Predbežná štúdia na vzorkách cestovín charakterizovaných antioxidačnými zlúčeninami a ich biologickou aktivitou na obličkové bunky

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Federico Di Marco a spol

Abstrakt:Cestoviny patria medzi základné potravinyStredomorskýdiéta az tohto dôvodu bol vybraný pre túto štúdiu na vyhodnotenie jeho antioxidačných vlastností. Boli vybrané tri druhy cestovín: pohánkové, ražné a vaječné cestoviny. Kvalitatívno-kvantitatívne charakterizačné analýzy boli vykonané spoločnosťouHPLC-DADidentifikovať antioxidačné zlúčeniny. Údaje ukázali prítomnosť karotenoidov, ako je luteín, a polyfenolov, ako je kyselina indoloctová, (karotenoidy od {{0}},08 až 0,16 mg/100 g,polyfenolyod 3,7 do 7,4 mg/100 g). Na posúdenie účinku detegovaných metabolitov sa uskutočnili in vitro experimentyobličkymodely buniek: HEK-293 a MDCK. Štandardy -karoténu, kyseliny indoloctovej, kyseliny kávovej, hydroalkoholu a extraktov obohatených o karotenoidy zo vzoriek cestovín boli testované v prítomnosti antioxidačného činidla, aby sa určili variácie životaschopnosti. -Štandardy karoténu a kyseliny indoloctovej mali ochranný účinok na bunky HEK-293, zatiaľ čo na MDCK nebol zistený žiadny účinok. Testované koncentrácie sú pravdepodobne v rozsahu koncentrácií dosiahnutých v tele po konzumácii štandardných cestovinových jedál. Extrakty obohatené o karotenoidy a hydroalkoholové extrakty vykazovali rôzne účinky, pričom sa pozorovali záchrany pre hydroalkoholový extrakt z ražných cestovín a extrakt z pohánkových cestovín obohatený o karotenoid, zatiaľ čo vaječné cestoviny vykazovali miernejšie účinky v závislosti od dávky za predpokladu prooxidačného správania pri vysokých koncentráciách. Predbežné výsledky naznačujú, že správanie sa dá vysledovať späť k celým fytokomplexom s ohľadom na jednotlivé molekuly a je potrebné ďalšie skúmanie.

Kľúčové slová:cestoviny;Stredomorskýdiéta; polyfenoly; karotenoidy; antioxidačné zlúčeniny;obličkyzdravie;HPLC/DADanalýzy

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

1. Úvod

Napriek tomu neexistuje jednoznačná definíciaStredomorskýstrava – vzhľadom na variácie a úpravy kulinárskych tradícií nielen v oblasti Stredozemného mora, ale aj na celom svete [1] – stredomorskú stravu možno považovať za stravu obsahujúcu niekoľko zložiek, ktoré spĺňajú dôležité kritériá zdravej výživy: nízky obsah nasýtených mastné kyseliny, vysoký obsah zložených sacharidov, vláknina a molekuly antioxidantov a množstvo zeleniny.

Je ťažké určiť, ktoré potraviny alebo aktívne zložky v nich obsiahnutéStredomorskýstrava je najviac zodpovedná za zdravotné prínosy; hromadiace sa údaje naznačujú, že jeho hlavné výhody spočívajú v kombinácii komplexu a širokej škály rôznych živín, ktoré interagujú synergicky a aditívne [2].

V posledných rokoch narastajúca literatúra (observačné štúdie a randomizované kontrolné štúdie) preukázala zdravotné benefity spojené so stredomorskou stravou, znižovaním rizika vzniku viacerých chronických ochorení, ako sú kardiovaskulárne ochorenia [3–5], diabetes [6–10], rakovina [11,12], obezita [13–15] alebo kognitívne zdravie [16–19] a predlžujúca sa dĺžka života [20].

Zlepšenie krvného tlaku [21], lipidového profilu [22,23], inzulínovej rezistencie [24] a ochrany pred oxidačným stresom, zápalom, agregáciou krvných doštičiek a endoteliálnou dysfunkciou [25–28] sa javí ako mechanizmy účinku zodpovedné za priaznivé účinky na celkové zdravie. Všetky tieto biologické účinky podporované dodržiavaním stredomorského životného štýlu by mohli byť relevantné nielen pre vyššie uvedené chronické ochorenia, ale aj pre prevenciu renálneho kazu v bežnej populácii. Chronické ochorenie obličiek (CKD) predstavuje celosvetový problém verejného zdravia, ktorý postihuje viac ako 750 miliónov ľudí na celom svete a pôsobí často ticho a bez prekážok vďaka svojmu asymptomatickému klinickému obrazu. Rôzne línie dôkazov podčiarkli silný vzťah medzi stredomorskou stravou a konzerváciou obličiek [29].

Vzhľadom na všetky vyššie uvedené účinky ako rizikové faktory poklesu funkcie obličiek možno obličky považovať za jeden z primárnych cieľov. Nedávna metaanalýza kohortových štúdií ukázala, že rastlinná strava, ako je stredomorská strava alebo diétny prístup na zastavenie hypertenzie (DASH), boli spojené s nižším rizikom výskytuCKDa albuminúria vo všeobecnej populácii [30]. Jedným z vysvetlení by mohlo byť, že ovocie a zelenina obsahujú bioaktívne zlúčeniny chrániace pred zápalom a endoteliálnou dysfunkciou, ktoré podporujú dynamické zmeny filtračnej frakcie, čo vedie k progresívnemu zníženiu rýchlosti glomerulárnej filtrácie, expanzii objemu extracelulárnej tekutiny, abnormálnej iónovej rovnováhe a renálnej hypoxii. čo vedie k strate funkcie obličiek [31–33]. Okrem toho zvýšenie spotreby zeleniny, ovocia, obilnín a strukovín mohlo viesť k zníženiu spotreby živočíšnych bielkovín, čo má pozitívny vplyv na acidobázickú rovnováhu a glomerulárnu hemodynamikuobličkychráni pred glomerulárnou sklerózou a stratou funkcie [34–37].

Napriek tomu existuje niekoľko štúdií s kontrastnými údajmi o vplyve stravy s vysokým obsahom bielkovín na pokles funkcie obličiek vo všeobecnej populácii [38–41], rastúce dôkazy naznačujú, že zdroj bielkovín hrá dôležitú úlohu pri zachovaní funkcie obličiek a že prechod zo živočíšneho na rastlinný zdroj bielkovín môže byť prospešný [42,43].

Cestoviny sú jednou z najviac konzumovaných potravín na svete a sú jednou zo základných potravín stredomorskej stravy. Tradične je Taliansko hlavným výrobcom a lídrom v spotrebe cestovín, aj keď sa cestoviny konzumujú na celom svete kvôli nízkej cene, chutnosti a dlhšej skladovateľnosti ako iné pekárske výrobky [44]. Cestoviny sú dobrým zdrojom uhľohydrátov a energie (100 g varených cestovín obsahuje asi 31 g sacharidov a asi 158 kcal), ale zvyčajne majú nízky obsah lipidov, bielkovín, fosforu a draslíka, čo sú zložky živín obmedzené vo väčšine obličkových diét. ochorenie obličiek (dostupné online na https://fdc.nal.usda.gov, prístupné 1. decembra 2020). Prirodzene obohatené pšeničné cestoviny, ktoré predstavujú väčšinu komerčne dostupných cestovín, tiež ponúkajú dobré hladiny tiamínu, riboflavínu, niacínu, folátu, železa a selénu, ako aj polyfenolov. Okrem toho sa cestoviny vždy konzumujú v kombinácii s inými potravinami, ktoré by sa mohli považovať za silnejší zdroj polyfenolov, ako je olivový olej a zelenina. Cestoviny sa zvyčajne vyrábajú s krupice z tvrdej pšenice, kvôli jej vynikajúcim reologickým vlastnostiam, vynikajúcej farbe cestovín, kvalite varenia a prijatiu spotrebiteľom, ale v poslednej dobe sa cestoviny môžu vyrábať aj z iných obilnín, ako je ryža, pohánkový, ražný, špaldový.

V posledných rokoch si spotrebitelia viac uvedomujú, že vyvážená strava, akou je tá stredomorská, môže pozitívne ovplyvniť zdravie, a preto sa potravinársky priemysel snaží týmto požiadavkám vyhovieť výrobou kvalitných a funkčných potravín a zložiek potravín.

Napriek tomu, že obohatené potraviny boli vyrábané na zdravé účely, ľudia by mohli byť prinútení ich prijať namiesto vyváženej stravy. Toto je taká dôležitá téma, že podnietila FDA, aby zverejnila ad hoc dokument s názvom „Politika opevnenia FDA“, ktorý poskytne odpoveď na jednej strane potravinárskemu priemyslu a na druhej strane akademickému svetu [44].

Vyvážená, primeraná a pestrá strava je dôležitým krokom k šťastnému a zdravému životnému štýlu bez rizika preťaženia niektorými pridanými zložkami obsiahnutými v obohatených potravinách. Práve z tohto dôvodu boli znovuobjavené netradičné obilniny a pseudocereálie, ktoré otvorili cestu ich použitiu ako funkčných zložiek potravín, keďže majú niektoré nutričné ​​a funkčné vlastnosti, ktoré v tradičných obilninách chýbajú alebo chýbajú. Pohánka a raž sú bohatými zdrojmi fytochemikálií, ako sú polyfenoly, zlúčeniny, ktoré silne korelujú s antioxidačnými aktivitami [45,46].

Projekt MOLI-SANI, ktorý bol spustený v marci 2005, zahŕňal približne 25000 občanov s bydliskom v Molise (Taliansko), aby zhodnotil environmentálne a genetické faktory, ktoré sú základom kardiovaskulárnych chorôb, nádorov a neurodegeneratívnych chorôb. Podľa štúdie z projektu MOLI-SANI je príjem cestovín spojený s nižším BMI a nižšou úrovňou centrálnej obezity. Mnohé štúdie potvrdili, že k priberaniu vedú vysokokalorické diéty a nie diéta, ktorá obsahuje sacharidy. V skutočnosti, ak je porcia cestovín správna a omáčka nie je príliš kalorická, tanier cestovín môže mať kalorický obsah, ktorý rešpektuje dennú potrebu energie [47]. Cestoviny sú vysoko cenené, pretože ich vlastnosti sa spájajú nielen s kontrolou telesnej hmotnosti, ale aj s niekoľkými pozitívnymi zdravotnými vlastnosťami [48]. Randomizovaná, kontrolovaná štúdia vykonaná na zdravých subjektoch ukázala, že produkty na báze raže zlepšujú reguláciu glykémie, zvyšujú črevné hormóny zapojené do regulácie chuti do jedla a metabolizmu. Raž znižuje postprandiálne hladiny chuti do jedla znížením túžby po jedle, zvýšením sýtosti a znížením hladu zvýšením hormónov sýtosti GLP-1 (glukagónu podobný peptid-1) a peptidu YY (PYY). Nižšia postprandiálna glukózová odpoveď bola pozorovaná v skupine ľudí konzumujúcich potraviny na báze raže v porovnaní so skupinou subjektov konzumujúcich rafinovanú pšenicu. Je to preto, že raž je obilnina s nízkym glykemickým indexom, ktorú možno použiť aj u diabetických pacientov [49]. Raž môže zlepšiť plazmatický lipidový profil, v skutočnosti je príjem celej raže nepriamo spojený s koncentráciou LDL cholesterolu, pomerom LDL/HDL a koncentráciou triglyceridov. Tento účinok je spôsobený prítomnosťou vlákniny a -glukánov [50].

Cestoviny sú dobre známe ako zdroj uhľohydrátov, ale môžu obsahovať aj minoritné zlúčeniny, ako sú karotenoidy [51], najmä luteín, a iné druhy antioxidantov, ako sú polyfenoly. Tieto bioaktívne molekuly môžu byť obohatené o rôzne druhy cestovín v závislosti od surovín. Napríklad obsah karotenoidov v tvrdej pšenici je vyšší ako v chlebovej pšenici [52] a hladinu antioxidantov možno zvýšiť začlenením frakcie otrúb a celého zrna tvrdej pšenice do cestovín [53]. Pohánka je významným zdrojom fenolových zlúčenín, vitamínov a esenciálnych aminokyselín [54], zatiaľ čo pridanie vajec pri príprave cestovín prenáša karotenoidy a luteín. Karotenoidy sa podieľajú na preventívnej aktivite, najmä pri zápalovom syndróme a ich úloha spočíva v ich antioxidačných vlastnostiach [55] proti voľným radikálom a singletovému kyslíku [56]. Cestoviny obsahujú rôzne typy antioxidačných molekúl a pre častých konzumentov možno ich veľkú spotrebu považovať za dôležitý zdroj takýchto zdravých zlúčenín.

Tu ukazujeme, že rôzne druhy cestovín, konkrétne pohánkové, ražné a vaječné cestoviny, obsahujú rôzne množstvá antioxidačných zlúčenín, ktoré majú za úlohu zlepšiť životaschopnosť obličkových buniek v rovnovážnom stave alebo pri indukcii oxidačného stresu.

2. Materiály a metódy

2.1. Vzorky

Boli analyzované a testované tri vzorky varených cestovín: jedna vzorka celozrnných pohánkových cestovín (1), jedna vzorka celozrnných ražných cestovín (2) a jedna vzorka vaječných cestovín z dl múky z tvrdej pšenice mletej kôstky (3).

2.2. Príprava vzoriek cestovín

Celkovo 50 g celozrnných pohánkových cestovín alebo celozrnných ražných cestovín sa varilo v 500 ml vody počas 7 minút; 50 g vaječných cestovín z múky z tvrdej pšenice mletej v kôstku sa varilo v 500 ml vody počas 1 minúty, ako uvádza výrobca.

Na získanie extraktov obohatených o karotenoidy sa 10 g uvarených cestovín rozpustilo v 100 ml acetónu, sonikovalo sa za studena počas 30 minút. Vzorka sa odstreďovala 5 minút pri 5000 ot./min., supernatant sa za sucha odparil na rotačnej odparke a zvyšok sa rozpustil v acetóne alebo DMSO v závislosti od následnej analýzy. Na získanie extraktov obohatených o polyfenoly sa 10 g každej vzorky uvarených cestovín rozpustilo v 50 ml 70:30 EtOH/H20 pri pH 3,2. Vzorky boli trepané počas 24 hodín, centrifugované počas 5 minút pri 1400 ot./min. Vzorka sa odstreďovala 5 minút pri 5000 ot./min. a supernatant sa zhromaždil a analyzoval v HPLC-DAD, pričom alikvótna časť sa odparila do sucha a zvyšok sa rozpustil v DMSO na ošetrenie buniek.

2.3. HPLC-DA-MS analýza

Kvalitatívne kvantitatívne analýzy karotenoidov a polyfenolov sa uskutočňovali pomocou kvapalinovej chromatografie HP 1100 vybavenej detektorom DAD a riadenej pracovnou stanicou HP 9000 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) a napojenej na zberný spektrometer s rozhraním API/elektrosprej (Agilent Technologies). Prevádzkové podmienky hmotnostného spektrometra boli nasledovné: teplota plynu, 350 °C; prietok dusíka, 11,0 l/min; tlak rozprašovača, 40 psi; štvorpólová teplota, 100 ◦C; a kapilárne napätie, 4000 V. Hmotnostný spektrometer pracoval v pozitívnom a negatívnom režime pri 80–180 eV.

Zlúčeniny boli separované pomocou 250 x 4,6 mm id, 5 um LUNA C18 kolóny (Phenomenex, Torrance, CA, USA). UV/Vis spektrá boli zaznamenané v rozsahu 190–600 nm a chromatogramy boli získané pri 250, 280, 330, 350 a 450 nm. Vzorky sa analyzovali gradientovou elúciou pri nižšej rýchlosti 0,8 ml/min. Mobilnou fázou pre karotenoidy bol viacstupňový lineárny rozpúšťadlový gradientový systém (rozpúšťadlo A: acetón, rozpúšťadlo B: H20, pH 3,2 kyselinou mravčou), počnúc od 80 percent acetónu až po 100 percent za 30 minút. polyfenoly sa eluovali s použitím nasledujúceho gradientu: od 90 percent H20 (upravené na pH 3,2 kyselinou mravčou) po 100 percent CH3CN za 40 minút. Všetky použité rozpúšťadlá mali čistotu HPLC (BDHLaboratory Supplies, Poole, UK).

2.4. Kvantitatívna analýza

Kvantifikácia jednotlivých polyfenolových zlúčenín sa uskutočnila priamo pomocou HPLC-DAD pomocou päťbodovej regresnej krivky (R2 Väčšie alebo rovné 0,998) v rozsahu 0 – 30 µg na základe autentické štandardy. Konkrétne, flavonoly boli stanovené pri 350 zábavnom kvercetín 3-O-glukozide ako referenčnej zlúčenine, zatiaľ čo deriváty kyseliny kávovej sa stanovili pri 330 nm s použitím kyseliny chlorogénovej ako referenčnej zlúčeniny a derivátu kyseliny indoloctovej pri 280 nm s použitím 3 kyselín indoloctových (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Karotenoidy boli stanovené pri 450 nm s použitím beta-karoténu ako referenčnej zlúčeniny (Extrasynthese, Lione, Francia). Vo všetkých prípadoch boli skutočné koncentrácie derivátov vypočítané po použití korekcií na rozdiely v molekulovej hmotnosti.

2.5. Celkový obsah fenolov

Celkový obsah fenolov bol stanovený metódou Folin-Ciocalteu, ktorú opísal Singleton et al. [57] a mierne upravené podľa Dewanto et al. [58]. Do 125 µl vhodne zriedeného extraktu vzorky sa pridalo 0,5 ml deionizovanej vody a 125 µl Folin-Ciocalteuovho činidla. Zmes sa udržiavala 6 minút a potom sa pridalo 1,25 ml 7 % vodného roztoku Na2C03. Konečný objem sa upravil na 3 ml vodou. Po 90 minútach sa merala absorpcia pri 760 nm proti vode ako slepému pokusu. Množstvo celkových fenolických látok je vyjadrené ako ekvivalenty kyseliny galovej (GAE, mg kyseliny galovej/100 g vzorky) cez kalibračnú krivku kyseliny galovej. Kalibračná krivka sa pohybovala od 20 do 500 µg/ml (R2=0.9969) [57,58].

2.6. Bunková kultúra

Bunky ľudskej embryonálnej obličky 293 (HEK-293) a bunky psej obličky Madin-Darby (MDCK) sa kultivovali v DMEM doplnenom GlutaMAX, 10 percent (v/v), fetálnym hovädzím sérom, 100 U/ml penicilínu a 100 ug /ml streptomycínu pri 37 ◦C s 5 percentami CO2.

2.7. MTT test

5{{1{12}}}}}00 buniek/jamku MDCK a HEK-293 bunky sa naočkovali na 96-jamkové doštičky a nechali sa priľnúť 24 hodín. Na štúdie životaschopnosti sa bunky inkubovali 24 hodín až 72 hodín s beta karoténom, kyselinou indol-3-}octovou, kyselinou kávovou (v DMSO) a extraktmi z cestovín samotnými alebo v prítomnosti monoperoxyftalátu horečnatého (MMPP, Sigma-Aldrich Louis, MO, USA). Pre neošetrené vzorky sa použil DMSO v médiu v rovnakých koncentráciách, ako sú koncentrácie použité pre testované zlúčeniny. Testované koncentrácie pre štandardy boli v rozsahu od 2 pM do 10 uM, zatiaľ čo pre MMPP od 0,001 do 0,05 mg/ml. Životaschopnosť buniek sa merala 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Doštičky sa inkubovali pri 37 °C počas 1 hodiny a potom sa Formazan produkovaný redukciou MTT solubilizoval v DMSO. Absorbancia sa stanovila na čítačke mikrodoštičiek (Mithras LB 940-Berthold) pri 570 nm. Percento životaschopnosti buniek sa vypočítalo pomocou pomeru AbsTEST/AbsCTRL.

2.8. Štatistická analýza

Každý experiment sa uskutočňoval štvormo a opakoval sa aspoň trikrát. Rozdiely v percentách životaschopnosti sa hodnotili pomocou spárovaného Studentovho t-testu a dvojcestnej ANOVA, po ktorých nasledoval posthoc test s Holmovou korekciou pre viacnásobné porovnania koncentrácií metabolitov (p < 0,05).="" výsledky="" boli="" vyjadrené="" ako="" priemer="" ±="" štandardná="" chyba="" a="" analýza="" bola="" vykonaná="" v="" prostredí="" r-studio="" [59]="" pre="" r="" verziu="" 3.6.3="" [60]="" s="" použitím="" balíka="" "tidyverse"="">

3. Výsledky a diskusia

3.1. Stanovenie chemickej kvality vzoriek cestovín

Nutričné ​​informácie o potravinách umožňujú informovaný výber potravín a stravovania. Cestoviny sa tradične pripravujú zo semoliny, ale aj s inými obilninami všetky obsahujú ako hlavnú zložku škrob, po ktorom nasledujú bielkoviny, tuk, vitamíny, minerály a bioaktívne zlúčeniny [62]. V tabuľke S1 sú uvedené nutričné ​​údaje.

Pre porovnanie nutričných hodnôt niekoľkých druhov cestovín obohatených o bioaktívne zlúčeniny vďaka rôznym zdrojom obilnín alebo doplnením špecifických zložiek sme analyzovali pohánkové cestoviny, ražné cestoviny a vaječné cestoviny. Aby sa získali extrakty obohatené o rôzne podtriedy zlúčenín prítomných vo vzorkách cestovín, uskutočnili sa a analyzovali hydroalkoholové aj acetónové extrakcie. Jednotlivé polyfenoly boli predbežne identifikované pomocou údajov z analýzy HPLC-DAD-MS porovnaním a kombináciou ich retenčných časov a hmotnostnej spektrometrie a UV spektier (pozri obrázky S1 – S5 pre rovnaký príklad MS spektier) a porovnaním výsledkov so štandardmi (kaempferol, kvercetín, rutín a kyselina ferulová) a predchádzajúce bibliografické práce. Najmä v hydroalkoholových extraktoch boli identifikované flavonoidy, káva a deriváty kyseliny indoloctovej (tabuľka 1): derivát kyseliny indoloctovej je hlavnou zlúčeninou, ako už bolo opísané, dokonca aj pre krupicu. [63]. Čo sa týka relatívneho zloženia, pohánkové cestoviny vykazovali vyššie hladiny flavonoidov, najmä deriváty kvercetínu sú hlavnými flavonolmi, ako sa predtým uvádzalo v pohánke [64,65], a zanedbateľnú prítomnosť derivátov kyseliny kávovej; ražné cestoviny vykazovali vyššie hladiny derivátov kyseliny kávovej, najmä kyseliny ferulovej [66] a nízky obsah flavonoidov; vaječné cestoviny vykazovali len nízku koncentráciu flavonoidov (derivát apigenínu [67]) a žiadnu prítomnosť derivátov kyseliny kávovej.

Ako príklad sú na obrázku 1 uvedené chromatografické profily vzoriek varených cestovín zaznamenané pri 350 nm. Obrázok ukazuje kvalitatívne zloženie analyzovaných vzoriek.

Luteín bol hlavným karotenoidom identifikovaným v acetónových extraktoch s podobným relatívnym obsahom vzhľadom na celkové druhy karotenoidov, ako je uvedené v tabuľke 2 v súlade s predchádzajúcimi štúdiami [68]. V ražných cestovinách sa karotenoidy nezistili.

Prítomnosť antioxidačných sekundárnych metabolitov bola hodnotená aj vo vzorkách cestovín (tabuľka 3). Bola hodnotená celková antioxidačná kapacita biozložiek, pravdepodobne v dôsledku aktivity fenolu/polyfenolu a bol odvodený počet takýchto molekúl.

3.2. Účinok kyseliny indol-3-octovej,8-Karotén a kyselina kávová na životaschopnosť buniek

Stredomorská strava je uznávaná ako zdroj antioxidačných molekúl, ktoré chránia organizmus pred oxidačným stresom a podporujú zdravý stav [2]. Preto nás zaujímalo, či biomolekuly zistené v našich vzorkách cestovín môžu ovplyvniť životaschopnosť buniek a do akej miery. Použili sme bunky zdravých obličiek HEK-293 a MDCK na stanovenie aktivity štandardných zlúčenín kyseliny indoloctovej, -karoténu a kyseliny kávovej. Obličky sú obzvlášť citlivé na oxidačný stres a akumulácia voľných radikálov vedie k poruche funkcie obličiek [69]. Bunky sa inkubovali so skalárnou koncentráciou štandardných zlúčenín a v rôznych časových bodoch sa merala životaschopnosť buniek (obrázok 3 a obrázok S6).

Zistilo sa, že nemajú žiadny toxický účinok na bunky HEK{{0}}} pre všetky testované koncentrácie v čase inkubácie. Iba -karotén znížil životaschopnosť buniek v tvare U na bunkách HEK-293 a v závislosti od dávky v bunkách MDCK (obrázok 3). Je pozoruhodné, že koncentrácie pravdepodobne dosiahnuté v tele po konzumácii štandardného cestovinového jedla (zvyčajne 80 g) sú v rozsahu najnižších testovaných (2 × 10_5 –2 × 10_4 uM, [70 ,71]), čo poskytlo slabé zvýšenie životaschopnosti na oboch bunkových líniách. Na druhej strane, pri vyšších koncentráciách nad 0,2 uM, ktoré je možné získať len farmakologicky, kyselina kávová vykazovala výrazné zlepšenie životaschopnosti buniek, zatiaľ čo kyselina indoloctová a -karotén vykazovali porovnateľné účinky spolu so zvýšením koncentrácie (2–20 uM ) v bunkách HEK{18}} v danom čase.

3.3. Účinok kyseliny indol-3-octovej, -karoténu a kyseliny kávovej na bunky ošetrené MMPP

Ďalej nás zaujímalo, či kyselina indoloctová, -karotén a kyselina kávová môžu pôsobiť proti stresu vyvolanému oxidačným činidlom MMPP. Najprv sme testovali účinok MMPP vystavením buniek HEK-293 a MDCK sériovým riedeniam (0.005–0,05 mg/ml) lieku a určila sa životaschopnosť buniek. Po liečbe MMPP bol zaznamenaný pokles závislý od dávky a IC50 bola porovnateľná v dvoch testovaných bunkových líniách. Po inkubácii s 20–25 µg/ml MMPP sa životaschopnosť buniek významne znížila na približne 50–60 percent (obrázok 4) a polovica maximálnej inhibičnej koncentrácie (IC50) bola vypočítaná na 26 µg/ml pre HEK{{16} } a 22 ug/ml pre MDCK.

Potom sme testovali ochrannú aktivitu našich antioxidačných molekúl na bunkách ošetrených MMPP doplnením bunkového média 2 × 10_5 nM kyseliny indoloctovej, -karoténu alebo kávovej. Mierne pozitívny účinok na životaschopnosť buniek HEK-293 aj MDCK bol potvrdený použitím štandardov ako takých v dávke pravdepodobne odvodenej z časti cestovín (obrázok 5).

Ako sa očakávalo, MMPP znížil životaschopnosť buniek na 60–65 percent; ošetrenie kyselinou indoloctovou alebo -karoténom pôsobí proti účinku MMPP a zachránilo životaschopnosť buniek o 30 percent (p < 0,001)="" a="" 27="" percent="" (p=""> 0,01) na bunkách HEK{10}}, zatiaľ čo kyselina kávová nevykazovala žiadny významný účinok. V prítomnosti oxidačného činidla beta-karotén a kyselina indoloctová vykazovali ochranný účinok na bunky v nízkej koncentrácii, zatiaľ čo kyselina kávová nepôsobila proti oxidačnému stresu v koncentrácii potrebnej na zvýšenie životaschopnosti buniek. Tieto pozitívne účinky sú pravdepodobne spôsobené antioxidačnými vlastnosťami kyseliny indoloctovej a karotenoidov, ktoré môžu významne vyvážiť cytotoxicitu sprostredkovanú MMPP pri dávke použitej v tomto experimentálnom stave. Napriek tomu nebola pozorovaná žiadna významná záchrana na bunkách MDCK ošetrených MMPP, čo naznačuje, že aj keď samotné štandardy vykazovali výrazne pozitívny účinok na životaschopnosť buniek, nie sú dostatočné na riešenie oxidačného stresu vyvolaného MMPP. Embryonálne bunky HEK 293 sa zdajú byť pohotovejšie na usporiadanie obrannej línie proti stresu ako dospelí MDCK, pravdepodobne kvôli ďalším bunkovým redoxným homeostázovým systémom.

3.4. Účinok frakcie obohatenej karotenoidmi získanými z cestovín na cytotoxicitu indukovanú MMPP

Na vyhodnotenie účinkov frakcií obohatených karotenoidmi pochádzajúcich z acetónovej extrakcie z pohánkových cestovín a vaječných cestovín na obličkové bunky v prítomnosti oxidačného stresu sa bunky HEK-293 inkubovali s rôznymi koncentráciami extraktov v poradí od 2 × { {3}} uM až 2 × 10_3 uM v prítomnosti MMPP počas 72 hodín (obrázok 6 a tabuľka S2). Použitá koncentrácia sa vzťahuje na koncentráciu -karoténu zistenú v extrakte (tabuľka2). Obsah luteínu sa pohyboval od 1,5 × 10_6 uM do 1,5 × 10_3 uM v pohánkových cestovinách a od 1,34 × 10_6 uM do 1,34 × 10_3 uM vo vaječných cestovinách.

Prítomnosť prírodných fytokomplexov v oboch acetónových extraktoch vykazovala odlišné účinky v porovnaní s jediným štandardom, čo viedlo k vyššej aktivite pri nižších koncentráciách. Keď sa koncentrácia extraktov z vaječných cestovín zvyšuje, pozorovalo sa zníženie životaschopnosti buniek. Najnižšia koncentrácia karotenoidových extraktov (2 x 10-6 µM) vyvolala mierny pozitívny účinok samostatne alebo v prítomnosti MMPP na HEK-293 bunky. Extrakt z pohánkových cestovín vyvolal zvýšenie životaschopnosti buniek ako samotný extrakt, ale aj v prítomnosti MPP v rozsahu od 32 ± 5 percent pri najnižšej koncentrácii do 21 ± 9 percent pre 2 x 10-4 uM.

Aktivita acetónových extraktov sa hodnotila aj na bunkách MDCK v prítomnosti alebo neprítomnosti MMPP a porovnávala sa s aktivitou získanou v bunkách HEK{0}} (obrázok 7 a tabuľka S2).

Extrakty obohatené o karotenoidy poskytli celkový účinok na životaschopnosť pri všetkých testovaných koncentráciách pre oba druhy cestovín. Pokiaľ ide o pohánku HEK-293, cestovinový extrakt poskytol lepšiu záchranu pri liečbe MMPP pre všetky dávky v rozsahu od 50 ± 7 percent do 82 ± 5 percent v porovnaní s bunkami HEK{7}}; extrakty z vaječných cestovín mali malú záchranu iba pri najnižšej koncentrácii karotenoidov 2 × 10_6 uM v prítomnosti MMPP, čo naznačuje, že špecifické zloženie extraktov hrá kľúčovú úlohu v reakcii. Pohánkové cestoviny teda vykazovali väčšiu záchrannú kapacitu na životaschopnosť buniek v porovnaní s vaječnými cestovinami a keďže experimenty boli vykonané s rovnakým množstvom -karoténu, rozdiel mohol byť spôsobený prítomnosťou minoritných zlúčenín, ako sú zlúčeniny flavonoidov, vyššie v bývalom.

Druhy karotenoidov sa zúčastňujú rôznych chemických reakcií, ktoré majú dvojitú povahu oxidantu a antioxidantu v závislosti od biologického kontextu a ich koncentrácií: táto vysoká reaktivita je spôsobená prítomnosťou konjugovaných dvojitých väzieb [72]. Ich antioxidačná úloha bola spojená so schopnosťou delokalizovať elektróny dané oxidačnými druhmi a radikálmi [73,74]. V prítomnosti vysokých oxidačných podmienok sa ich aktivita môže premeniť na prooxidant [75]. V našich prípadoch bolo toto zistenie pozorované vo vaječných cestovinách pre HEK-293 (ako samostatne, tak aj v prítomnosti MMPP) a MDCK bunky v prítomnosti MMPP, kde rôzne dávky acetónového extraktu vyvolali opačné účinky.

3.5. Účinok hydroalkoholového extraktu na cytotoxicitu indukovanú MMPP

Potom sme vyhodnotili účinky hydroalkoholových extraktov z pohánkových cestovín, ražných cestovín a vaječných cestovín na obličkové bunky testovaním rôznych koncentrácií v rozmedzí od 5 × 10_5 uM do 5 × 10_1 uM s MMPP alebo bez neho. (Obrázok 8 a tabuľka S3). Použitá koncentrácia sa vzťahuje na koncentráciu celkového obsahu fenolov zistených v extrakte (tabuľka 3). Podľa obsahu vzoriek cestovín uvedených v tabuľke 1 bola pre pohánkové cestoviny koncentrácia kyseliny indoloctovej hodnotená od 1,85 × 10_5 uM do 1,85 × 10_1 uM, pre deriváty kyseliny kávovej bola hodnotená od 3,5 × 10_6 uM až 3,5 × 10_2 uM a pre obsah flavonoidov bolo hodnotenie od 2,8 × 10_5 uM do 2,8 × 10_1 uM; v prípade ražných cestovín bola koncentrácia kyseliny indoloctovej v rozmedzí od 2,2 × 10_5 uM do 2,2 × 10_1 uM, v prípade derivátov kyseliny kávovej od 1,95 × 10_5 uM do 1,95 × {{37} } uM a pre druhy flavonoidov od 8,5 × 10_6 uM do 8,5 × 10_2 uM; pre vaječné cestoviny sa koncentrácia kyseliny indoloctovej pohybovala od 4,25 × 10_5 uM do 4,25 × 10_1 uM, pre druhy flavonoidov od 7,5 × 10_6 uM do 1,85 × 10_2 uM, zatiaľ čo neboli prítomné žiadne deriváty kyseliny kávovej.

Hydroalkoholový extrakt z vaječných cestovín nemal žiadny významný vplyv na životaschopnosť HEK- 293 nezávisle od prítomnosti oxidačného stresu. Extrakt z pohánkových cestovín ukázal zvýšenie životaschopnosti buniek po ošetrení MMPP len pri najvyššej koncentrácii (28 ± 6 percent). Samotný extrakt z ražných cestovín vykazoval všeobecné zvýšenie životaschopnosti buniek pre všetky dávky v rozmedzí od 14 ± 7 percent do 18 ± 1 percenta, ako aj v prítomnosti MMPP od 27 ± 3 percent do 13 ± 3 percent. Fytokomplex prezentovaný v extraktoch sa ukázal byť aktívnejší ako jednotlivé štandardy, pričom mal vplyv na životaschopnosť buniek pri nižších koncentráciách v porovnaní s týmito štandardmi. Tieto výsledky naznačujú, že v hydroalkoholových extraktoch možno hlavnú úlohu pri záchrane pripísať prítomnosti derivátov kyseliny kávovej, pričom sa pozoruje vyššia ochrana pri ražných cestovinách a nižší/zanedbateľný účinok pri vaječnej paste, v ktorej nie sú detekovateľné.

Hydroalkoholový extrakt sa potom testoval na bunkách MDCK v rovnakých podmienkach ako predtým a hodnotila sa životaschopnosť buniek (obrázok 9 a tabuľka S4).

Hydroalkoholový extrakt z pohánky a vaječných cestovín vykazoval kontrastné účinky na životaschopnosť buniek: prvý ju zvyšuje, zatiaľ čo druhý ju znižuje; u oboch sa nezistil žiadny účinok na liečbu MMPP. Samotný extrakt z ražných cestovín nepreukázal žiadny významný vplyv na životaschopnosť buniek, ale odhaľuje silný ochranný účinok proti oxidačnému stresu sprostredkovanému MMPP vo všetkých koncentráciách v rozmedzí od 50 ± 7 percent do 61 ± 21 percent. V štandardných podmienkach.

V neprítomnosti MMPP sa zdá, že vysoký obsah kyseliny indoloctovej v extrakte z vaječných cestovín má toxický účinok na životaschopnosť buniek. Pri porovnaní týchto dvoch bunkových modelov sme pozorovali rôzne správanie vzhľadom na pohánkové a ražné cestoviny v neprítomnosti MMPP. Najmä HEK-293 vykázala zvýšenú životaschopnosť s druhým, zatiaľ čo MDCK s prvým. Rozdiely súvisia s pôsobením fotokomplexov, ktoré sa vyznačujú vyšším obsahom flavonoidov pre pohánkové cestoviny. Záchrana životaschopnosti buniek medzi vzorkami, ako bolo pozorované pre obe bunkové línie, zodpovedá zvýšenému obsahu derivátov kyseliny kávovej v ražných cestovinách.

Štúdium interakcie medzi polyfenolmi obsahujúcimi fytokomplexy a obličkovými bunkami by mohlo pomôcť preskúmať známe dôležité účinky týchto zlúčenín na fyziológiu obličiek [76] so zameraním na jeden z možných nosičov, cestoviny, ktoré sa zvyčajne spájajú so zdravou stravou obličiek. Vo všeobecnosti majú metabolity polyfenolov plazmatický polčas niekoľko hodín a sú rýchlo eliminované obličkami a pečeňou: močom a žlčou. Celkové množstvo polyfenolových metabolitov vylučovaných močom koreluje nielen s ich maximálnou plazmatickou koncentráciou, ale aj s ich schopnosťou vylučovať sa skôr žlčou ako močovým traktom. Napríklad vylučovanie kvercetínu a jeho glykozidov močom predstavuje 0,3–1,4 percenta požitej dávky [77]; kyselina kávová a ferulová predstavujú 5,9 percenta a 27 percent. Preto polyfenoly získané z cestovín môžu mať pozitívny vplyv na obličkové bunky v závislosti od ich

množstvo a metabolizmus. Na lepšie definovanie ich prínosu pre zdravie obličiek sú potrebné ďalšie štúdie.

Doplnkové materiály:Nasledujúce sú dostupné online na https://www.mdpi.com/article/ 10.3390/nu13041131/s1, Tabuľka S1: Nutričná tabuľka. Tabuľka S2 – Detekcia variácie bunkovej životaschopnosti HEK-293 a MDCK inkubovaných so zvyšujúcim sa množstvom karotenoidmi obohatenej frakcie z pohánkových cestovín a vaječných cestovín na médiu a MMPP pre 72 (HEK{9}}) a 24 ( MDCK) hodiny. * p < {{20}}.5,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< {{30}}.001="" .="" tabuľka="" s3="" –="" detekcia="" variácie="" bunkovej="" životaschopnosti="" hek-293="" inkubovaných="" so="" zvyšujúcim="" sa="" množstvom="" hydroalkoholového="" extraktu="" z="" pohánkových="" cestovín,="" ražných="" cestovín="" a="" vaječných="" cestovín="" na="" médiu="" a="" mmpp="" počas="" 72="" hodín.="" *="" p="">< 0,5,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001.="" tabuľka="" s4="" -="" detekcia="" zmeny="" životaschopnosti="" buniek="" mdck="" inkubovaného="" so="" zvyšujúcim="" sa="" množstvom="" hydroalkoholového="" extraktu="" z="" pohánkových="" cestovín,="" ražných="" cestovín="" a="" vaječných="" cestovín="" na="" médiu="" a="" mmpp="" počas="" 24="" hodín.="" *="" p="">< 0,5,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001.="" obrázok="" s1:="" ms="" spektrá="" kaempferolu="" v="" hydroalkoholovom="" extrakte="" z="" varených="" cestovín="" z="" pohánky.="" obrázok="" s2:="" ms="" spektrá="" kvercetínu="" v="" hydroalkoholovom="" extrakte="" z="" varených="" cestovín="" z="" pohánky.="" obrázok="" s3:="" ms="" spektrá="" rutínu="" v="" hydroalkoholovom="" extrakte="" varených="" cestovín.="" obrázok="" s4:="" ms="" spektrá="" kyseliny="" ferulovej="" jedna="" v="" hydroalkoholovom="" extrakte="" uvarených="" cestovín="" z="" raže.="" obrázok="" s5:="" ms="" spektrá="" apigenínových="" glykozidov="" v="" hydroalkoholovom="" extrakte="" cestovín="" uvarených="" vo="" vajciach.="" obrázok="" s6:="" životaschopnosť="" detekčných="" buniek="" hek-293="" inkubovaných="" so="" zvyšujúcim="" sa="" množstvom="" kyseliny="" indoloctovej,="" -karoténu="" a="" kyseliny="" kávovej="" počas="" 24="" (a)="" a="" 48="" (b)="" hodín="" uvádzané="" hodnoty="" zodpovedajú="" priemeru="" životaschopnosti="" buniek="" so="" štandardnou="" chybou="" v="" troch="" biologických="" replikátoch.="" percento="" životaschopnosti="" buniek="" sa="" vypočítalo="" pomocou="" pomeru="">

References

1. Lacatus,u, CM; Grigorescu, ED; Floria, M.; Onofriescu, A.; Mihai, BM Stredomorská strava: Od kultúry jedla riadenej životným prostredím až po nový lekársky predpis. Int. J. Environ. Res. Verejné zdravotníctvo 2019, 16, 942.

2. Jacobs, DR; Gross, MUDr. Tapsell, LC Food synergy: Operačný koncept na pochopenie výživy. Am. J. Clin. Nutr.2009, 89, 1543S.

3. De Lorgeril, M.; Salen, P.; Martin, J.-L.; Monjaud, I.; Delaye, J.; Mamelle, N. Stredomorská strava, tradičné rizikové faktory a miera kardiovaskulárnych komplikácií po infarkte myokardu. Circulation 1999, 99, 779–785.

4. Psaltopoulou, T.; Naska, A.; Orfanos, P.; Trichopoulos, D.; Mountokalakis, T.; Trichopoulou, A. Olivový olej, stredomorská strava a arteriálny krvný tlak: Štúdia The Greek European Prospective Investigation to Cancer and Nutrition (EPIC). Am. J. Clin. Nutr. 2004, 80, 1012–1018.

5. Estruch, R.; Ros, E.; Salas-Salvad6, J.; Covas, M.-I.; Corella, D.; Ar6s, F.; G6mez-Gracia, E.; Ruiz-Gutierrez, V.; Fiol, M.; Lapetra, J.; a kol. Primárna prevencia kardiovaskulárnych ochorení pomocou stredomorskej stravy. Z. Gefassmedizin 2013, 10, 28.

6. Uusitupa, M.; Khan, TA; Viguiliouk, E.; Kahleová, H.; Rivellese, AA; Hermansen, K.; Pfeiffer, A.; Thanopoulou, A.; Salaš-Salvad6, J.; Schwab, U.; a kol. Prevencia diabetu 2. typu zmenami životného štýlu: Systematický prehľad a metaanalýza. Živiny 2019, 11, 2611.

7. Jannasch, F.; Kröger, J.; Schulze, MB Diétne vzorce a diabetes typu 2: Systematický prehľad literatúry a metaanalýza prospektívnych štúdií. J. Nutr. 2017, 147, 1174–1182.

8. Esposito, K.; Chiodini, P.; Maiorino, MI; Bellastella, G.; Panagiotakos, D.; Giugliano, D. Ktorá diéta na prevenciu cukrovky 2. typu? Metaanalýza prospektívnych štúdií. Endokrinné 2014, 47, 107–116.

9. Huo, R.; Du, T.; Xu, Y.; Xu, W.; Chen, X.; Sun, K.; Yu, X. Účinky stravy v stredomorskom štýle na kontrolu glykémie, chudnutie a kardiovaskulárne rizikové faktory u jedincov s cukrovkou 2. typu: metaanalýza. Eur. J. Clin. Nutr. 2015, 69, 1200–1208.

10. Martin-Peldez, S.; Fito, M.; Castaner, O. Účinky stredomorskej stravy na prevenciu cukrovky 2. typu, progresiu ochorenia a súvisiace mechanizmy. Recenzia. Živiny 2020, 12, 2236.

11. Milajerdi, A.; Namazi, N.; Larijani, B.; Azadbacht, L. Asociácia indexov kvality stravy a úmrtnosti na rakovinu: Systematický prehľad a metaanalýza kohortových štúdií. Nutr. Rak 2018, 70, 1091–1105.

12. Schwingshackl, L.; Schwedhelm, C.; Gilbert, C.; Hoffmann, G. Dodržiavanie stredomorskej stravy a riziko rakoviny: Aktualizovaný systematický prehľad a metaanalýza. Živiny 2017, 9, 1063.

13. Say6n-Orea, C.; Razquin, C.; Bull6, M.; Corella, D.; Fit6, M.; Romaguera, D.; Vioque, J.; Alonso-G6mez, AM; Wärnberg, J.; Martinez, JA; a kol. Účinok nutričnej a behaviorálnej intervencie na dodržiavanie stredomorskej diéty so zníženou energiou u pacientov s metabolickým syndrómom: Predbežná analýza randomizovanej klinickej štúdie PREDIMED-Plus. JAMA J. Am. Med. Doc. 2019, 322, 1486–1499.

14. Bajerová, J.; Chmurzynska, A.; Muzsik, A.; Krzyz˙ anowska, P.; Ma˛dry, E.; Malinowska, AM; Walkowiak, J. Strata hmotnosti a metabolické zdravotné účinky z energeticky obmedzenej stredomorskej a stredoeurópskej stravy u žien po menopauze: Randomizovaná kontrolovaná štúdia. Sci. Rep. 2018, 8, 11170.

15. Estruch, R.; Martinez-Gonzalez, MA; Corella, D.; Salas-Salvad6, J.; Fit6, M.; Chiva-Blanch, G.; Fiol, M.; G6mez-Gracia, E.; Ar6s, F.; Lapetra, J.; a kol. Vplyv stredomorskej stravy s vysokým obsahom tuku na telesnú hmotnosť a obvod pása: Predbežná analýza sekundárnych výsledkov randomizovanej kontrolovanej štúdie PREDIMED. Lancet Diabetes Endocrinol. 2019, 7, e6–e17.

16. Molendijk, M.; Molero, P.; Ortuño Sdnchez-Pedreño, F.; Van der Does, W.; Angel Martinez-Gonzalez, M. Kvalita stravy a riziko depresie: Systematický prehľad a metaanalýza dávka-odpoveď prospektívnych štúdií. J. Affect. Porucha. 2018, 226, 346–354.

17. Wu, L.; Sun, D. Dodržiavanie stredomorskej stravy a riziko vzniku kognitívnych porúch: Aktualizovaný systematický prehľad a metaanalýza prospektívnych kohortových štúdií. Sci. rep. 2017, 7, 1–9.

18. Loughrey, GR; Lavecchia, S.; Brennan, S.; Lawlor, BA; Kelly, ME Vplyv stredomorskej stravy na kognitívne fungovanie zdravých starších dospelých: Systematický prehľad a metaanalýza. Adv. Nutr. 2017, 8, 571–586.

19. Arnold, SE; Arvanitakis, Z.; Macauley-Rambach, SL; Koenig, AM; Wang, HY; Ahima, RS; Craft, S.; Gandy, S.; Buettner, C.; Stoeckel, LE; et a Mozgová inzulínová rezistencia pri cukrovke typu 2 a Alzheimerovej chorobe: Pojmy a hádanky. Nat. Neurol. 2018, 14, 168–181.

20. Trichopoulou, A.; Vasilopoulou, E. Stredomorská strava a dlhovekosť. Br. J. Nutr. 2020, 84, S205 – S209.