošetrenie buniek Vero feritínom II dramaticky zmenilo príjem RBD proteínov Spike. V tejto predbežnej štúdii sme nehodnotili úroveň expresie iných SARS-CoV-2 receptorov pri liečbe feritínom II a neindukovali knock-out týchto známych receptorov, aby sme dokázali nezávislú úlohu TfR pri sprostredkovaní SARS. -CoV-2 vstup do bunky, čo je oblasť nášho ďalšieho výskumu.

Relatívne rovnomerná väzba RBD na povrch buniek ošetrených feritínom II však môže naznačovať, že niektoré receptory SARS-CoV-2 na Vero bunkách zostávajú funkčné a viažu vírus, ale v neprítomnosti TfR1, vírus nemôže vstúpiť do bunky. Tento receptor je s najväčšou pravdepodobnosťou ACE2, pretože Prabhakara et al. preukázali zvýšenie vychytávania značeného RBD spolu so značeným transferínom bunkami nadmerne exprimujúcimi ACE2, čo naznačuje, že ACE2 podporuje vychytávanie RBD prostredníctvom endocytózy sprostredkovanej klatrínom, ktorú využíva TfR1 [28]. Okrem toho existujú dôkazy, že SARS-CoV-2 môže infikovať ACE2-negatívne bunky pomocou alternatívnych vstupných ciest [29]; preto hlbšia analýza pôsobenia feritínu II na rôzne typy buniek umožňuje infekciu SARS-CoV{14}} objasniť úlohu TfR1 v životnom cykle vírusu. Aby sme pochopili, aká sľubná je táto látka pre budúcu liečbu infekcie SARS-CoV-2, je dôležité vedieť, ako sa táto zlúčenina metabolizuje in vivo. Potkany liečené feritínom II mali nižšie hladiny TfR1 v pečeni a znížené sérové ​​železo a saturáciu Tf bez zmien nehemového železa v pečeni [16].

Okrem toho feritín II indukoval expresiu hepcidínu [16,30]. V inej štúdii sa hodnotila génová expresia po podaní feritínu II (v kukuričnom oleji) do žalúdka potkanov Wistar v dávke 146 mg/kg/deň počas 7 dní. Spomedzi génov proteínov regulujúcich železo bola po podaní feritínu II pozorovaná znížená expresia HFE a zvýšená expresia CP, GDF15 a HAMP [31]. Je potrebné poznamenať, že účinok feritínu II na p53-závislú signálnu dráhu bol s najväčšou pravdepodobnosťou bariérou obmedzujúcou jeho použitie iba ako inhibítora TfR1 na bunkových kultúrach [31].

Ferristatín II je známy aj ako direct black 38, Chlorazol black E, CI 30235 alebo CAS 1937- 37-7 a bežne sa používa ako farbivo na farbenie granulocytov a onychomykózy [32,33]. Dôležité je, že benzidínové metabolity priamej čiernej 38, ktoré predstavujú potenciálne riziko rakoviny močového mechúra, boli pozorované vo vzorkách moču pracovníkov v malom závode, ktorý toto farbivo vyrábal [34]. Hoci feritín II nemožno priamo použiť u ľudí, z tohto dôvodu existuje argument, že stratégia inhibície vstupu SARS-CoV{10}} do bunky blokovaním TfR1 je sľubná, pretože tento prístup sa zameriava na receptor na hostiteľovi bunky skôr než proteín náchylný na vírusové mutácie. Okrem toho sú potrebné ďalšie štúdie na identifikáciu chemických zlúčenín, ktoré pôsobia ako molekula feritínu II, ale bez tvorby metabolitov s potenciálnymi zdravotnými rizikami.

cistanche erektilná dysfunkcia

Referencie

1 Scalo, F.; Daniele, A.; Amato, F.; Pastore, L.; Matera, MG; Cazzola, M.; Castaldo, G.; Bianco, A. ACE2: The Major Cell Entry Receptor pre SARS-CoV-2. Pľúca 2020, 198, 867–877. [CrossRef] [PubMed]

2. Ni, W.; Yang, X.; Yang, D.; Bao, J.; Li, R.; Xiao, Y.; Hou, C.; Wang, H.; Liu, J.; Yang, D.; a kol. Úloha angiotenzín konvertujúceho enzýmu 2 (ACE2) v COVID-19. Crit. Starostlivosť 2020, 24, 422. [CrossRef] [PubMed]

3. Shang, J.; Áno, G.; Shi, K.; Wan, Y.; Luo, C.; Aihara, H.; Geng, Q.; Auerbach, A.; Li, F. Štrukturálny základ rozpoznávania receptorov SARS-CoV-2. Príroda 2020, 581, 221–224. [CrossRef] [PubMed]

4. Wan, Y.; Shang, J.; Graham, R.; Baric, RS; Li, F. Rozpoznanie receptora novým koronavírusom z Wuhanu: Analýza založená na desaťročných štrukturálnych štúdiách koronavírusu SARS. J. Virol. 2020, 94, e00127-20. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhang, Q.; Chen, CZ; Swaroop, M.; Xu, M.; Wang, L.; Lee, J.; Wang, AQ; Pradhan, M.; Hagen, N.; Chen, L.; a kol. Heparan sulfát pomáha SARS-CoV-2 pri vstupe do buniek a môžu byť cielené schválenými liekmi in vitro. Cell Discov. 2020, 6, 80. [CrossRef]

6. Wang, K.; Chen, W.; Zhang, Z.; Deng, Y.; Lian, JQ; Du, P.; Wei, D.; Zhang, Y.; Slnko, XX; Gong, L.; a kol. Proteín CD147-spike je novou cestou infekcie SARS-CoV-2 do hostiteľských buniek. Transdukcia signálu. Cieľ. Ther. 2020, 5, 283. [CrossRef]

7. Wei, C.; Wan, L.; Yan, Q.; Wang, X.; Zhang, J.; Yang, X.; Zhang, Y.; Fan, C.; Li, D.; Deng, Y.; a kol. HDL-scavenger receptor B typu 1 uľahčuje vstup SARS-CoV-2. Nat. Metab. 2020, 2, 1391–1400. [CrossRef]

8. Daly, JL; Simonetti, B.; Klein, K.; Chen, KE; Williamson, MK; Anton-Plagaro, C.; Značka obuvi, DK; Simon-Gracia, L.; Bauer, M.; Holland, R.; a kol. Neuropilin-1 je hostiteľským faktorom infekcie SARS-CoV-2. Science 2020, 370, 861 – 865. [CrossRef]

9. Wang, S.; Qiu, Z.; Hou, Y.; Deng, X.; Xu, W.; Zheng, T.; Wu, P.; Xie, S.; Bian, W.; Zhang, C.; a kol. AXL je kandidátsky receptor pre SARS-CoV-2, ktorý podporuje infekciu pľúcnych a bronchiálnych epitelových buniek. Cell Res. 2021, 31, 126–140. [CrossRef]

10. Cantuti-Castelvetri, L.; Ojha, R.; Pedro, LD; Djannatian, M.; Franz, J.; Kuivanen, S.; van der Meer, F.; Kallio, K.; Kaya, T.; Anastasia, M.; a kol. Neuropilin-1 uľahčuje vstup do buniek SARS-CoV-2 a infekčnosť. Science 2020, 370, 856 – 860. [CrossRef]

11. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mechanizmy vstupu SARS-CoV-2 do buniek. Nat. Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef] [PubMed]

12. Tang, X.; Yang, M.; Duan, Z.; Liao, Z.; Liu, L.; Cheng, R.; Fang, M.; Wang, G.; Liu, H.; Xu, J.; a kol. Transferínový receptor je ďalším receptorom pre vstup SARS-CoV-2. bioRxiv 2020. [CrossRef]

13. Hentze, MW; Muckenthaler, MU; Andrews, NC Vyrovnávacie akty: molekulárna kontrola metabolizmu železa u cicavcov. Cell 2004, 117, 285-297. [CrossRef] 14. Wessling-Resnick, M. Crossing the Iron Gate: Prečo a ako transferínové receptory sprostredkúvajú vstup vírusu. Annu. Rev. Nutr. 2018, 38, 431–458. [CrossRef] [PubMed]

15. Horonchik, L.; Wessling-Resnick, M. Inhibítor transportu železa s malou molekulou feritín/NSC306711 podporuje degradáciu transferínového receptora. Chem. Biol. 2008, 15, 647–653. [CrossRef]

16. Byrne, SL; Buckett, PD; Kim, J.; Luo, F.; Sanford, J.; Chen, J.; Enns, C.; Wessling-Resnick, M. Ferristatin II podporuje degradáciu transferínového receptora-1 in vitro a in vivo. PLoS ONE 2013, 8, e70199. [CrossRef]

17. Sokolov, AV; Vojnová, IV; Kostevich, VA; Vlasenko, AY; Zakharova, ET; Vasilyev, VB Porovnanie interakcie medzi ceruloplazmínom a laktoferínom/transferínom: viazať alebo neviazať. Biochem. Bokhimiia 2017, 82, 1073–1078. [CrossRef]