Vývoj vakcíny proti slintačke a krívačke a výzvy pri navodení dlhotrvajúcej imunity: trendy a súčasné perspektívy

Abstrakt:

Slintačka a krívačka (Slintačka a krívačka) je mimoriadne nákazlivé vírusové ochorenie hospodárskych zvierat spôsobené vírusom slintačky a myšieho rodu: aftovírus, ktoré má vážny ekonomický dopad na jednotlivých farmárov aj národné hospodárstvo. Mnohé pokusy vyvinúť vakcínu proti slintačke a krívačke zlyhali pri navodení sterilnej imunity. Klasické metódy výroby vakcín boli spôsobené selektívnou akumuláciou mutácií okolo antigénnych a väzbových miest. Reverzia pôvodcu pozitívnou selekciou a kvázi druhovým rojom, použitie tejto metódy nie je použiteľné pre použitie v neendemických oblastiach. Chemické zoslabenie pomocou binárneho etylénimínu (BEI) chránilo integritu kapsidy a vytváralo výraznú imunitu proti provokačnému kmeňu.

Slintačka a krívačka je vírusové ochorenie, ktoré postihuje imunitný systém zvieraťa. Vírus slintačky a krívačky môže napadnúť živočíšne bunky, zničiť bunkové membrány a vnútorné orgány, narušiť imunitnú funkciu zvierat a spôsobiť ich náchylnosť na infekciu inými patogénmi.

Vakcinácia vakcínou proti slintačke a krívačke zároveň môže zlepšiť imunitu zvierat a urobiť ich imúnnymi voči vírusu. Po úspešnom očkovaní si zviera vytvorí protilátky a keď bude opäť vystavené vírusu slintačky a krívačky, bude schopné rýchlo vyvolať imunitnú odpoveď, čím účinne zabráni vírusu v ďalšej infekcii a spôsobení ochorenia. prihodiť sa.

Preto je dôležitým prostriedkom prevencie slintačky a krívačky zlepšenie imunity zvierat, najmä očkovaním proti slintačke a krívačke. Vedecké riadenie kŕmenia a sanitácia a opatrenia na prevenciu epidémií môžu zároveň pomôcť znížiť šírenie vírusu a výskyt slintačky a krívačky. Z tohto pohľadu sa musíme zamyslieť nad tým, či ľudské telo potrebuje dbať na zlepšenie imunity. Cistanche dokáže výrazne zlepšiť ľudskú imunitu. Cistanche má aj antivírusové a protirakovinové účinky, ktoré dokážu posilniť schopnosť imunitného systému bojovať a zlepšiť obranyschopnosť organizmu.

Kliknite na výhody cistanche tubulosa

Pri vakcinácii zvierat sa skúšali vírusové antigény, ktoré boli chemicky syntetizované alebo exprimované vo vírusoch, plazmidoch alebo rastlinách. DNA vakcíny exprimujúce buď štrukturálne alebo neštrukturálne proteínové antigény boli skúšané na imunizáciu zvierat. Použitie interleukínov ako genetického adjuvans pre DNA vakcíny má sľubný účinok. Zatiaľ čo výzvy na vyvolanie sterilnej imunity spočívajú v neštrukturálnych (NS) proteínoch FMDV, ktoré sú zodpovedné za apoptózu dendritických buniek a majú negatívne účinky na lymfoproliferatívne reakcie, ktoré vedú k prechodnej imunosupresii. Okrem toho deštrukcia prenosu hostiteľského proteínu neštrukturálnymi proteínmi potlačila proliferáciu CD8 plus T-buniek. Tento prehľad sa pokúsil riešiť viaceré prístupy k testom vývoja vakcín a prekážky pri vytváraní sterilnej imunity.

Kľúčové slová:

Vakcína FMD, dlhotrvajúca imunita, sterilná imunita.

Pozadie

Slintačka a krívačka (FMD) je extrémne nákazlivá vírusová infekcia hospodárskych zvierat spôsobená vírusom slintačky a myši, rod: Aphthovirus a čeľaď Picornaviridae; čo spôsobuje vážne ekonomické straty.1,2 Domáce a voľne žijúce kopytníky sú veľmi postihnuté slintačkou a krívačkou.3–5 Protoméry 5S sú spontánne produkované jednotlivými zrelými proteínmi; VP1, VP3 a VP0, z ktorých päť sa skladá do 12S pentameru. Zatiaľ čo vírusová kapsida 75S je tvorená spojením 12 pentamérov,6,7 sa uvádza, že antigén 146S kompletného vírusu slintačky a krívačky (FMDV) má veľmi podobnú antigénovú špecificitu ako vírusová kapsida.8,9 - vírus ústnej choroby má široký rozsah hostiteľov, vysokú mieru genetických variácií a veľké antigénne rozdiely a má sedem sérotypov (A, O, C, Asia1, SAT1, SAT2 a SAT3) a viac ako 100 sérosubtypov.10 Kvôli kvázi druhovému rojeniu sa každoročne objavuje aj mnoho nových variantov. Sedem sérotypov nevyvoláva skríženú imunitu. Existuje tiež len čiastočná skrížená imunita medzi rôznymi podtypmi rovnakého sérotypu.11 Variabilita a polymorfizmus FMDV veľmi sťažili prevenciu a kontrolu FMDV.10 Adenovírusový rekombinantný FMDV exprimujúci proteíny P12A a 3C rôznych sérotypov vykazovali ochranný účinok.12–14

Klasické inaktivované vakcíny majú mnoho nedostatkov, vrátane tepelnej nestability, krátkodobej imunity, vysokej ceny, rizika rekombinácie s divokými kmeňmi a reverzie patogenity.11,15,16

Napriek 90-ročnému výskumu neexistuje žiadna účinná vakcína, ktorá by vytvorila sterilnú a solídnu imunitu pre slintačky a krívačky, ale choroba zostáva enzootická vo veľkých oblastiach zemegule. Mnohé pokusy vyvinúť vakcínu proti slintačke a krívačke zlyhali pri indukcii sterilnej imunity s malou skríženou sérotypovou ochranou a nedostatočným trvaním imunity.17 Klasické metódy výroby vakcín, ako je sériové pasážovanie vírusu na bunkovej kultúre,18 v nepermisívnych zvieratá a jeho prirodzený hostiteľ boli schopní vírus oslabiť. Je to spôsobené selektívnou akumuláciou mutácií okolo antigénnych a väzbových miest.19–21 Použitie reverzie agens pozitívnou selekciou a metódou kvázi-druhového roja je však nepoužiteľné pre použitie v neendemických oblastiach.22 DNA resp. proteínové technológie zlepšili výskum modifikáciou integrínových receptorov23 s využitím syntetických peptidov, ktoré môžu byť schopné vyvolať explicitnú imunitnú odpoveď u zvieraťa.24 Epitopy T-pomocných buniek vlastné oblasti G–H slučky sú silné epitopy B-buniek, ktoré indukujú humorálnu imunitu.25 Použitie rekombinantného interferónu (IFN) a bovinného interleukínu 18 (IL-18) ako adjuvans zvýšilo dlhodobú imunitu u laboratórnych zvierat.26,27

Rekombinantné živé vektorové DNA vakcíny sú v poslednej dobe účinnými induktormi cytotoxických T lymfocytov (CTL),28,29 Na vyjadrenie tohto účinku u slintačky a krívačky je potrebné vhodné adjuvans.30 Na prekonanie tohto účinku rekombinácia hostiteľskej Ig nadrodiny a epitopu slintačky a krívačky zlepšila humorálny a bunkovej imunitnej odpovede zvieraťa.

Problém úzkych miest pri navodení sterilnej a dlhotrvajúcej imunity je brzdený deštrukciou prenosu hostiteľského proteínu neštrukturálnymi (NS) proteínmi, najmä 3A, takže nevyvoláva klastrovú diferenciáciu 8 pozitívnu (CD8 plus ) reakciu T-buniek v dôsledku slabé CTL a vírus pretrváva vo zvierati.31 Integrínové receptory, ktoré sprostredkúvali apoptózu dendritických buniek (DC) derivovaných z kostnej drene, bránili vrodenej imunite hostiteľa.32 Guzman a kol.33 a Joshi a kol.34 analyzovali náhradné reakcie na zabíjanie CTL, ako je proliferácia alebo produkcia IFN bunkami exprimujúcimi CD8, ale mnohé lymfocyty exprimujúce CD8 plus, ktoré nie sú CTL, produkujú IFN, vrátane prirodzených zabíjačov (NK) buniek a podskupín gama delta (5) T-buniek. 35–37

Podľa Oha et al.38 IFN-reakcia môže byť restimulovaná u vakcinovaného dobytka, u ktorého sa v deň expozície prejavila vysoká hladina titra protilátok neutralizujúcich vírus v obehu, čo má priamy vzťah k vakcínou indukovanej ochrane s IFN - a neutralizačná protilátka. Okrem toho sú CD4 plus T-bunky hlavným prosperujúcim fenotypom a bunkami produkujúcimi IFN. Pri prirodzenej infekcii sa však vyskytla lymfopénia, ktorá sa prekrývala s maximálnou virémiou a sérovou odpoveďou IFN-, zatiaľ čo počet plazmocytových DC (pDC) in vivo a sekrécia pDC IFN- in vitro krátko klesali do 2 dní od infekcie.39 Produkcia IFN- z DC derivované z monocytov (MoDC) a DC derivované z kože (kožné DC) je inhibované v akútnej fáze infekcie ošípaných.40 Vyskytla sa tiež indukcia apoptózy v nezrelých dendritických bunkách pomocou FMDV.32 Na prekonanie imunitnej patogenézy vírusu zvýšením produkcie protilátok a proliferácie T-buniek sa syntetickými oligonukleotidmi ako adjuvansom pre slizničné vakcíny dosiahli vyššie úrovne aktivity CTL a expresie IFN- v CD8 T-bunkách.41 Hlavným cieľom tejto práce je zhodnotiť trendy vo vývoji vakcíny proti slintačke a krívačke. výzvy na vyvolanie sterilnej a dlhodobej imunity.

Atenuovaná a inaktivovaná vakcína

Uskutočnilo sa veľa pokusov zlepšiť živé oslabené vakcíny slintačky a krívačky konvenčnými metódami, ako je sériové pasážovanie u nepermisívnych zvierat alebo bunková kultúra. Zoslabenie sa dosiahlo pasážovaním u necitlivých druhov, ako sú myši, králiky a embryonované vajíčka, až kým nestratili virulenciu u hovädzieho dobytka. Sériové pasáže FMDV C-S8c1 pri vysokej multiplicite infekcie v bunkovej kultúre viedli k defektnému genómu (C-S8p260), ktorý bol pre myši úplne ochranný proti letálnej expozícii FMDV C-S8c1 a bezpečný pre ošípané po vakcinácii jednou dávkou C-S8p260.42 Tiež indukoval vysoké titre neutralizačných protilátok a aktivoval T-bunky u ošípaných.42

Sériový kontaktný prenos vysoko patogénneho izolátu O Taiwan 97 adaptovaného na ošípané u ošípaných významne znižuje virulenciu po 14. pasáži ošípaných a ruší ju po 16. pasáži.43 Zmeny aminokyselín počas in vivo pasáží boli veľmi tiché substitúcie a zmeny vo VP1 (1D) boli prechodné. Vyvinutie vakcíny proti slintačke a krívačke v nepermisívnych hostiteľoch môže spôsobiť, že agens použije iné bunkové receptory ako Arg-GlyAsp (RGD), plakový test v teste BHK 21 sa môže ukázať ako negatívny, kým je vírus neporušený.43 Náhrada aminokyseliny postranné reťazce umiestnené v blízkosti medzipodjednotky kapsidy inou aminokyselinou by mohli vytvoriť nové disulfidové väzby alebo elektrostatické interakcie medzi rozhraniami podjednotiek a je buď projektované, alebo iniciované ako postradateľné na infekciu zvýšením tepelnej tolerancie vakcinačných kmeňov44 použitím súčasných postupov vakcín proti slintačke a krívačke ktoré sa menej spoliehajú na ideálny chladiaci reťazec. Kmene FMDV C-S8p260 sú segmentované a replikačne kompetentné, čo môže poskytnúť základ pre oslabenie vakcín s dvomi bezpečnostnými bariérami.45

Väčšina výskumov ukazuje, že inaktivácia FMDV na zvieracom modeli pomocou substitúcie aminokyselín v 2C nebola detegovateľná v C-S8c1, ale bola prítomná v malom podiele FMDV adaptovaného na morčatá.46 Táto substitúcia aminokyselín sa vo vírusovej populácii rýchlo stala prevažujúcou po opätovné zavedenie vírusu adaptovaného na morčatá do ošípaných. Tieto zistenia ukazujú, ako môže zavedenie menšinových variantných vírusov do umelého hostiteľa nadobudnúť svoju dominanciu, keď je pôvodný druh hostiteľa reinfikovaný.47 Okrem tejto pozitívnej selekcie a kvázi-druhového rojenia sa vakcinačný kmeň môže zmeniť na patogénny kmeň. 22

Inaktivácia vírusu pomocou formalínu a endonukleázy nedokáže inaktivovať vírus a degradovať antigénne miesta.48 Binárny etylénimín (BEI) sa tiež použil na oslabenie vírusu pri zachovaní integrity kapsidy.15,49 BEI- inaktivované bunkové receptory FMD, integríny, sa používajú na pripojenie a internalizáciu do kultivovaných buniek, interakcia je sprostredkovaná aminokyselinovým zvyškom umiestneným v GH slučke kapsidového proteínu VP1.49 FMDV-špecifické monoklonálne protilátky alebo syntetický peptid preukázali väzbu BEI- inaktivované slintačky a krívačky boli internalizované ich spoločnou lokalizáciou s markerovým proteínom do BHK-21 sprostredkovanou motívom viažucim integrín RGD.50 Okrem toho inaktivácia BEI neovplyvňuje antigenicitu slučky GH.20,51 Inaktivácia BEI, zachovaná architektúra viriónu a receptory podporujúce internalizáciu vírusu do kultivovaných buniek, ako aj in vivo, sú sprostredkované rozpoznávaním integrínu,47,52,53 avšak kvantifikácia celého vírusu vykazuje minimálny výsledok v porovnaní s formalínom inaktivácia (65–71,6 percenta), zatiaľ čo inaktivácia BEI je 44,2 percenta .49

Postupné pasážovanie FMDV typu C z ošípaných a morčiat a udržiavané u ošípaných a dojčiacich myší vedie k zámenám aminokyselín (I2483T v 2C, Q443R v 3A a L1473P vo VP1). Nahradená aminokyselina (L1473P), vedľa motívu RGD viažuceho integrín, zrušila rast vírusu v rôznych bunkových líniách a zmenila jeho antigenicitu.47 Ďalšia štúdia vykonaná Burmanom a spol.20 odhalila, že zmena jedinej aminokyseliny v RGD plus 1 a RGD plus 4 miesta inhibujú pripojenie vírusu a infekciu uľahčenú v 6 alebo v 8, ale vírus využíva v 3 na pripojenie bunky. Náhrady metionínom alebo arginínom na väzbovom mieste sú účinnými inhibítormi pre v 6. Dva leucínové zvyšky na miestach RGD plus 1 a RGD plus 4 stabilizovali väzbu závislú od štruktúry bezprostredne C-terminálnej k RGD. v 6 je charakteristickým znakom a predpokladalo sa, že stabilný komplex s jeho bunkovým receptorom bude produkovať značne vysokú infekčnosť FMDV.21

Substitúcia alanínu leucínmi na prvej a štvrtej pozícii na miestach RGD plus 1 a RGD plus 4 vedie k inhibícii väzby vírusu a prichytenia vírusu na v 6 alebo v 8. Vírus však využíva v 3 na vstup do bunky.20 kmene prispôsobené bunkovej kultúre používajú heparánsulfátové proteoglykány (HSPG) ako alternatívny receptor. Potvrdenie ich ektodomén a ligand-väzbového stavu integrínov je dôležitým faktorom pre tropizmus pre vírusy.54

Vírusy viažuce heparan sulfát internalizovali DC účinne, ale neprezentovali antigén lymfocytom, čím vyvolali odpoveď IgG špecifickú pre FMDV.55 Tieto výsledky ukazujú, že internalizácia FMDV DC je najúčinnejšia pre vírusy vakcíny s väzbovou kapacitou HS, ale väzba HS nie je výhradná požiadavka.

Selektívny tlak vyvíjaný humorálnou imunitnou odpoveďou hostiteľa má dôležitú úlohu pri selekcii aj stabilizácii antigénnych variantov FMDV, čo vedie k zmene bunkového tropizmu. Testy in vitro odhalili, že paralelné pasážovanie FMDV v prítomnosti sub-neutralizujúceho homológneho séra viedlo k zachovaniu mutantov.56 Avšak množenie FMD typu A24, ktoré obsahovalo sekvenciu SGD vo väzbovom mieste bunkového receptora, bolo naočkované u hovädzieho dobytka. , vírus rástol zle v BHK-21 bunkách a sekvencia bola stabilne udržiavaná počas propagácie v BHK{5}} bunkách exprimujúcich hovädzí integrín V 6 (BHK3 V 6), ako aj u experimentálne naočkovaného a kontaktného dobytka .56

Z dvoch nezávislých prenosových reťazcov u hovädzieho dobytka existujú genómové zmeny v dôsledku postupného prechodu na BHK-21-bunke adaptovaného (heparan sulfát viažuceho) kmeňa FMDV. Variant divokého typu s aminokyselinovou mutáciou na VP1 356 bol rýchlo vybraný na in vivo vírusovú replikáciu.57

Delečné gény kódujú NS proteín, ktorý nie je rozhodujúci pre replikáciu vírusu in vitro, je alternatívnou technikou na generovanie živých atenuovaných vakcín. Aby bol tento vírus použiteľný ako vakcína, musí byť stále schopný replikovať sa vo vnímavých zvieratách. Výhodou tohto prístupu v porovnaní s klasickou metódou atenuácie, ktorá vo všeobecnosti zavádza mutácie na obmedzenom počte miest, je, že riziko reverzie k virulencii je výrazne znížené58 a NS proteíny sú silnými epitopmi T-buniek.59

Účinok bol preukázaný u geneticky modifikovaných vakcinačných kmeňov FMDV s určitými náhradami aminokyselín na antigénnych miestach, s podobnými rastovými vlastnosťami ako divoký vírus, ktorý plne chráni zviera pred napadnutím, ale má schopnosť replikovať sa in vitro.60

Núdzová vakcína s dvojitým olejovým adjuvantom slintačky a krívačky preukázala zníženie virémie a tieňovania vírusov a nevykazovala žiadne klinické príznaky. U očkovaných zvierat bola konzistentná detekcia IL-6, IL-8 a IL-12.61 Zatiaľ čo iné cytokíny IL-1, IL-2, TNF TGF a interferóny neboli detegované; to ukazuje, že vakcína nevyvolala systémovú zápalovú odpoveď, ako aj systémové zvýšenie aktivity T lymfocytov, čo súvisí s krátkodobou ochranou proti slintačke a krívačke.61

Rekombinantný ľudský IL-2 je silný humorálny induktor imunity v myšom modeli vakcíny slintačky a krívačky.62 Vakcinované zvieratá zostávajú pozitívne na sérokonverziu počas 7–8 mesiacov a systémové hladiny cytokínov (IL-6, IL{{5 }} a IL-12) sa po očkovaní zvýšili.63

Prázdne vírusové kapsidy

Prázdne vírusové kapsidy, tiež známe ako častice podobné vírusom (VLP), obsahujú celý repertoár imunogénnych miest nachádzajúcich sa na intaktných vírusoch, ale postrádajú infekčné nukleové kyseliny a zahŕňajú klonovanie vírusového genómu nevyhnutného pre syntézu, spracovanie a zostavenie vírusu. štrukturálne proteíny na prázdne vírusové kapsidy (gény kódujúce P1-2A a 3Cpro; obrázok 1).64 Prázdne kapsidy sa prirodzene produkujú in vitro v bunkovej kultúre, sú antigénne podobné a sú imunogénne.65

Použitie vakcíny s prázdnou kapsidou je sľubným kandidátom, pretože obchádza použitie vírusu pri výrobe vakcín a zachováva konformáciu epitopov.45 Okrem toho neexistuje riziko reverzie vírusu a rekombinácie s divokými kmeňmi. Na prechodnú génovú expresiu (TGE) rekombinantných prázdnych kapsidov FMDV sa použili bezsérové ​​bunky cicavcov rastúce v suspenzii.66 Identifikácia očkovaných z infikovaných alebo rekonvalescentných zvierat je jednoduchá pomocou v súčasnosti dostupnej technológie.67–69

Podjednotková vakcína

Podjednotková vakcína obsahuje vírusové antigény zozbierané chemickou extrakciou alebo bioexpresiou minimálneho množstva nevírusových antigénov v kultivačnom médiu.70 Výskumníci odhalili, že VP1 je jeden z kapsidových proteínov FMDV, ktorý bol v 70. rokoch minulého storočia značne vystavený povrchovej expozícii. a najnovšie pokroky v štrukturálnej virológii.71

Genetické inžinierstvo sa použilo na mutáciu častí genómu alebo zrušenie oblasti VP1 kódujúcej proteín v nedávnych pokusoch o vytvorenie oslabených vakcín. Pomocou rekombinantnej DNA sa skonštruoval vírus s väzbovým miestom RGD receptora na VP1 odstránením FMDV.72 U 7- až 10-dňových myší alebo ošípaných tento vírus nebol schopný priľnúť k bunkám a nedržal sa vyvolať infekciu.73

Kapsidový proteín VP1 FMDV a karboxy-terminálna oblasť VP1 má G–H slučku, ktorá je vysoko imunogénna, zodpovedajúca B-bunkovým epitopom. Chemicky syntetizovaný peptid pozostávajúci z oblastí (zvyšky 141 až 158) vírusového obalového proteínu (VP1) z FMDV sérotypu O vyvolal vysoké hladiny neutralizačných protilátok a chránil dobytok pred intradermolinguálnou inokuláciou infekčného vírusu24, čo naznačuje dôležitosť G. –H slučka pri indukcii humorálnej imunitnej odpovede. VP1 tiež obsahuje hypervariabilnú oblasť a imunogénne miesto; využitie miesta by bolo základom pre širokú imunogenicitu.74

Začlenenie IFN ako genetického adjuvans viedlo k oneskorenému nástupu klinických príznakov a nástupu virémie.75 Rekombinantný bakulovírus priadky morušovej, ktorý kóduje P1-2A a 3C proteázu FMDV Asia 1, bol schopný produkovať špecifické protilátky u očkovaných zvierat a chránených po infekcii virulentným homológnym vírusom a klinické príznaky boli zmiernené a oneskorené.64

Bola indukovaná jedna dávka defektného adenovírusu 5 (Ad5) obsahujúceho P1 a 3C kódujúcu oblasť sérotypu A FMDV (Ad5A24), ktorá neutralizovala protilátky a chránila ošípané pred homológnou expozíciou.76 Účinok na bunkovú imunitu sa však neskúmal. .

Pre expresiu prázdnych kapsidov A-sérotypu riadenú vírusom vakcínie aj bakulovírusom; obsahujúca racionálne navrhnuté mutácie, stabilita sa zvýšila v eukaryotických bunkách.77 Tento spôsob výroby vakcinačného antigénu má niekoľko perspektívnych výhod oproti súčasným technológiám z hľadiska výrobných nákladov, rizika infekcie a termotolerantnej vakcíny.45

Vektor ľudského adenovírusu typu 5 exprimujúci kapsidový proteín (P1-2A a mutovanú vírusovú 3C proteázu) poskytuje významnú humorálnu, bunkovú a slizničnú imunitu vyvolanú u BALB/c myší. Vakcinácia morčiat vyvolala značné neutralizačné protilátky a protilátky anti-FMDV imunoglobulínu A (IgA) so 100-percentnou ochranou morčiat pred infekciou.78

Rekombinantný psí adenovírus typu 2 (CAV2) exprimujúci kapsidové proteíny (P1/3C) (obrázok 1) bol schopný spustiť silnú humorálnu imunitnú odpoveď u morčiat. Avšak proteín VP1 exprimujúci psí adenovírus typu 2 (CAV2) nevyvolal pretrvávajúcu protilátkovú odpoveď u morčiat alebo myší.79

Ošípané očkované adenovírusom 5 s cytomegalovírusovým zosilňovačom kódujúcim A24-2B (Ad5-CI- A24-2BC) dosiahli maximálnu odpoveď neutralizujúcich protilátok o 7–14 dpv a vyvolali vyššiu produkciu IgM pri 7 dpi.14 Modifikovaný cytomegalovírusový promótor zvýšil účinnosť vektora a pokročil k zvýšeniu bunkovej infekcie v bunkovej kultúre, skupina dostávajúca vakcínu bola po stimulácii úplne chránená.14

Intramuskulárna inokulácia myší rekombinantmi, rekombinantným kapsidovým proteínom bakulovírusu FMDV klonovaným s okamžitým skorým zosilňovačom cytomegalovírusu ako promótorom (CMV-IE) a oblasťou kódujúcou imunogén T-buniek s epitopmi T-buniek, boli účinne indukované neutralizačné protilátky a gama interferón ( IFN-).80 P1- 2A a 3C kódujúce oblasti FMD sérotypu A exprimované v kuklách priadky morušovej (Bombyx mori) boli schopné indukovať vysoké titre špecifických protilátok a boli úplne chránené proti napadnutiu virulentným homológnym vírusom.81

Viacnásobný antigénny peptidový systém je vysoko imunogénny v porovnaní s jednoduchým lineárnym peptidom vakcinačných antigénov slintačky a krívačky.82 Syntetické dendrimérne peptidy, ktoré obsahujú dve kópie hlavného antigénneho miesta B-buniek FMDV [VP1 (140–158)], kovalentne spojené do heterotypického antigénneho miesta T-buniek z neštrukturálneho proteínu 3A [3A (21–35)], preukázalo sa, že chráni ošípané pred napadnutím vírusom.83 Dendrimérový peptid reprodukujúci heterotypický a vysoko konzervovaný FMDV 3A (21–35) Epitop T-buniek tiež zlepšil reakcie neutralizujúcich protilátok a IFN-.84 U 70 percent ošípaných očkovaných B2T bola pozorovaná úplná ochrana – žiadne klinické príznaky ochorenia – po stimulácii vírusom na 25. deň po imunizácii.84

DNA vakcíny

Vnútorné miesto vstupu ribozómu (IRES) vírusu encefalomyokarditídy (EMCV) bolo odstránené a gén L, ktorý sa podieľa na uzatváraní buniek proteolýzou eIF46,85, bol odstránený a EMCV IRES, o ktorom sa preukázalo, že zvyšuje účinnosť expresie, bol odstránený. bola vložená upstream od P1 sekvencií.86 DNA vakcína kódujúca P1-2A a GM-CSF ako adjuvansom indukovaná robustná FMDV špecifická a neutralizujúca protilátka, ako aj indorujúce cytokíny IL-8 a produkcia IFN u ošípaných.87

DNA vakcíny založené na vírusových mini génoch zodpovedajúcich trom hlavným B- a T-bunkovým FMDV epitopom VP1 (sekvencia aminokyselín 133–156)-3A (sekvencia aminokyselín 11–40) a VP4 (20–34) chrániť myši, v neprítomnosti špecifických protilátok v čase provokácie.88

Intranazálne podanie FMDV DNA vakcíny; použitie chitosanu ako transportného vehikula a IL{0}} ako molekulárneho adjuvans vyvolalo slizničnú a systémovú imunitnú odpoveď so zvýšenou imunitou sprostredkovanou bunkami (CMI), čo dokazuje vyššia úroveň proliferácie T-buniek, odpoveď CTL, a expresiu IFN- v CD4 plus aj CD8 plus T-bunkách. 73

U myší očkovaných plazmidom exprimujúcim VP1 a IL9 ako genetickým adjuvans a so spusteným antiapoptóznym mechanizmom sa vyvinula silná humorálna odpoveď, vysoká hladina IFN- a perforínu v CD8 plus T-bunkách, ale nie s IL{{6} } v týchto T-bunkách. IL-9 upreguloval expresiu génu Beclin a zabránil apoptóze T-buniek.89

Ďalšia štúdia odhalila, že VP1 DNA vakcína exprimujúca interleukín-6 a IFN- použitá ako molekulárne adjuvans zlepšila antigénovo špecifické bunkami sprostredkované reakcie. Vyvolal tiež vysoký titer IgG2a/IgG1, IFN-, IL-4 a dozrievanie dendritických buniek.90

Pri použití IL-2 ako genetického adjuvans v kódovaní DNA vakcíny musia dva epitopy FMDV VP1 (aminokyselinové zvyšky 141 – 160 a 200 – 213) obsahujúce viaceré epitopy vyvolať proliferáciu T-buniek aj neutralizačné protilátky proti FMD u ošípaných pomocou IL-2 ako genetického adjuvans.91,92

Ošípané imunizované anti-FMDV DNA vakcínovým plazmidom kódujúcim P1-2A3C3D a plazmidom exprimujúcim prasací „B-bunkový aktivačný faktor patriaci do TNF rodiny“ (BAFF) podporovali aktiváciu dozrievania B-buniek a zmenu imunoglobulínových tried.93

DNA vakcína založená na replike s pravidelným posilňovaním ponúka účinnú očkovaciu stratégiu proti FMDV.94 Začlenenie rôznych antigénnych cieľov do DNA vakcín je dokonalý spôsob, ako vytvoriť antigénový koktail v jedinej vakcínovej formulácii. Myši imunizované tromi plazmidmi kódujúcimi antigén vírusu slintačky a krívačky (FMDV), vírusu pseudobesnoty (PRV) a vírusu klasického moru ošípaných (CSFV) ukázali sľubné výsledky.95

Intramuskulárna inokulácia morčiat DNA plazmidmi exprimujúcimi FMDV obsahujúcimi signálnu sekvenciu naočkovaného génu prasacieho IgG ukázala neutralizačnú protilátkovú odpoveď a proliferácia slezinných buniek sa po boostingu zvýšila, ale zvieratá neboli chránené pred vírusovou infekciou.96

DNA vakcína kódujúca epitop T-buniek a epitopy B-buniek z miest 135-167 VP1 a miesto 1 zahŕňa oblasti 141-160 (G-H slučka) a karboxylový koniec VP1 FMDV typu O vyvolali silnú bunkovú imunitnú odpoveď. ako bolo pozorované pomocou testu proliferácie T-buniek.97

Intranazálne podanie FMDV DNA vakcíny kódujúcej kapsidový proteín, katiónový PLGA (poly(laktid-ko-glykolid) ako vehikulum a hovädzí IL-6 ako genetické adjuvans preukázalo zvýšenú slizničnú a systémovú imunitnú odpoveď u očkovaných zvierat.98

DNA vakcína exprimujúca kapsidový proteín (P1-2A, 3C a 3D) aktivovaná pGM-CSF a posilnená inaktivovaným antigénom FMDV vykazovala podstatnú úroveň skríženej sérotypovej reaktivity u vakcinovaných ošípaných. Významná úroveň skríženej sérotypovej reaktivity bola hlásená proti A, C a Asia1 v testoch neutralizácie vírusu a ELISA.99 Avšak DNA vakcína exprimujúca proteín VP1 a produkujúca antisense RNA zameraná na 5ʹUTR FMDV vyvolala špecifickú imunitnú odpoveď u očkovaných myši.72

DNA vakcína exprimujúca VP1 spolu s IL-15 (molekulárne adjuvans) posilnila mukozálny sekretovaný IgA a sérový IgG a bunkami sprostredkovanú imunitu (CMI), čo dokazujú vyššie hladiny proliferácie antigén-špecifických T-buniek, cytotoxických T-lymfocytov (CTL) odpoveď a vyššia expresia IFN- v CD4 plus aj CD8 plus T-bunkách informujúcich slezinu a mukózne miesta.73

Rekombinantné vakcíny sa vyrábajú rekombináciou hostiteľskej Ig superrodiny a vírusové epitopy zlepšili humorálnu a bunkovú imunitnú odpoveď očkovaných zvierat. RNA vakcíny sú silnými prepínačmi triedy IgG, okrem toho sa u očkovaných myší pozoroval aj vysoký titer IgM.100 Plazmidová DNA obsahujúca epitopy FMDV má ideálnu distribúciu v tkanivách u myší.101

Výzvy pri indukcii dlhotrvajúcej imunity

Existuje významná zmena subpopulácií T-lymfocytov, funkčnej kompetencie a hojnosti po infekcii rôznymi sérotypmi FMDV.102 Do 48 hodín po infekcii (pi) dochádza k down-regulácii boCD4 plus a boCD8 plus T-buniek. Avšak down-regulácia boWC1 plus T-buniek sa pozoruje až do 48 hp s FMDV sérotypom O. Lymfocyty z očkovaných zvierat demonštrovali významnú up-reguláciu boCD4 plus, boCD8 plus a boWC1 plus T-buniek po expozícii FMDV. 102

Po prirodzenej infekcii dochádza k významnému zvýšeniu expresie proteínu 3A-NS v lymfocytoch rôznych v rôznych priebehoch ochorenia, čo vedie k prechodnej imunosupresii CD4 plus a CD8 plus T-buniek. 34

Deštrukcia prenosu hostiteľského proteínu proteínmi NS, najmä 3A, úplne naruší, takže nevyvolá odpoveď CD8 plus T-buniek,31 V dôsledku slabého CTL vírus pretrvával vo zvierati. Integrínové receptory sprostredkovávajú apoptózu DC odvodenú od kostnej drene, čím bránia vrodenej imunite hostiteľa.32 Ďalším dôležitým fenoménom, ktorý zasahuje do imunity hostiteľa, je Lbpro, vysoko konzervovaná doména, ktorá hrá dôležitú úlohu inhibíciou ubikvitinácie kľúčových signálnych molekúl pri aktivácii typu I IFN odpoveď, ako je gén I indukovateľný kyselinou retinovou (RIG-I), TANK-viažuca kináza 1 (TBK1), faktor 6 spojený s TNF receptorom (TRAF6) a TRAF3.103 To znižuje úroveň okamžitej a skorej iniciácie IFN mRNA a IFN stimulované génové produkty.102 Okrem toho 3Cpro blokuje intra-Golgiho transport degradáciou proteínu potrebného na intra-Golgiho transport.

Guzman et al33 a Joshi et al34 analyzovali náhradné reakcie na zabíjanie CTL, ako je proliferácia alebo produkcia IFN bunkami exprimujúcimi CD8, ktoré boli hlásené, ale mnoho lymfocytov exprimujúcich CD8 plus, ktoré nie sú CTL, ktoré produkujú IFN, vrátane NK buniek a podskupín ô T -bunky. 35–37,39,104

Aktivita CTL vyhodnotená 10 dní po stimulácii s Ad5-FMDV-3C indikovala významné zvýšenie aktivity CTL 10 dní po stimulácii v porovnaní s úrovňami posilňovania, ale vrátila sa na základné úrovne o 17 dní po 17 Pokus o vyhodnotenie aktivity CTL na 4. deň však zlyhal pri získaní dostatočného množstva buniek. Bolo to spôsobené lymfopéniou a imunopatológiou vyvolanou FMDV. Okrem poklesu dlhodobej perzistencie vírusu slintačky a krívačky existuje pozitívna súvislosť medzi odpoveďou na IFN a ochranou vyvolanou vakcínou.38

Podľa Oha a kol.38 sú CD4 plus T-bunky hlavným fenotypom množenia a bunkami produkujúcimi IFN.

Bez ohľadu na sérotyp FMDV, sérový IFN- dosiahol vrchol 2–3 dni po infekcii, lymfopénia zodpovedala maximálnej virémii a sérovej IFN-odpovedi a počtu dendritických buniek (pDC) cirkulujúcich plazmocytov a in vitro produkcia pDC IFN- prechodne klesla po 48 hodinách. Bez ohľadu na injikovaný sérotyp FMDV alebo vek postihnutého zvieraťa sa infekcia lymfocytov alebo pDC nikdy nenašla.39

Tvorba IFN- z DC odvodených od monocytov (MoDC) a DC derivovaná z kože (DCs kože) je potlačená počas akútnej fázy infekcie ošípaných. Tento vplyv nastáva v tandeme so zvýšenými vírusovými titrami v krvi, ale tieto bunky nie sú produktívne infikované. Je zaujímavé, že kapacita týchto DC prijímať častice a spracovávať antigény sa nemení, čo dokazuje, že antigény neovplyvňujú ich schopnosť pohlcovať častice a spracovávať antigény.35

Záver

Na základe uvedenej literatúry a medzery vo výskume predkladá nasledujúce odporúčania. Mala by sa študovať bunková internalizácia, glykozylačný vzor, ​​prezentácia antigénu a mechanizmy pozitívnej selekcie (vývoj patogénneho kmeňa) tradičných vakcín. CD8 plus T CMI vyvolané vakcínou posilňuje dlhotrvajúcu imunitnú odpoveď a krížovú ochranu. V imunitnej patogenéze, perzistencii a produkcii CTL zohrávajú úlohu receptory ô T-buniek, ktoré by sa mali dôkladne študovať. Rekombinantný proteín s použitím prietokového cytometra a ELISpot ELISA na analýzu internalizácie vakcínových častíc, prezentácie antigénu a hodnotenie krížovej komunikácie buniek prezentujúcich antigén.

Mali by sa vyvinúť nové webové nástroje, ktoré ukážu účinky bočných reťazcov na epitop B- alebo T-buniek. Malo by sa jednoznačne hľadať použitie zvieracích modelov infekcie a vývoja vakcín a testov účinnosti, pretože medzi laboratórnymi zvieratami a ošípanými a prežúvavcami existuje značný rozdiel v receptoroch integrínu. Výpočtový odhad CTL epitopov v celom genóme integráciou nástrojov na odhadovanie epitopov pri výpočte veľkého počtu vírusových sekvencií a následného hodnotenia in vivo má veľkú výhodu pri výrobe vakcín s dlhotrvajúcou ochranou a schopnosťou krížovej ochrany.

Skratky

3A, neštrukturálny proteín; Ad5, adenovírusový 5 vektor; 3Cpro, 3C proteáza (neštrukturálny proteín); BEI, binárne etylénemíny; BHK bunka, obličková bunka mláďat škrečkov; CD4 plus, klastrový diferenciačný faktor štyri pozitívne; CD8 plus, klastrový diferenciačný faktor osem pozitívny; cDNA, komplementárna DNA; CTL, cytotoxické T-bunky; DC, dendritická bunka; ELISA, Enzyme linked Immunosorbent assay; FMD, slintačka a krívačka; FMDV, vírus slintačky a krívačky; GM-CSF, granulocyty a monocyty faktor stimulujúci kolónie; IFN-, interferón alfa; IFN-, interferón gama; Ig, imunoglobulín; IL, interleukín; LTR, dlhé koncové opakovanie; NK bunky, prirodzené zabíjačské bunky; NS proteín, neštrukturálny proteín; P1-2A, gén pre štrukturálny proteínový prekurzor; P1-2A3C3D, vírusový štrukturálny proteínový prekurzor P1–2A a neštrukturálne proteíny 3C a 3D; PBMC, mononukleovaná periférna krv; RT-PCR, reverzná transkripčná polymerázová reťazová reakcia; SAT, juhoafrický typ; TGE, prechodná génová expresia; TGF, nádorový rastový faktor; TNF, faktor nekrózy nádorov; Th bunky, T pomocné bunky; VP1, vírusový proteín 1; 5 T bunky, gama delta T bunky.

Vyhlásenie o zdieľaní údajov

Údaje použité v tomto prehľade sú sekundárne a sú zahrnuté v článku.

Poďakovanie

Som veľmi vďačný kancelárii viceprezidenta pre výskum a komunitné služby Univerzity v Gondare za poskytnutie materiálov a finančnú podporu. Ďakujem tiež Kolégiu veterinárneho lekárstva a živočíšnych vied, University of Gondar, za ďalšiu podporu zariadenia.

Financovanie

Autor ďakuje kancelárii viceprezidenta University of Gondar, Research and Community Service.

Zverejnenie

Autor vyhlasuje, že v tejto práci nie sú žiadne konflikty záujmov.

Referencie

1. Kitching P, Hammond J, Jeggo M, et al. Globálna kontrola FMD – je to možnosť? Vakcína. 2007;25(30):5660–5664. doi:10.1016/j. vakcína.2006.10.052

2. Raza S, Siddique K, Rabbani M, a kol. Mikrobiálna patogenéza in silico analýza štyroch štruktúrnych proteínov aftovírusových sérotypov odhalila významné B a T bunkové epitopy. Microb Pathog. 2019;128 (august 2018):254–262. doi:10.1016/j.micpath.2019.01.007

3. Arzt J, Belsham GJ. Prenos slintačky a krívačky z perzistentne infikovaného hovädzieho dobytka na naivný dobytok prenosom orofaryngeálnej tekutiny. Veterinárny svet. 2018;3:318. doi:10.1128/ mSphere.00365-318

4. Arzt J, Pacheco JM, Stenfeldt C. Patogenéza virulentného a oslabeného vírusu slintačky a krívačky u hovädzieho dobytka. Veterinárny svet. 2017;14:89. doi:10,1186/s12985-017-0758-759

5. Sobhy NM, Bayoumi YH, Mor SK, El-Zahar HI, Goyal SM. Ohniská slintačky a krívačky v Egypte: molekulárna epidemiológia, evolúcia a prognostický význam srdcových biomarkerov. Int J Vet Sci Med. 2018;6(1):22–30. doi:10.1016/j. práve.2018.02.001

6. Senthilkumaran C, Yang M, Bittner H, a kol. Detekcia genómu, antigénu a protilátok v orálnych tekutinách ošípaných infikovaných vírusom slintačky a krívačky. Can J Vet Res. 2017;81:82–90.

7. Palinski RM, Bertram MR. Prvá genómová sekvencia vírusu slintačky a krívačky sérotypu O podlínii Ind2001e z južného Vietnamu. Microbiol Resour Announc. 2019;8: e01424–18. doi:10.1128/mra.{10}}

8. Pulido MR, Sobrino F, Borrego B a kol. Oslabená RNA vírusu slintačky a krívačky nesúca deléciu v 3′ nekódujúcej oblasti môže vyvolať imunitu u ošípaných. J Virol. 2009;83(8):3475–85. doi:10.1128/JVI.{11}}

9. Saravanan P, Iqbal Z, Selvaraj DPR, Aparna M, Umapathi V. Porovnanie metód chemickej extrakcie na stanovenie obsahu 146S v olejom adjuvovanej vakcíne proti slintačke a krívačke. J Appl Microbiol. 2019;1(Ruecert 1985):1–9. doi:10.1111/jam.14465

10. Jamal SM, Belsham GJ. Slintačka a krívačka: minulosť, prítomnosť a budúcnosť. Vet Res. 2013;44(1):1–14. doi:10.1186/1297-9716- 44-116

11. Robinson L, Knight-Jones TJ, Charleston B a kol. Aktualizácia globálneho výskumu slintačky a krívačky a analýza medzier: 7 - patogenéza a molekulárna biológia. Transbound Emerg Dis. 2016;63(1):63–71. doi:10.1111/tbed.12520

12. Sreenivasa BP, Mohapatra JK, Pauszek SJ, et al. Rekombinantný ľudský adenovírus-5 exprimujúci kapsidové proteíny indických vakcinačných kmeňov vírusu slintačky a krívačky vyvoláva u hovädzieho dobytka účinnú protilátkovú odpoveď. Vet Microbiol. 2017;203:196–201. doi:10.1016/ j.vetmic.2017.03.019

13. Neilan JG, Schutta C, Barrera J, et al. Účinnosť podjednotkovej vakcíny sérotypu A vírusu slintačky a krívačky s adenovírusom u hovädzieho dobytka s použitím modelu priameho kontaktu. BMC Vet Res. 2018;14(1):1–9. doi:10,1186/s{11}}

14. Pena L., Pires M., Koster M. a kol. Dodanie prázdneho kapsidového podjednotkového antigénu vírusu slintačky a krívačky s neštrukturálnym proteínom 2B zlepšuje ochranu ošípaných. Vakcína. 2008;26 (45):5689–5699. doi:10.1016/j.vaccine.2008.08.022

15. Barteling SJ, Cassim NI. Veľmi rýchla (a bezpečná) inaktivácia vírusu slintačky a krívačky a enterovírusov kombináciou binárneho etylénimínu a formaldehydu. Dev Biol (Bazilej). 2004;119:449–455

16. Rweyemamu MM, Umehara O, Giorgi W, Medeiros R, Neto DL, Baltazar M. Vplyv formaldehydu a binárneho etylénimínu (BEI) na integritu kapsidy vírusu slintačky a krívačky. Rev Sci Tech. 1989;8(3):747–764. doi:10.20506/rst.8.3.425

17. Patch JR, Kenney M, Pacheco JM, Grubman MJ, Golde WT. Charakterizácia funkcie cytotoxických T lymfocytov po infekcii vírusom slintačky a krívačky a očkovaní. Viral Immunol. 2013;26(4):239–249. doi:10.1089/vim.2013.0011

18. Rodriguez-Calvo T, Ojosnegros S, Sanz-Ramos M, Garcia-Arriaza J, Escarmis C, Domingo E, Sevilla N. Nový dizajn vakcíny založený na defektných genómoch, ktoré kombinujú vlastnosti oslabených a inaktivovaných vakcín. PLoS One. 2010;5(4):1–11. doi:10.1371/ journal.pone.0010414

19. Núñez JI, Baranowski E, Molina N, et al. Kyslá substitúcia v neštrukturálnom proteíne 3A môže sprostredkovať adaptáciu vírusu slintačky a krívačky na morča. J Virol. 2001. doi:10.1128/JVI.75.8.3977-3983.2001

20. Burman A, Clark S, Abrescia NGA a kol. Špecifickosť slučky VP1 GH vírusu slintačky a krívačky pre integríny v 6. J Virol. 2006;80(19):9798–9810. doi:10.1128/JVI.{12}}

21. Dicara D, Burman A, Clark S, a kol. Vírus slintačky a krívačky tvorí vysoko stabilný komplex odolný voči EDTA s jeho hlavným receptorom, integrínom v 6: dôsledky pre infekčnosť. J Virol. 2008;82(3):1537–1546. doi:10.1128/JVI.{12}}

22. Domingo E, Sheldon J, Perales C, a kol. Evolúcia vírusových kvázidruhov. Microbiol Mol Biol Rev. 2012;76(2):159–216. doi:10.1128/MMBR.05023-11

23. Mckenna TS, Lubroth J, Rieder E, a kol. Vírus slintačky a krívačky (FMD) s vymazaným miestom viazania na receptor chráni dobytok pred slintačkou a krívačkou. J Virol. 1995;69(9):5787–5790. doi:10.1128/ jvi.69.9.{14}}.1995

24. Dimarchi R, Brooke G, Gale C, Cracknell V, Doel T, Mowat N. Ochrana dobytka proti slintačke a krívačke syntetickým peptidom. Veda. 1986; 232:639-641. doi:10.1126/science.3008333

25. Gómez N, Salinas J, Escribano JM, et al. Ochranná imunitná odpoveď na vírus slintačky a krívačky s VP1 exprimovaným v transgénnych rastlinách ochranná imunitná odpoveď na vírus slintačky a krívačky s VP1 exprimovaným v transgénnych rastlinách. J Virol. 1998;72:2–5.

For more information:1950477648nn@gmail.com