Inhibítor kinázy LRRK2 omladzuje bunkovú starnutie v neurónových bunkách vyvolané oxidačným stresom, časť 1

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Pozadie.Na leucín bohatá repetitívna kináza 2 (LRRK2) hrá rozhodujúcu úlohu v patogenéze Parkinsonovej choroby (PD). Starnutie je najkritickejším rizikovým faktorom progresie PD. Bola stanovená korelácia medzi starnutím a starnutím buniek. Bunková senescencia koreluje s dysreguláciou proteolytickej dráhy a mitochondriálnou dysfunkciou, ktoré sú tiež spojené s agregáciou -synukleínu ( -syn). Metódy. Ľudské dopaminergné bunky podobné neurónom (diferencované bunky SH-SY5Y) boli ošetrené rotenónom v prítomnosti alebo neprítomnosti inhibítora kinázy LRRK2 GSK2578215A (GSK-KI) počas 48 hodín. Markery bunkovej starnutia, vrátane p53, p21Wafi/Cip1(p21), -galaktozidázy (-gal), fosforylácie Rb, aktivity súvisiacej so starnutím (SA) -gal alyzozomálnečinnosť, boli preskúmané. Pomlčkové bunky a potkanie primárne kortikálne neuróny boli ošetrené -syn fibrilami 30 minút pred ošetrením rotenónom v prítomnosti alebo neprítomnosti GSK-KI počas 48 hodín. Myšiam sa intraperitoneálne injikoval rotenón a MLi-2 (inhibítor kinázy LRRK2) raz za dva dni počas dvoch týždňov. Výsledky. Rotenón upreguloval fosforyláciu LRRK2 a hladiny -gal prostredníctvom aktivácie signálnej osi p53-p21 a downreguloval fosforyláciu Rb. Okrem toho rotenón upreguloval aktivitu SA-gal, hladiny reaktívnych foriem kyslíka a LRRK2fosforyláciaa inhibovala aktivitu lyzozómov. Upregulácia LRRK2 indukovaná rotenónom narušila klírens a-syn fibríl. Liečba inhibítorom LRRK2 zmiernila rotenónom indukovanú starnutie buniek a akumuláciu -syn. Závery. Upregulácia aktivity kinázy LRRK2 indukovaná rotenónom podporila starnutie buniek, čo zvýšilo akumuláciu -syn. Avšak podávanie inhibítora kinázy LRRK2 omladilo rotenónom indukovanú starnutie buniek.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

1. Úvod

Parkinsonova choroba (PD), ktorá je najčastejším neurodegeneratívnym ochorením, je charakterizovaná poruchou motorickej kontroly[1]. K patogenéze PD[2-5] prispieva niekoľko genetických a environmentálnych faktorov. LRRK2, hlavný genetický rizikový faktor PD, vykazuje aktivity GTPázy aj kinázy [6]. Mutant LRRK2 G2019S, ktorý vykazuje zvýšenú kinázovú aktivitu, podporuje progresiu PD [7]. Riziko vzniku PD u pacientov s mutantom G2019S sa zvyšuje s vekom [8], keďže starnutie je spojené s progresiou neurodegeneratívnych ochorení [9]. Predtým sme uviedli, že aktivita kinázy LRRK2 podporovala starnutie buniek a inhibovala degradáciu agregátov alfa-synukleínu (-syn) [10]. -Syn je hlavnou zložkou Lewyho teliesok (LB) alebo Lewyho neuritov, ktoré sú posmrtnými markermi PD. Zhoršená degradácia -syn má za následok jeho agregáciu [11].

Starnutie buniek zhoršuje mechanizmus degradácie proteínov[12-14]. Expozícia nízkej dávke rotenónu, o ktorej sa uvádza, že indukuje PD, podporuje starnutie buniek v bunkovej línii ľudskej trabekulárnej sieťoviny [15]. Okrem toho rotenón upreguluje aktivitu kinázy LRRK2 v neurónoch [16]. Preto sme predpokladali, že rotenón podporuje starnutie buniek prostredníctvom aktivácie kinázy LRRK2 a následne zvyšuje agregáciu -syn.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

2. Metódy a materiály

2.1. Bunková kultúra a liečba.

Bunková línia ľudského neuroblastómu (bunky SH-SY5Y) sa kultivovala v rastovom médiu (Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM;10-013-CV; Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) doplnenom 1{{ 48}} percent fetálneho bovinného séra (FBS, 35-010-CV, Corning cellgro), 1 percenta penicilínu/streptomycínu (P/S, 10378-016, Gibco, Thermo Fisher Scientific) a 1 percenta činidla na odstránenie mykoplazmy (KOMA)) pri 37 stupňoch v 5-percentnom CO inkubátore (Thermo Fisher Scientific). Diferencované bunky SH-SY5Y (bunky dSH) sa získali po ošetrení 10 μM kyselinou all-trans retinovou （R2625-100MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pripravenou v rastovom médiu raz za dva dní počas siedmich dní. V deň 7 po ošetrení kyselinou retinoidnou boli bunky spoločne ošetrené rotenónom (1 uM) a GSK2572815A（GSK-KI; Inhibítor kinázy LRRK2; 1 μM） pripravený v rastovom médiu počas 48 hodín. Dimetylsulfoxid (DMSO) sa použil ako vehikulum pre rotenón a GSK-KI. Fibrily -syn boli purifikované tak, ako bolo opísané vyššie [10]. Bunky ošetrené rotenónom a GSK-KI boli ošetrené a-syn fibrilami (70 nM). Primárne kortikálne neuróny potkanov boli ošetrené rotenónom (1 μM), GSK-KI (1 μM) a a-syn fibrilou (70 nM) počas 48 hodín. Podmienky liečby pre primárne kortikálne neuróny potkanov boli identické s podmienkami použitými pre dSH. Bunky sa dvakrát premyli ľadovo studeným fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS) a lyžovali sa v 1 x vzorkovom pufri (50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2 percentá dodecylsulfátu sodného, ​​10 percent glycerolu, 1 percenta -merkaptoetanolu a 0,02 percenta percent brómfenolovej modrej).

2.2. Izolácia a kultivácia primárnych kortikálnych neurónov z embryí potkanov E16.

Gravidné krysy boli usmrtené CO, plynom. Maternica bola vypreparovaná a plody z embryonálnych vakov boli umiestnené do ľadovo chladného HBSS-/-(14175-079, Gibco, Thermo Fisher Scientific). Lebka bola odlúpnutá pomocou klieští a mozgová kôra bola vyrezaná z celého mozgu. Po odstránení mozgových blán boli mozgové kôry inkubované s 0,25 percentným trypsínom-EDTA (25200-056, Gibco, Thermo Fisher Scientific) pri 37 °C počas 20 min. vodný kúpeľ. Ďalej boli kôry inkubované s 40 ug/ml DNázy I (DN25, Sigma-Aldrich), jemne pretrepané na vortexe a inkubované počas 5 minút vo vodnom kúpeli s teplotou 37 stupňov. Väčšina supernatantu sa odstránila odsávaním a vzorky sa inkubovali so sérovým inhibítorom obsahujúcim MEM (11090-08, Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1,5 percenta DMEM, 5 percent FBS, 2,5 mg/ml hovädzieho sérového albumínu (BSA; A7906, Sigma-Aldrich) a 2,5 mg/ml inhibítora trypsínu (T9253, Sigma-Aldrich). Sérový inhibítor sa odstránil a bunková peleta sa resuspendovala v 10-násobku jej objemu s rastovým médiom. Zloženie rastového média bolo nasledovné: neurobazálne médium (21103-049, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific), 2 percentá B-27(17504044, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific) a 1x GlutaMAX{ {34}}(35050-061, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific). Izolované potkanie primárne kortikálne neurónové bunky (3x10 stupňov/jamka) sa naočkovali na 12-jamkovú platňu (SPL30012, SPL Life Sciences, Pochoen, Južná Kórea) a kultivovali sa v rastovom médiu pri 37 stupňoch v 5 percent CO, inkubátor počas 24 hodín. Kultivačné médium bolo nahradené rastovým médiom doplneným 0,2 mg/ml 5-fluór-2'-deoxyuridínu (F0503, Sigma-Aldrich) a 96 ug/ml uridínu (U3750, Sigma-Aldrich). inhibovať mitózu. V deň 6 boli bunky ošetrené 1 uM rotenónom, 1 uM GSK-KI a 70 nM -syn fibrilami počas 48 hodín a zozbierané pomocou lx vzorkového pufra.

2.3. Western Blot.

Western blotting sa uskutočnil tak, ako bolo opísané vyššie [17]. Na western blotting boli použité nasledujúce protilátky: králičia anti-LRRK2 fosfo-S935 monoklonálna (ab133450, Abcam, Cambridge, UK), králičia anti-LRRK2 fosfo-S1292 monoklonálna (ab203181, Abcam), myšacia anti-LRRK2 monoklonálna ( N241A/34, Neu-roMab,UC Davis, CA, USA), myšací monoklonálny anti-p53 (pre ľudský p53:sc-126; pre myšací p53:sc-393031;Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA),myšia anti-p21wafi/-Ccip1(p21) monoklonálna (CM5131, ECM Biosciences, Ver-sailles, KY, USA), myš anti-Rb monoklonálna (#9309S, Cell Signaling Technology (CST), Danvers,MA , USA), anti-fosfoRb(Ser807/811)(#9308S, CST),myšia anti- -galaktozidáza monoklonálna (sc-377257,Santa Cruz Biotech-nology),myšia anti-p62 monoklonálna(ab56416 ,Abcam), myšací anti- -aktín monoklonálny (sc-47778; Biotechnológia Santa Cruz), králičí anti-LC3B polyklonálny (#2775S; CST), myšací anti- -syn (klon 42) monoklonálne (610786; BD Bio-sciences, San Jose, CA, USA),anti-fosfo-treonín-argi-nine(#2351S, CST), anti-p53(SC-99, Santa Cruz Biotechnology),anti-LaminB(SC-6216,Santa Cruz Biotech-nology), AffiniPure konjugovaná s kozou peroxidázou anti-myší IgG(H plus L)(#115-035-003;Jackson Immunoresearch Labo-ratories Inc., West Grove, PA, USA) a kozakonjugované s peroxidázouAffiniPure anti-králičí IgG(H plus L)(#1l1-035-144; Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.) protilátky. Imunoreaktívne signály v nitrocelulózovej membráne boli vyvinuté pomocou Luminata Crescendo Western HRP (#WBLUR0500, Merck & Co. Inc., Kenilworth, NJ, USA) a snímky boli zachytené kamerou MicroChemi4.2 (Shimadzu, Kyoto, Japonsko).

2.4. Proximity Ligation Assay (PLA) a imunofluorescencia (IF).

PLA bola vykonaná pomocou Duolink⑨ In situ Detection Reagents Green (DUO{0}}RXN, Sigma-Aldrich), DuolinkeIn in Situ PLA4Probe Anti-Mouse MINUS protilátka (DUO92002-100RXN, Sigma-Aldrich) a Anti-Rabbit Plus protilátka (DUO92004-100RXN, Sigma-Aldrich), podľa pokynov výrobcu. Bunky SH-SY5Y nasadené na 96-jamkové čierne platne (655077, Greiner Bio-One, Krems-münster, Rakúsko) boli diferencované a diferencované bunky boli ošetrené rotenónom a GSK-KI v deň 7. Bunky sa dvakrát prepláchli ľadovo studeným Dulbeccovým PBS (DPBS), fixovali sa 4 percentami paraformaldehydu počas 30 minút pri teplote miestnosti (RT) a trikrát sa opláchli ľadovo studeným DPBS. Ďalej boli bunky permeabilizované použitím 0,1 percenta Triton X-100 pripraveného v DPBS. Po trojnásobnom premytí studeným DPBS sa bunky inkubovali s kvapkou blokovacieho roztoku pri 37 °C počas 1 hodiny. Blokovací roztok sa odstránil a bunky sa inkubovali s protilátkami (50 ul) pri 37 stupňoch počas 3 hodín. Protilátková zmes pozostávala z protilátkového riedidla zo súpravy (protilátky použité pre PLA: myšacia anti-LRRK2 monoklonálna (1:20) protilátka a králičia anti-LRRK2 fosfo-S1292 monoklonálna (1:20) protilátka; protilátka použitá na test IF: kuracia anti- -gal polyklonálna protilátka (1:400, ab9361, Abcam)). V teste IF sa protilátka pridávala počas celého procesu až do kroku aplikácie PLA. Vzorky sa potom dvakrát premyli 1x premývacím pufrom A počas 5 minút. Na prípravu roztoku sondy sa Duolink⑧In situ PLA· sonda Anti-Mouse Minus a Anti-Rabbit Plus zmiešala s riedidlom protilátky (1:5). Pre test IF sa do zmesi pridala aj anti- -gal protilátka (1:400). Bunky sa inkubovali s 50 ul roztoku sondy pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom sa bunky dvakrát premyli 1x premývacím pufrom A počas 5 minút. Pre test IF sa ligáza (40:1) a anti- -gal protilátka (400:1) zmiešali v ligačnom pufri. Bunky boli inkubované s ligačným roztokom (50 ul) pri 37 stupňoch počas 30 minút a premyté dvakrát 1x premývacím pufrom A počas 5 minút. Pre test IF,polymeráza(1:40) sa inkuboval s kozou anti-kuriacou IgY H plus L (Alexa Fluor② 594; ab150172) sekundárnou protilátkou (1:500) počas 100 minút pri 37 °C. Bunky sa premyli dvakrát 1x premývacím pufrom B počas 10 minút, potom nasledovalo premývanie 0,01x premývacím pufrom B počas 1 minúty. Aby sa zafarbilo jadro, bunky sa inkubovali s Hoechst 33342 (1:1000;62249, Thermo Fisher Scientific) pripraveným v DPBS pri teplote miestnosti počas 10 minút. Obrazy buniek v 96-jamkových čiernych platniach boli zachytené pomocou konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopu (LSM 700, Carl Zeiss Jena, Nemecko).

2.5. Imunoprecipitácia.

Celobunkové lyzáty dSH buniek ošetrených rotenónom (1 μM) a GSK-KI （1 uM） boli pripravené pomocou lyzačného roztoku (PBS, 1% Triton X-100, 1x koktail inhibítora proteázy a lx fosfatáza koktail inhibítorov). Lyzáty sa centrifugovali pri 4,{9}} g a 4 stupňoch počas 5 minút a supernatant sa inkuboval s protilátkou anti-p53 (554293, BD Biosciences) a PierceProtein G Aga-rose (20398, Thermo Fisher Scientific) resuspendované v lyzovacom roztoku počas 12 hodín. Guľôčky sa dvakrát premyli lyzačným roztokom a komplex guľôčka-proteín sa denaturoval lx vzorkovým pufrom.

2.6. Nukleárna frakcionácia.

Jadrová frakcia sa izolovala pomocou NE-PERr nukleárnych a cytoplazmatických extrakčných činidiel (78833, Thermo Fisher Scientific), podľa pokynov výrobcu.

2.7. Príprava mRNA a kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (qRT-PCR).

mRNA sa izolovala z dSH buniek ošetrených rotenónom/GSK-KI pomocou súpravy RNeasy Plus Mini (74134, QIAGEN, Hilden, Nemecko). Ďalej bola mRNA reverzne transkribovaná do komplementárnej DNA (cDNA) pomocou súpravy TOPscript cDNA Synthesis Kit (EZ005S, Enzynomics, Daejeon, Kórejská republika). cDNA bola podrobená qRT-PCR s použitím TOPreal"qPCR 2x Pre-MIX (SYBR Green with low ROX, UDG plus)(RT500M, Enzynomics). Na qRT-PCR sa použili nasledujúce priméry: ľudský p21,5'-ATG AAA TTC ACC CCC TTT CC-3'(forward)) a 5'-CCC TAG GCT GTG CTC ACT TC-3'(reverzný); ľudský p16INK4(p16),5'-CCC AAC GCA CCG AAT AGT TAC-3'(dopredu) a 5'-CAC GGG TCG GGT GAG AGT -3'(reverse).qRT-PCR sa uskutočnilo na cykleri Mic qPCR (MIC-4, BioMolecular Systems, Upper Coomera, Austrália).

2.8. Meranie aktivity (SA) galaktozidázy (-Gal) spojenej so starnutím, reaktívnych druhov kyslíka (ROS) a lyzozómovej aktivity.

Po 30 minútach po ošetrení boli živé dSH bunky zafarbené 2 μM GlycoGREEN-Gal (GC611, Goryo Chemical Inc., Hokkaido, Japonsko), 5 μM 2',7'-dichlórfluoresceín diacetát (DCFDA; 287810, Calbio-chem, San Diego, CA, USA）, 2 μM LysoSensorm Blue DND-167 (L7533, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a 1 μM Hoechst 33342 na vyšetrenie aktivity SA-gal, ROS, aktívnych lyzozómov a jadra. Zafarbené bunky boli namontované pomocou ProLongDiamond Antifade Mountant (P36965, Invitrogen) a zobrazené pomocou konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopu. Diferenciálne interferenčné kontrastné snímky sa získali použitím konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopu. 2.9. SA-Gal Activity Assay. {21}}jamková súprava na test starnutia buniek (CBA-213, Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA), podľa pokynov výrobcu.

2.10. Manipulácia s myšami a podávanie liečiv.

S myšami sa zaobchádzalo tak, ako je opísané vyššie [18] podľa smerníc Dankook Animal Ethics Committee (Dankook IACUC,18-026). C57BL/6] samcom myší vo veku 16 týždňov bol intraperitoneálne podaný rotenón (0 0,75 mg/kg telesnej hmotnosti) a MLi-2 (inhibítor kinázy LRRK2; 1 mg/kg telesnej hmotnosti) raz za dva dni počas dvoch týždňov.

2.11. Rotarodový test a príprava mozgového tkaniva.

V deň 14 po ošetrení boli myši umiestnené na otočnú tyč v tvare valca. Zaznamenal sa čas potrebný na pád na podlahu. Podrobnosti o skúške na rotarode sú opísané inde [18]. Ďalej boli myši usmrtené a transkardiálne perfundované ľadovo studeným HBSS obsahujúcim Ca2 a Mg. Stredný mozog bol vypreparovaný mikro nožnicami a pinzetou. Tkanivá boli lyzované v PBS obsahujúcom 1 percento Triton X-100, 1xXpert koktailový roztok inhibítora proteázy (P3100, GenDEPOT, Katy, TX, USA) a koktailový roztok lx Xpert inhibítora fosfatázy (P3200, GenDEPOT). Vzorky sa homogenizovali pomocou Pellet Pestle Cordless Motor (Sigma-Aldrich). Supernatant sa podrobil Western blotovaniu, testu SA-gal aktivity a enzýmovému imunosorbentnému testu (ELISA).

2.12. ELISA pre oligomérny -Syn.

Predtým sme vytvorili sendvičovú ELISA na analýzu fibrilárnych -syn oligomérov s použitím protilátky, ktorá rozpoznáva filamentóznu konformáciu -syn agregátov [17]. Surové lyzáty stredného mozgu sa podrobili testu ELISA a agregáty -syn sa kvantifikovali pomocou štandardov vlákien -syn.

2.13. Obrazové a dátové analýzy.

Intenzity PLA a farbenia živých buniek sa merali pomocou Zen 2012 (Carl Zeiss). Denzitometria cieľových proteínov sa uskutočnila pomocou

OBRÁZOK 1: Aktivácia kinázy LRRK2 indukovaná rotenónom podporuje starnutie buniek v diferencovanej bunkovej línii ľudského neuroblastómu. Analýza Western blotting dSH buniek ošetrených 1 uM rotenónom alebo 1 uM GSK2578215A (GSK-K), inhibítorom kinázy LRRK2, počas 48 hodín s použitím protilátok proti cieľovým proteínom (a). Hustoty proteínov boli normalizované na hustoty -aktínu (bg).n =3.(h) dSH bunky ošetrené 1 uM rotenónu alebo 1 uM GSK-KI počas 48 hodín boli podrobené testu proximity ligácie (PLA) fosfo-S1292 LRRK2 a celková IRRK2 (PIA-pS1292) a imunofluorescenčná (TF) analýza -galaktozidázy. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst 33342. Kontroly použité pri farbení PLA a IF odhalili platnosť výsledkov (pravé dva panely). Intenzity PLA-pS1292(i) a -galaktozidázy (j) boli normalizované na hodnoty 4',6-diamidino-2-fenylindolu.n{30}}; počet buniek{31}}.

Multi Gauge (Fujilm, Tokio, Japonsko). Všetky súbory údajov boli analyzované a graficky znázornené pomocou Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Údaje z experimentov uskutočnených s použitím dSH buniek a potkaních primárnych kortikálnych neurónov boli analyzované pomocou obojsmernej analýzy rozptylu (ANOVA), po ktorom nasleduje Bonferroniho post hoc test (n=3). medzitýmthe data obtained from mouse experiments, live-cell stain-ing,and PLA in the dSH cells were analyzed using two-way ANOVA, followed by Tukey's post hoc test (n>3). Všetky údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba priemeru. *p<><><><0.0001,and n.s.="not">

OBRÁZOK 2: Inhibítor kinázy LRRK inhibuje aktiváciu p53 v diferencovanej bunkovej línii ľudského neuroblastómu. (a) Zozbierali sa celobunkové lyzáty (20 percent), ktoré sa použili ako vstup pre imunoprecipitáciu (IP), a jadrová frakcia. Analýza odhalila, že 20 percent vstupu vykazovalo výsledky podobné tým, ktoré boli pozorované na obrázku 1. (b, c) IP vzorky boli denaturované a podrobené Western blottingu. Hladiny fosforylácie miesta TXR v p53 boli normalizované na celkové hladiny p53. n=3.(de)Celkové hladiny p53 v jadre boli skúmané pomocou Western blottingu. LaminB sa použil na normalizáciu hladín jadrového p53. n=3.(f) Hladiny mRNA p21 a pl6 v liečenej skupine boli normalizované na hladiny v skupine liečenej vehikulom-(dimetylsulfoxid-), n =3.

Tento článok je prevzatý zo zväzku Hindawi Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2021, ID článku 9969842, 16 strán https://doi.org/10.1155/2021/9969842