Guy JM Cameron a kol

Akútne poškodenie obličiek(AKI) môže byť smrteľné a je dobre definovaným rizikovým faktorom pre rozvojchronickýobličkychoroba. Vrodené lymfoidné bunky skupiny 2 (ILC2) sú vrodenými producentmi cytokínov typu -2 a sú kritickými regulátormi homeostázy v periférnych orgánoch. Avšak naše poznatky o ich funkcii vobličkyje pomerne obmedzená. Nedávne dôkazy naznačujú, že zvýšenie počtu ILC2 systémovým podávaním rekombinantného interleukínu (IL)-25 alebo IL-33 chráni pred poškodením obličiek. Zatiaľ čo ILC2 môžu byť indukované na ochranu pred ischemickou alebo chemicky indukovanou AKI, vplyv nedostatku alebo vyčerpania ILC2 na závažnosť poškodenia obličiek nie je známy. Po prvé, fenotyp a umiestnenie ILC2 vobličkyboli hodnotené v homeostatických podmienkach.ObličkyILC2 konštitutívne exprimovali vysoké hladiny IL-5 a nachádzali sa v tesnej blízkosti renálnej vaskulatúry. Testovať funkčnú úlohu ILC2 vobličky, bol použitý experimentálny model renálneho ischemicko-reperfúzneho poškodenia (IRI) a závažnosť poranenia bola hodnotená ako divoký typ, ILC2-s redukovaným, ILC2-deficientným a ILC{{4} }vyčerpané myši. Prekvapivo neboli žiadne rozdiely v histopatológii, ukladaní kolagénu alebo expresii mRNA faktorov spojených so zranením (Lcn2), zápalových (Cxcl1, Cxcl2 a Tnf) alebo extracelulárnej matrice (Col1a1, Fn1) po IRI v neprítomnosti ILC2. Tieto údaje naznačujú, že neprítomnosť ILC2 nemení závažnosť ochoreniapoškodenie obličiek, čo naznačuje možnú nadbytočnosť. Preto iné mechanizmy typu 2-sprostredkovanej aktivácie imunitných buniek pravdepodobne kompenzujú neprítomnosť ILC2. Preto je nepravdepodobné, že strata ILC2 zvýši náchylnosť alebo závažnosť AKI.

Kľúčové slová:ILC2, vrodené lymfoidné bunky skupiny 2, IL-5, IL-13,obličky, obličkové, IRI, ischemicko-reperfúzne poškodenie

Pre viac informácií kontaktujte:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

ÚVOD

Akútne poškodenie obličiek(AKI) a súvisiace patológie majú hlboké účinky na ľudské zdravie (1). Častou príčinou AKI je renálna ischémia, ktorá primárne postihuje tubulárny epitel v dôsledku vysokej mitochondriálnej hustoty a metabolickej aktivity v týchto bunkách (2); recenzované v Devarajan (3) a Bonventre a Yang (4). Akútna tubulárna nekróza zhoršuje vylučovanie odpadu, mení nerovnováhu vody a elektrolytov a spôsobuje silné zápalové reakcie; preskúmané v Bonventre a Yang (4). Príliv neutrofilov a monocytov prispieva k poškodeniu, avšak iné bunky vrodenej imunity môžu uľahčiť návrat do homeostázy (5); preskúmané vo Friedewald a Rabb (6). Vrodené lymfoidné bunky (ILC) sú novým prírastkom do tejto rodiny a sú kategorizované do 3 skupín na základe transkripčných faktorov, ktoré sú potrebné na ich vývoj, a efektorových cytokínov, ktoré produkujú (7). ILC skupiny 2 (ILC2) sú silnými producentmi cytokínov typu 2, predovšetkým interleukínu (IL)-5 a IL-13 (8, 9). Tieto bunky tiež podporujú obnovu tkaniva po poškodení viacerých orgánov a majú rôzne funkcie in vivo (10). Napríklad po respiračnej vírusovej infekcii vírusom chrípky ILC2 koordinujú opravu epitelu dýchacích ciest produkciou rastového faktora amfiregulínu (AREG) (11). Nedávno boli ILC2 skúmané na modeloch poškodenia obličiek vrátane ischemicko-reperfúzneho poškodenia (IRI) a nefrotoxického chemicky indukovaného poškodenia doxorubicínom alebo cisplatinou (12–16). Renálna IRI sa zvyčajne dosahuje dočasným obmedzením prietoku krvi do obličiek na 20–30 minút, modelovaním traumy z transplantácie alebo chirurgického zákroku (17–21). Súhrnne tieto štúdie ukazujú, že in vivo podávanie rekombinantných myších cytokínov, ktoré aktivujú ILC2, menovite IL-25 alebo IL-33, je dostatočné na zníženie závažnosti poškodenia tubulárnych epiteliálnych buniek (12–16). Podobné výsledky sa dosiahli s adoptívnym prenosom ex vivo aktivovaných ILC2 (12, 15). Zatiaľ čo ILC2 môžu byť umelo vyvolané, aby proliferovali a chránili pred škodlivými následkami experimentálneho poškodenia obličiek, vplyv nedostatku ILC2-nie je úplne pochopený. V skutočnosti sú pre tento renoprotektívny účinok rozhodujúce iné imunitné bunky, ktoré majú komplexné interakcie s ILC2, ako sú regulačné T bunky (Treg) a alternatívne aktivované makrofágy (AAM; tiež známe ako M2) (22–25). V tejto štúdii sme sa snažili ďalej charakterizovať ILC2 v obličkách, ich umiestnenie v tomto orgáne a určiť ich funkčnú úlohu v IRI pomocou prístupu straty funkcie. Tu sme to našliobličkyILC2 konštitutívne exprimujú IL- 5 a primárne sa nachádzajú v tesnej blízkosti renálnej vaskulatúry, v adventícii. Okrem toho demonštrujeme, že zníženie, nedostatok alebo vyčerpanie ILC2 malo minimálny vplyv na závažnosť IRI. Zatiaľ čo sa predtým ukázalo, že aktivácia ILC2 a súvisiaca amplifikácia lokálnej imunity typu 2 znižujú škodlivé následky AKI, naše výsledky ukazujú, že k porovnateľnému poškodeniu dochádza v neprítomnosti ILC2, čo naznačuje, že ILC2 môžu byť v IRI nadbytočné, keď iná kompenzačná imunita sú prítomné bunky ako T bunky.

MATERIÁLY A METÓDY

Myši

Osem až dvanásť týždňov starý samec divokého typu (WT; C57BL/6JAusb), vehikulum (Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ) ošetrené fyziologickým roztokom, ILC2-znížené (Roraflfl/ plus Il7rcre/ plus ), ILC{{ 8}}nedostatok (Roraflfl/flfl Il7rcre/ plus ), ILC2- vyčerpaný (liečený diptériovým toxoidom [DTx] Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus) a IL-5/IL-13 myši s duálnym reportérom (Il5venus/plus 1113td paradajka/plus) myši boli získané od Australian Bioresources (Moss Vale, Austrália). Il5td paradajkaCre; Rosa26-CAG-RFP reportér-tracker myši boli získané z Jackson Labs (ref# 030926 a 007914). Všetky myši, ktoré podstúpili operáciu, boli umiestnené za špecifických podmienok fyzického obmedzenia 2 bez patogénov v individuálne vetraných klietkach. Myši boli počas operácie vystavené normálnemu vzduchu v miestnosti v sterilizovanom prostredí. Myši sa nechali 1 týždeň aklimatizovať pred začatím experimentov a udržiavali sa v 12-hodinovom cykle deň/noc s prístupom k štandardnému laboratórnemu krmivu a vode ad libitum.

Prietoková cytometria a analýza t-SNE

Obličkya pľúca sa odobrali reportérovým myšiam. Jednobunkové suspenzie sa pripravili tak, ako je opísané v "Príprava jednobunkových suspenzií z myších pľúc s ošetrením kolagenázou D" (Miltenyi Biotec GmbH, 2008; Bergisch Gladbach, Nemecko). Bunky boli blokované Fc blokom (purifikovaný anti-myší CD16/32; Biolegend, San Diego, USA) počas 30 minút a zafarbené fluorescenčne konjugovanými protilátkami proti povrchovým antigénom cieľových buniek (doplnková tabuľka 1). Kroky farbenia a premývania sa uskutočňovali farbiacim pufrom BSA (BD Biosciences, North Ryde, Austrália). Vzorky boli získané na prietokovom cytometri BD LSR Fortessa X20. Údaje prietokovej cytometrie sa analyzovali pomocou FlowJo v10.5.3 (Tree Star, Ashland, USA). Vloženie t-distribuovaného stochastického suseda (t-SNE) sa uskutočnilo na ILC2 (CD45 plus Lineage [TCR [TCR TCR δ CD8 CD4 ]CD11b GR-1 B220 TER-119 CD3 NK-1 .1] IL7R plus CD90.2 plus ST2 plus jednotlivé bunky FSClowSSClow). Pomocou doplnku náhodného odberu vzoriek sa počet udalostí v každej vzorke normalizoval tak, aby sa rovnal najnižšej hodnote, zaokrúhlený nadol na najbližších 10 udalostí. Všetky populácie sa spojili do jedného súboru .fcs zreťazením populácií, z ktorých sa odobrali nižšie vzorky. Analýza t-SNE sa uskutočnila na zreťazenej vzorke obsahujúcej gatované populácie zo všetkých vzoriek obličiek a pľúc dohromady. Na tento účel boli kompenzované kanály, ktoré sa nepoužili na hradlovanie, hodnotené pri nasledujúcich nastaveniach t-SNE: Iterácia 1000, Zmätenosť 20, Eta 224. Histogramy sa použili na zobrazenie rozdielnej expresie antigénov a cytokínov bunkového povrchu v pľúcach aobličky

imunofluorescencia Il5td paradajkaCre; Rosa26-CAG-RFP reportér-tracker myši boli usmrtené a intrakardiálne perfundované fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS) a potom 4 percentami paraformaldehydu (PFA) v PBS. Obličky sa odobrali a uchovávali v čerstvom 4 percentnom PFA počas 24 hodín pri 4 °C a potom sa premyli v PBS. Pomocou vibratómu sa pripravilo tristo mikrometrových rezov. Následne boli tkanivové rezy inkubované v permeabilizačnom pufri (PBS/0,2 percent Triton X-100/0,3M glycín), potom blokované v PBS/0,2 percenta Triton X- 100/5 percent oslie sérum pri 4 °C cez noc. Vzorky boli raz premyté v PBS/0,2% Tween-20 a potom inkubované s primárnymi protilátkami zriedenými v PBS/0,2% Tween-20/3% oslie sérum pri izbovej teplote do nasledujúceho dňa. Potom sa vzorky premyli v PBS/0.2 percent Tween-20 počas 30 min, 3-4 krát, potom sa inkubovali so sekundárnymi protilátkami zriedenými v PBS/0 .2 percent Tween{34}}/3 percent oslie sérum pri izbovej teplote počas 6–8 hodín. Vzorky sa premývali v PBS/0,2% Tween-20 počas 1 dňa a potom sa dehydratovali vo vzostupnej sérii etanolu (20, 30, 50, 70, 95, 100 percent), 10 minút v každom kroku . Nakoniec boli rezy obličiek vyčistené namáčaním v metylsalicyláte (M-2047; Sigma-Aldrich, Castle Hill, Austrália) a potom namontované v čerstvom metylsalicyláte na konkávne krycie sklíčko alebo komoru. Snímky boli zachytené laserovým skenovacím konfokálnym zariadením Nikon A1R vrátane 405, 488, 561 a 650 laserových línií na excitáciu a zobrazovanie s 16X/0,8 alebo 25X1,1, NA Plan Apo objektívmi s dlhou pracovnou vzdialenosťou do vody. Z kroky boli získané každých 6 um. Obrázky boli spracované softvérom ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) a softvérom Bitplane Imaris v8 (Andor Technology PLC, Belfast, Severné Írsko). Povrchové rekonštrukcie krvných ciev značených aktínom hladkého svalstva sa vykonali pomocou Imaris a pseudofarbili sa na základe ich charakteristickej architektúry a objemu na vizualizáciu veľkých tepien a žíl. Boli použité nasledujúce protilátky a riedenia: Living Colors anti-DsRed Rabbit Polyclonal Pan Antibody (1:500; TaKaRa, Mountain View, USA), kozia polyklonálna anti-alfa-aktínová protilátka hladkého svalstva (1:200; Abcam, Cambridge, Spojené kráľovstvo ), monoklonálna protilátka eFluor 660 LYVE1 (1:300, klon ALY7, eBioscience), anti-myšia CD3 protilátka arménskeho škrečka (1:100, klon 145-2C11, Biolegend), somárska anti-kozí IgG Alexa Fluor R 488 (H plus L), Alexa Fluor R 555 oslí anti-králičí IgG (H plus L) Alexa Fluor R 647 kozí anti-škrečkový IgG (H plus L) krížovo adsorbovaný (1:400, ThermoFisher Scientific).

Jednostranné ischemicko-reperfúzne poškodenie

Chirurgická anestézia bola vyvolaná inhaláciou 4 percent izofluránu a udržiavaná kontinuálnou inhaláciou 1 až 1,5 percenta izofluránu cez nosový kužeľ. Počas celého postupu boli myši držané na chirurgickej platforme udržiavanej na 37 ± 1 °C pomocou digitálneho termostatu riadeného tepelného podložky. U všetkých zvierat bola vykonaná nefrektómia pravej obličky. Na vyvolanie unilaterálnej ischémie sa cievy ľavej obličky zovreli v blízkosti obličkového pediklu na 29- min pomocou netraumatickej sterilnej cievnej svorky (Coherent Scientific; Hilton, Austrália), pričom sa použila dostatočná sila, aby sa zabránilo krvnému kolegovi do azobličkybez nezvratného poškodenia ciev. Rovnomerná a rýchla reperfúziaobličkybola pozorovaná po odstránení cievnej svorky u všetkých myší. Svalové a kožné rany sa uzavreli pomocou 5/0 vikrylového stehu (Johnson & Johnson Medical, North Ryde, Austrália), koža sa potom uzavrela pomocou dermálneho lepidla (Provet, Charlestown, Austrália) na ochranu rany a zabrániť infekcii. Kontrolné zvieratá sa podrobili simulovanej operácii s rovnakým časom anestézie a dostali iba kontralaterálnu nefrektómiu. Pre účinnú analgéziu myši dostali 0,1 mg/kg buprenorfínu subkutánne 30 minúty pred operáciou a potom 0,05–0,1 mg/kg každých 8–12 hodín, podľa potreby. Zvieratá boli typicky odstavené od analgézie do 4 dní po chirurgickom zákroku bez akýchkoľvek známok bolesti alebo úzkosti, ako je definované charakteristikami tváre s použitím štandardnej stupnice myšacej grimasy; ako je opísané (26). Všetky myši prežili do vopred určeného koncového bodu.

Deplécia ILC2 in vivo

ILC2 boli vyčerpané v Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus myšiach intraperitoneálnou injekciou 0,025 mg/kg DTx (Sigma-Aldrich), ako už bolo opísané (27). DTx sa podával 30 minút pred operáciou a potom denne až do koncového bodu. Na potvrdenie vyčerpania ILC2- podskupina naivných zvierat dostávala DTx počas 3 dní. Kontrolné myši Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus dostali intraperitoneálnu injekciu fyziologického roztoku.

Histológia

Vyňatéobličkyboli okamžite rozdelené na polovicu pozdĺžne cez hilum. Polovica bola fixovaná v 10 percentnom pufrovanom formalíne obsahujúcom 4 percentá formaldehydu počas 24 hodín pred dočasným uskladnením v 10 percentnom etanole, zaliatím do parafínu a narezaním na rezy. Štyri mikrometre, pozdĺžne rezané rezy boli zafarbené kyselinou jodistou-Schiff (PAS) a Massonovým trichrómom. Histopatológia bola kvantifikovaná vizualizáciou dilatácie tubulov, apoptózy alebo tvorby odliatku jednoduchým zaslepeným vyšetrovateľom s použitím dobre zavedenej semikvantitatívnej metódy (28), s menšími zmenami, ako je opísané (15). Zo skóre z duplicitných rezov zafarbených PAS od každého zvieraťa sa urobil priemer. Skóre 0=0 percent tubulov bolo ovplyvnených vyššie uvedenými histopatologickými znakmi; 1=1–10 percent; 2=11–25 percent; 3=26–50 percent; 4=51–75 percent; 5=76–100 percent . Ukladanie kolagénu bolo hodnotené pomocou Massonovho trichrómu a kolagén bol identifikovaný ako obsah metylovej modrej medzi susednými tubulmi.

Extrakcia RNA, reverzná transkripcia a qPCR

Polovica jednej obličky sa zachovala na analýzu génovej expresie. Tkanivo sa homogenizovalo v 400 ul PBS pomocou TissueLyser LTTM (Qiagen, Chadstone Centre, Austrália) pomocou 50 oscilácií za sekundu počas 2 minút. Dvesto mikrolitrov vzorky sa odobralo na ďalšie analýzy. Jeden mililiter TRI Reagent R (Sigma-Aldrich) sa pridal k zvyšným 200 ul vzorky, ktorá dostávala ďalších 50 kmitov za sekundu počas 1–2 minút, kým sa úplne nezhomogenizovala. Po 5 minútach inkubácie pri teplote miestnosti a centrifugácii pri 12,000 x g počas 10 minút sa supernatant extrahoval a vortexoval s 250 ul chloroformu (Sigma-Aldrich). Po inkubácii počas 10 minút pri teplote miestnosti a centrifugácii pri 12,000 x g počas 15 minút sa supernatant extrahoval a vortexoval s 500 ul 70 percentného izopropanolu (Sigma-Aldrich). Vzorka sa znova inkubovala počas 10 minút pri teplote miestnosti a potom sa centrifugovala pri 12,000xg počas 10 minút. Supernatant bol odstránený bez narušenia pelety bohatej na RNA. Peleta sa dvakrát premyla 1 ml 75 percentného etanolu RNA (Sigma-Aldrich), centrifugovala sa pri 10,000xg počas 5 minút a supernatant sa zakaždým zlikvidoval. Peleta sa krátko vysušila na vzduchu pri izbovej teplote a potom sa resuspendovala v 80 – 100 µl dvakrát destilovanej vody UltraPureTM bez DNázy/RNázy (ddH2O; Thermo-Fisher Scientific) a potom sa skladovala pri 80 °C pred reverznou transkripciou. . Bezprostredne pred reverznou transkripciou sa stanovil výťažok RNA spektrofotometrickým hodnotením s použitím Nanodrop2000TM (Thermo-Fisher Scientific). Päť mikrolitrov každej vzorky sa zriedilo v ddH20 tak, aby sa na jednu vzorku nanieslo 1000 ng RNA. Po ošetrení DNAázou (Sigma-Aldrich) sa cDNA vytvorila s použitím štandardných operačných postupov enzýmu M-MLV (Thermo-Fisher Scientific, North Ryde, Austrália) s použitím tepelného cyklovača T100TM (BioRad Laboratories, Gladesville, Austrália). Použitím metodológie založenej na SYBR sa qPCR uskutočnilo pomocou CFX384 TouchTM (BioRad Laboratories) podľa štandardných operačných postupov. Každá sada primérov bola testovaná v gradiente, aby sa určila optimálna teplota na amplifikáciu (doplnková tabuľka 2). Kvantifikácia cyklu bola interpretovaná pomocou regresie pre každý cieľ, génová expresia bola normalizovaná vzhľadom na hypoxantín-guanín fosforibozyltransferázu (Hprt). Krivky toku taveniny sa hodnotili na znaky dimerizácie priméru a nešpecifickej amplifikácie. Na každej platni sa pre každý cieľ použila aspoň jedna negatívna kontrola a kontrola bez šablóny, aby sa zabezpečilo, že v každej základnej zmesi alebo použitej ddH2O nebude prítomná kontaminácia.

RT2 Profiler Array

Extracelulárne matricové a adhézne molekuly myši RT² ProfifilerTM PCR Array (Qiagen) sa uskutočňovali podľa pokynov výrobcu a údaje sa nahrali a potom analyzovali online nástrojom, ktorý je k dispozícii na https://dataanalysis. qiagen.com/pcr/arrayanalysis.php. Toto pole umožňuje profilovanie 84 génov v maximálne 4 vzorkách, preto sa rovnaké množstvá cDNA pre každý replikát v skupine spojili z myší WT v deň 1, 3 alebo 7 po IRI a simulovane sa spojili z každého replikátu z každého z týchto časových bodov. Pre každý cieľ sa násobok zmeny po IRI porovnal s falošnou expresiou.

Štatistická analýza

Všetky údaje boli analyzované pomocou softvéru Graphpad Prism v8.{6}}2 pomocou neparametrických nepárových t-testov (Mann-Whitney U-test). P < 0.05="" bola="" stanovená="" ako="" prahová="" hodnota="" na="" určenie="" štatisticky="" významných="" rozdielov.="" ∗p="">< 0,05,="" ns="" nevýznamné.="" všetky="" údaje="" sú="" vyjadrené="" ako="" priemer="" ±="" sem.="" v="" každej="" analýze="" bolo="" n="4–8" replikátov="" na="" skupinu="" a="" výsledky="" reprezentovali="" aspoň="" dva="" experimenty.="" veľkosť="" vzorky="" pre="" každý="" experiment="" je="" opísaná="" v="" príslušnej="" legende="">

VÝSLEDKY

Renálne ILC2 konštitutívne exprimujú IL-5 a sú lokalizované v obličkovej vaskulatúre za homeostatických podmienok

Bola vykonaná podrobná analýza renálneho ILC2 fenotypu a lokalizácie v homeostatických podmienkach. V obličkách bolo významne viac ILC2 (CD45 plus Lineage IL- 7R plus CD90.2 plus ST2 plus FSClowSSClow jednotlivé bunky) v porovnaní s pľúcami, keď sú vyjadrené ako percento z celkového počtu CD45 plus jednotlivé bunky (obrázok 1A; Doplnkové obrázky 1A, B). Analýza t-SNE ILC2 obličiek a pľúc ukázala jedinečné zhlukovanie, hoci tieto zhluky neboli navzájom úplne odlišné (obrázok 1B). ILC2 v obličkách však mali výrazne nižšiu expresiu CD25, konzistentnú expresiu ICOS a KLRG1, ale vyššiu expresiu IL-5 v porovnaní s pľúcnymi ILC2 (obrázok 1C). ILC2 v obličkách mali vyššiu konštitutívnu expresiu IL-5 ako IL-13 (obrázok 1D; doplnkové obrázky 1C, D). Zistilo sa, že ILC2 sú hlavným typom buniek produkujúcich IL-5 v obličkách so zanedbateľným príspevkom buniek T pomocného typu-2 (TH2) (obrázok 1E, doplnkové obrázky 1E, F). Preto sa IL-5 použil ako náhradný marker na identifikáciu umiestnenia ILC2 v obličkách myši, ako bolo opísané pre viaceré periférne orgány (29–31). To sa dosiahlo použitím myší, ktoré exprimujú IL-5 spojenú Cre-rekombinázu skríženú so sledovačom línie Rosa-tomato (30, 31). Bunky IL-5 plus (predovšetkým ILC2) boli nájdené v priebehuobličkyale boli primárne lokalizované do hlavnej vaskulatúry, ako je vizualizované pozitívnym farbením alfa-aktínu hladkého svalstva (-SMA) (obrázok 2A; doplnkové obrázky 2A, B), čo je v súlade s našou nedávnou správou (29). Zistilo sa, že ILC2 sú spojené s interlobulárnymi aj oblúkovými obličkovými cievami v kortexe a medulárnych oblastiach, ako ukazuje expresia lymfatického endoteliálneho hyaluronanového receptora-1 (LYVE1) (obrázok 2B). Ďalšie zobrazovanie ukázalo, že len veľmi málo buniek CD3 plus (predovšetkým TH2 buniek) prispelo k endogénnemu signálu IL-5}plus (obrázok 2C). ILC2 boli identifikované v adventícii cievy pomocou pseudofarebných povrchových rekonštrukcií arteriálnej -SMA.

Zníženie, nedostatok alebo vyčerpanie ILC2 nemení závažnosť experimentálneho poškodenia renálnej ischémie a reperfúzie u myší

Given ILC2s were present in the kidney and localized to the renal vasculature, the impact of ILC2 reduction, deficiency, or depletion on the severity of experimental renal IRI was assessed. This was achieved by using ILC2-reduced (Roraflfl/+Il7rcre/+)-deficient (Roraflfl/flfl Il7rcre/+), and -depleted (DTx-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) mice compared to WT and vehicle (saline-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) controls. These mice have been previously described as appropriate tools for assessing ILC2 function in vivo in other organs such as the lung (27, 32). Here we show that these tools are also appropriate for assessing ILC2 function in the kidney. Indeed, kidney ILC2s were significantly lower in the ILC2-reduced, -defificient, and -depleted groups compared to WT or saline-treated controls (Figure 3A). Time-course analysis of IRI in wild-type mice identified day 7 as the most appropriate time point for the assessment of injury severity due to the presence of histopathological features of acute tubular necrosis, collagen deposition and increased mRNA expression of extracellular matrix, injury-associated, and inflflammatory factors (Supplementary Figures 3, 4). At day 7, 25/84 extracellular matrix factors were increased >2-násobne v porovnaní so simulovanými kontrolami, zatiaľ čo 1/84 a 6/84 sa zvýšili na 1. a 3. deň (doplnkový obrázok 4A). IRI indukovaná akútna tubulárna nekróza charakterizovaná dilatovanými tubulmi a tvorbou odliatkov v porovnaní s falošnými kontrolami (obrázok 3B, doplnkové obrázky 3A, 4B). Toto bolo kvantifikované ako skóre tubulárneho poškodenia a závažnosť poranenia bola podobná vo všetkých genotypoch (obrázok 3C). IRI tiež vyvolalo ukladanie kolagénu, označené obsahom metylovej modrej medzi tubulmi v dreni a kôre, v porovnaní s falošnými kontrolami (obrázok 3D; doplnkový obrázok 3B). Ukladanie kolagénu nebolo ovplyvnené absenciou ILC2. IRI tiež zvýšila expresiu mRNA faktorov spojených so zranením, chemokínov a prozápalových cytokínov (obrázky 3E–J, doplnkové obrázky 4C–K). Neutrofilný lipokalín spojený s gelatinázou (Lcn2; NGAL), biomarker poškodenia obličiek (33, 34), sa zvýšil pomocou IRI a nebol ovplyvnený znížením, nedostatkom alebo depléciou ILC2 (obrázok 3E). CXC motív chemokínového ligandu 1 (Cxcl1) a Cxcl2 boli tiež významne zvýšené pomocou IRI vo všetkých genotypoch (obrázky 3F, G). Podobne sa pomocou IRI zvýšil prozápalový cytokínový nádorový nekrotický faktor (Tnf) v porovnaní s falošnými kontrolami (obrázok 3H). V súlade s viditeľným ukladaním kolagénu bola expresia mRNA faktorov extracelulárnej matrice kolagénu typu I alfa 1 reťazca (Col1a1) a fibronektínu 1 (Fn1) zvýšená pomocou IRI vo všetkých genotypoch (obrázky 3I, J).

DISKUSIA

ILC2 sú kritickými regulátormi tkanivovej homeostázy, ale ich úloha v obličkách musí byť ešte úplne objasnená. Zatiaľ čo ILC2 môžu byť indukované k proliferácii a ochrane pred škodlivými následkami experimentálneho poškodenia obličiek, zatiaľ nie je známe, čo sa deje v neprítomnosti týchto buniek. Najprv sme skúmali, či sa čísla ILC2, ako podiel CD45 plus hematopoetických buniek, líšia v pľúcach a obličkách. ILC2 predstavovali väčší podiel CD45 plus buniek v obličkách ako v pľúcach. Analýza t-SNE zoskupila ILC2 z oboch miest odlišne, avšak zhluky neboli medzi týmito tkanivami úplne odlišné. Existovali rozdiely v ich expresii antigénu na bunkovom povrchu a cytokínu typu 2, pričom obličkové ILC2 exprimovali väčšie množstvá IL-5. V skutočnosti obličkové ILC2 konštitutívne exprimovali vysoké hladiny IL-5 za homeostatických podmienok. ILC2 boli tiež hlavným zdrojom IL-5 v obličkách so zanedbateľným príspevkom buniek TH2. Preto sa IL-5 použil ako náhradný marker na určenie umiestnenia týchto buniek v obličkách. ILC2 boli identifikované v obličkách a boli lokalizované takmer výlučne pozdĺž renálnej vaskulatúry. V týchto štúdiách sa použila Cre-rekombináza spojená s IL{18}} v spojení so sekvenciou flox-stop-flox upstream od kazety CAG-RFP-WPRE v konštitutívne exprimovanom lokuse ROSA26 na lokalizáciu ILC2. LYVE1, ktorý je exprimovaný renálnymi lymfatickými endotelovými bunkami, sa použil na ďalšie definovanie umiestnenia týchto buniek v myšej obličke (35). Ako sa očakávalo, farbenie LYVE1 bolo vložené do spojivového tkaniva renálnych artérií kôry, ale nie do drene, pretože v tejto oblasti obličiek neexistuje žiadna rozpoznateľná lymfatická sieť (35–37). ILC2 sa pravdepodobne nachádzajú blízko ciev, pretože renálne endotelové bunky sú hlavným zdrojom IL-33 v obličkách (38, 39). Potvrdením nášho pozorovania pomocou FACS jednobunkových obličkových suspenzií sa opäť zistilo, že ILC2 sú hlavnými producentmi IL-5 v rezoch tkaniva obličiek s minimálnym príspevkom CD3 plus T buniek. Aj keď tieto štúdie ukazujú umiestnenie ILC2 v obličkách pomocou reportérových myší, zostáva určiť, či sa ILC2 nachádzajú aj v blízkosti vaskulatúry v ľudskej obličke a či je umiestnenie ILC2 zmenené v reakcii na poškodenie obličiek. Hoci viaceré správy zistili, že čísla ILC2 sa pri poškodení obličiek nezmenili, ich fenotyp a stav aktivácie po poranení si vyžadujú ďalšie objasnenie (12–16). Ďalej sme charakterizovali funkčnú úlohu ILC2 v obličkách pomocou prístupu straty funkcie. Aby sme to dosiahli, využili sme myši so zníženou ILC{48}} a myši s nedostatkom ILC a myši, ktoré môžu byť podmienečne zbavené ILC2 po podaní DTx (27). Overili sme použitie týchto nástrojov na knockdown alebo abláciu ILC2 v obličkách. Bol vybraný experimentálny model IRI vzhľadom na blízkosť ILC2 k renálnej vaskulatúre. Hoci znaky poranenia boli po IRI viditeľne zrejmé, zníženie, nedostatok alebo vyčerpanie ILC2 nezmenilo hrubú histopatológiu v obličkách, ani nespôsobilo mortalitu. Remodelácia indukovaná IRI a ukladanie kolagénu sa skutočne vyskytli nezávisle od ILC2. Aj keď je možné, že skorší časový bod po poranení mohol identifikovať rozdiely v histopatológii a génovej expresii, časový bod v našej štúdii tiež umožnil hodnotenie ukladania kolagénu, čo je dôležitá vlastnosť prestavby, ktorá je regulovaná ILC2 (16, 32, 40 – 44). Je tiež pravdepodobné, že zníženie ILC2 počas

AKI by mohla byť škodlivá pre štruktúru a funkciu obličiek pri hodnotení v neskorších časových bodoch v dôsledku potenciálnych maladaptívnych opravných reakcií v neprítomnosti ILC2. Na vyriešenie tohto problému budú musieť budúce štúdie preskúmať úlohu ILC2 v progresii AKI na chronické ochorenie obličiek (45, 46).

Súhrnne táto štúdia ukazuje, že zníženie, nedostatok alebo vyčerpanie ILC2 nemení závažnosť experimentálnej AKI u myší. Zatiaľ čo sa predtým ukázalo, že aktivácia ILC2 a súvisiaca amplifikácia lokálnej imunity typu 2 znižujú škodlivé následky AKI, porovnateľné poškodenie nastáva, keď sú ILC2 znížené, neprítomné alebo vyčerpané, čo naznačuje možnú redundanciu a kompenzáciu inými imunitnými bunkami, ako je Treg. bunky AAM a TH2. Tento koncept podporujú štúdie s použitím myší Rag1 / alebo Rag2 /, ktorým chýbajú zrelé T a B bunky, v modelochpoškodenie obličiek(13, 15, 47, 48). V jednej štúdii sa na depléciu ILC2 použilo podávanie anti-CD90.2, avšak tieto zvieratá mali tiež nedostatok buniek Treg a TH2 (15). V tomto modelovom systéme, napriek vyčerpaniu ILC2 s anti-CD90.2, nie je možná kompenzácia z kompartmentu T buniek. Naše údaje ukazujú, že strata ILC2, keď kompartment T buniek zostáva nedotknutý, má minimálny vplyv na závažnosť IRI. Naše údaje podporujú koncepciu, že ILC2 okrem iných imunitných buniek, ako sú Treg a AAM, prispievajú k AKI. Deplécia Treg skutočne zhoršila histopatológiu po IRI (15). Podobne polarizácia makrofágov smerom k AAM podporuje riešenie poranenia (5, 12, 46, 49, 50). Na objasnenie príčiny prítomnosti ILC2 v obličkách, vrátane vzostupných infekcií močových ciest a iných renálnych insultov, ako aj progresie dochronická choroba.

ETICKÉ VYHLÁSENIE

Všetky chirurgické zákroky boli schválené Výborom pre starostlivosť a etiku zvierat Univerzity v Newcastle v súlade s Austrálskym kódexom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na vedecké účely. Postupy pre imunofluorescenčné zobrazovanie boli schválené a vykonávané v súlade so smernicami stanovenými výborom UCSF pre starostlivosť o zvieratá a používanie zvierat a centrom Laboratory Animal Resource Center.

AUTORSKÉ PRÍSPEVKY

Prezentovaná práca bola vykonaná v spolupráci so všetkými autormi. GC vykonal chirurgický model, prietokovú cytometriu, histologické hodnotenie, analýzu génovej expresie a analyzoval údaje. KC a ABM uskutočnili imunofluorescenčné experimenty. SL podporovaná monitorovaním zvierat a prietokovou cytometriou. SJ a AD poskytli klinický pohľad na dizajn štúdie a chirurgickú techniku. ANM vytvorila, dodala a poskytla poradenstvo v súvislosti s používaním ILC2-deficientných a -depletovaných a Il13td paradajkových myší. Spoločnosť PF dodala a poradila pri používaní reportérskej linky Il5venus. PF a PH poradili pri navrhovaní experimentu. MS navrhol, dohliadal a uľahčil všetky aspekty štúdií. Všetci autori sa podieľali na interpretácii údajov, príprave a úprave rukopisov pre intelektuálny obsah.

FINANCOVANIE

MS podporuje štipendium Austrálskej výskumnej rady (ARC) Discovery Early Career Researcher Award (DECRA) a granty od National Health and Medical Research Council (NHMRC), Hunter Medical Research Institute a Hunter Children's Research Foundation.

LITERATÚRA

1. Susantitaphong P, Cruz DN, Cerda J, Abulfaraj M, Alqahtani F, Koulouridis I a kol. Svetový výskyt AKI: metaanalýza.Clin J Am Soc Nephrol. (2013) 8:1482–93.

2. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, Duchen MR. Multifotónové zobrazovanie odhaľuje rozdiely v mitochondriálnej funkcii medzi segmentmi nefrónov.J Am Soc Nephrol. (2009) 20:1293–302.

3. Devarajan P. Aktualizácia mechanizmov ischemického akútneho poškodenia obličiek.J Am Soc Nephrol. (2006) 17:1503–20. 

4. Bonventre JV, Yang L. Bunková patofyziológia ischemického akútneho poškodenia obličiek.J Clin Invest.(2011) 121:4210–21. DOI: 10.1172/JCI 45161

5. Lee S, Huen S, Nishio H, Nishio S, Lee HK, Choi BS a kol. Odlišné fenotypy makrofágov prispievajú k poškodeniu a oprave obličiek.J Am Soc Nephrol. (2011) 22:317–26. 

6. Friedewald JJ, Rabb H. Zápalové bunky pri ischemickom akútnom zlyhaní obličiek.Kidney Int.(2004) 66:486–91. 

7. Spits H, Artis D, Colonna M, Diefenbach A, Di Santo JP, Eberl G, et al. Vrodené lymfoidné bunky – návrh jednotnej nomenklatúry.NatRev Immunol.(2013) 13:145–9. 

8. Moro K, Yamada T, Tanabe M, Takeuchi T, Ikawa T, Kawamoto H a kol. Vrodená produkcia T(H)2 cytokínov lymfoidnými bunkami c-Kit(plus)Sca-1(plus) spojenými s tukovým tkanivom.Príroda. (2010) 463:540–4. 

9. Neill DR, Wong SH, Bellosi A, Flynn RJ, Daly M, Langford TKA a kol. Nuocyty predstavujú nový vrodený efektorový leukocyt, ktorý sprostredkúva typ-2 imunity.Príroda. (2010) 464:1367–70. 

10. Loering S, Cameron GJM, Starkey MR, Hansbro PM. Vývoj pľúc a nové úlohy pre imunitu typu 2.J Pathol.(2018) 247:686–96. 

11. Monticelli LA, Sonnenberg GF, Abt MC, Alenghat T, Ziegler CG, Doering TA a kol. Vrodené lymfoidné bunky podporujú homeostázu pľúcneho tkaniva po infekcii vírusom chrípky.Nat Immunol. (2011) 12:1045–54. 

12. Huang Q, Niu Z, Tan J, Yang J, Liu Y, Ma H a kol. IL-25 vyvoláva vrodené lymfoidné bunky a multipotentné progenitorové bunky typu 2, ktoré znižujú renálne ischemické/reperfúzne poškodenie.J Am Soc Nephrol.(2015) 26:2199–211. 

13. Riedel JH, Becker M, Kopp K, Duster M, Brix SR, Meyer-Schwesinger C, et al. IL-33-sprostredkovaná expanzia vrodených lymfoidných buniek typu 2 chráni pred progresívnou glomerulosklerózou.J Am Soc Nephrol.(2017) 28:2068–80. 

14. Stremska ME, Jose S, Sabapathy V, Huang L, Bajwa A, Kinsey GR, et al. IL233, nový IL-2 a IL-33 hybridný cytokín, zlepšuje poškodenie obličiek.J Am Soc Nephrol. (2017) 28:2681–93. 

15. Cao Q, Wang Y, Niu Z, Wang C, Wang R, Zhang Z a kol. Zosilnenie vrodených lymfoidných buniek rezidentných v tkanive typu 2 pomocou IL-33 na prevenciu ischemicko-reperfúzneho poškodenia obličiek.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:961–76. 

16. Sabapathy V, Cheru NT, Corey R, Mohammad S, Sharma R. Nový hybridný cytokín IL233 sprostredkuje regeneráciu po nefrotoxickom poškodení vyvolanom doxorubicínom.Sci Rep. (2019) 9:3215. 

17. Cameron GJM, Jiang SH, Loering S, Deshpande AV, Hansbro PM, Starkey MR. Vznikajúci terapeutický potenciál vrodených lymfoidných buniek skupiny 2 pri akútnom poškodení obličiek.J Pathol. (2019) 2019:5242. 

18. Singh AP, Junemann A, Muthuraman A, Jaggi AS, Singh N, Grover K, a kol. Zvieracie modely akútneho zlyhania obličiek.Pharmacol Rep. (2012) 64:31–44. 

19. Ramesh G, Ranganathan P. Myšie modely a metódy na štúdium ľudských chorôb, akútneho poškodenia obličiek (AKI).Metódy Mol Biol.(2014) 1194:421–36. 

20. Skrypnyk NI, Harris RC, de Caestecker MP. Ischemicko-reperfúzny model akútneho poškodenia obličiek a fibrózy po poranení u myší.J VisExp.(2013) 9:78. 

21. Wei Q, Dong Z. Myší model ischemického akútneho poškodenia obličiek: technické poznámky a triky.Am J Physiol Renálny Physiol.(2012) 303:F1487–94? 

22. Starkey MR, McKenzie ANJ, Belz GT, Hansbro PM. Vrodené lymfoidné bunky pľúcnej skupiny 2: prekvapenia a výzvy.Mucosal Immunol.(2019) 12:299–311. 

23. Jang HR, Rabb H. Imunitné bunky pri experimentálnom akútnom poškodení obličiek.Nat Rev Nephrol.(2015) 11:88–101. DOI: 10.1038/nrneph.2014.180

24. Turner JE, Becker M, Mittrucker HW, Panzer U. Tkanivové lymfocyty v obličkách.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:389–99. 

25. Jang HR, Rabb H. Vrodená imunitná odpoveď pri ischemickom akútnom poškodení obličiek.Clin Immunol. (2009) 130:41–50. 

26. Langford DJ, Bailey AL, Chanda ML, Clarke SE, Drummond TE, Echols S, a kol. Kódovanie výrazov bolesti u laboratórnej myši.NatMetódy.(2010) 7:447–9.

27. Oliphant CJ, Hwang YY, Walker JA, Salimi M, Wong SH, Brewer JM a kol. Dialóg sprostredkovaný MHCII medzi vrodenými lymfoidnými bunkami skupiny 2 a CD4 plus T bunkami zosilňuje imunitu typu 2 a podporuje vypudenie parazitických helmintov.Imunita. (2014) 41:283–95. 

28. Shih W, Hines WH, Neilson EG. Účinky cyklosporínu A na rozvoj imunitne sprostredkovanej intersticiálnej nefritídy.Obličky Int. (1988) 33:1113–8.

29. Dahlgren MW, Jones SW, Cautivo KM, Dubinin A, Ortiz-Carpena JF, Farhat S, a kol. Adventiciálne stromálne bunky definujú niky vrodeného tkaniva lymfoidných buniek skupiny 2.Imunita. (2019) 50:707–22. 

30. Molofsky AB, Nussbaum JC, Liang HE, Van Dyken SJ, Cheng LE, Mohapatra A, a kol. Vrodené lymfoidné bunky typu 2 udržujú eozinofily viscerálneho tukového tkaniva a alternatívne aktivované makrofágy.J Exp Med.(2013) 210:535–49. 

31. Nussbaum JC, Van Dyken SJ, von Moltke J, Cheng LE, Mohapatra A, Molofsky AB, et al. Vrodené lymfoidné bunky typu 2 kontrolujú homeostázu eozinofilov.Príroda.(2013) 502:245–8. 

32. Donovan C, Starkey MR, Kim RY, Rana BMJ, Barlow JL, Jones B a kol. Úlohy T/B lymfocytov a ILC2 pri experimentálnej chronickej obštrukčnej chorobe pľúc.J Leukoc Biol.(2019) 105:143–50. 

33. Mishra J, Ma Q, Prada A, Mitsnefes M, Zahedi K, Yang J, et al. Identifikácia lipokalínu spojeného s neutrofilnou želatinázou ako nového skorého močového biomarkera pre ischemické poškodenie obličiek.J Am Soc Nephrol.(2003) 14:2534–43. 

34. Supavekin S, Zhang W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P. Diferenciálna génová expresia po skorej renálnej ischémii/reperfúzii.Kidney Int.(2003) 63:1714–24. 

35. Skorecki K, Chertow GM, Marsden PA, Taal MW, Alan SL, Luyckx V. Anatómia obličiek: Lymfatika. V:Brenner arektorskýE-kniha Obličky. 10. vyd. Amsterdam: Elsevier (2015). p. 80–1.

36. Banerji S, Ni J, Wang SX, Clasper S, Su J, Tammi R a kol. LYVE-1, nový homológ CD44 glykoproteínu, je lymfatický špecifický receptor pre hyaluronan.J Bunka Biol. (1999) 144:789–801. 

37. Lee HW, Qin YX, Kim YM, Park EY, Hwang JS, Huo GH a kol. Expresia lymfatického endotelového hyalurónanového receptora LYVE-1 vo vyvíjajúcej sa obličke myši.BunkaTkanivoRes.(2011) 343:429–44.

38. Shelite TR, Liang Y, Wang H, Mendell NL, Trent BJ, Sun J a kol. IL- 33-závislá aktivácia endotelu prispieva k apoptóze a poškodeniu obličiek u orientovaných myší infikovaných tsutsugamushi.PLoS Negl Trop Dis.(2016) 10:e0004467.

39. Ferhat M, Robin A, Giraud S, Sena S, Goujon JM, Touchard G a kol. Endogénny IL-33 prispieva k ischemicko-reperfúznemu poškodeniu obličiek ako alarmín.J Am Soc Nephrol. (2018) 29:1272–88. 

40. Mchedlidze T, Waldner M, Zopf S, Walker J, Rankin A, Schuchmann M, et al. Vrodené lymfoidné bunky závislé od interleukínu-33- sprostredkovávajú pečeňovú fibrózu.Imunita. (2013) 39:357–71. 

41. Moretti S, Renga G, Oikonomou V, Galois C, Piano M, Iannitti RG, et al. Dráha žírnych buniek-ILC2-Th9 podporuje zápal pľúc pri cystickej fibróze.Nat komun. (2017) 8:14017. 

42. Hams E, Armstrong ME, Barlow JL, Saunders SP, Schwartz C, Cooke G a kol. IL-25 a vrodené lymfoidné bunky typu 2 indukujú pľúcnu fibrózu.ProcNatlAkad Sci USA. (2014) 111:367–72.

43. Wohlfahrt T, Usherenko S, Englbrecht M, Dees C, Weber S, Beyer C, et al. Počet vrodených lymfoidných buniek typu 2 je zvýšený u pacientov so systémovou sklerózou a koreluje s rozsahom fibrózy.Ann Rheum Dis.(2016) 75:623–6. 

44. Li D, Guabiraba R, Besnard AG, Komai-Koma M, Jabir MS, Zhang L a kol. IL-33 podporuje pľúcnu fibrózu závislú od ST{3}} indukciou alternatívne aktivovaných makrofágov a vrodených lymfoidných buniek u myší.J Allergy Clin Immunol. (2014) 134:1422–32. 

45. Sharp CN, Bábika MA, Megyesi J, Oropilla GB, Beverly LJ, Siskind LJ. Subklinické poškodenie obličiek vyvolané opakovaným podávaním cisplatiny má za následok progresívne chronické ochorenie obličiek.Am J Physiol Renálny Physiol.(2018) 315:F161–72? 

46. ​​Liu J, Kumar S, Dolzhenko E, Alvarado GF, Guo J, Lu C a kol. Molekulárna charakterizácia prechodu z akútneho na chronické poškodenie obličiek po ischémii/reperfúzii.JCI Insight.(2017) 2:94716. 

47. Li L, Huang L, Sung SJ, Lobo PI, Brown MG, Gregg RK a kol. Aktivácia NKT buniek sprostredkúva produkciu neutrofilov IFN-gama a renálne ischemicko-reperfúzne poškodenie.J Immunol.(2007) 178:5899–911.

48. Chan AJ, Alikhan MA, Odobasic D, Gan PY, Khouri MB, Steinmetz OM, et al. Vrodené leukocyty produkujúce IL-17A podporujú akútne poškodenie obličiek prostredníctvom inflammasómu a aktivácie Toll-like receptorov.Am J Pathol.(2014) 184:1411–8? 

49. Cao Q, Wang C, Zheng D, Wang Y, Lee VWS, Wang YM a kol. IL-25 indukuje M2 makrofágy a znižuje poškodenie obličiek pri proteinurickom ochorení obličiek.J Am Soc Nephrol. (2011) 22:1229–39.

50. Chung S, Overstreet JM, Li Y, Wang Y, Niu A, Wang S a kol. TGF-beta podporuje fibrózu po ťažkom akútnom poškodení obličiek zvýšením infiltrácie obličkových makrofágov.JCI Insight.(2018) 3:123563.