GRP78 spúšťa nadmernú expresiu RUŽOVÁ1-Neuroprotektívna mitofágia sprostredkovaná IP3R, časť 2

2.5. Western Blot

Potkany sme hlboko anestetizovali pomocou Dolethala (n=4) pri 7 dpi, aby sme získali segmenty miechy L4–L5 (dĺžka 5- mm) na analýzu Western blot. Vzorky sme rýchlo zmrazili v tekutom dusíku.

V posledných rokoch stále viac výsledkov výskumov ukazuje, že medzi proteínovým blottingom a pamäťou existuje úzky vzťah. Proteínový prenos je analytická technika na detekciu expresie proteínov, ktorá sa široko používa v neurovedeckom výskume.

Spojenie medzi neurónmi úzko súvisí s ukladaním pamäte. Proteínové blotovanie môže zistiť stav spojenia medzi neurónmi a expresiu pre- a postsynaptických proteínov, čo ďalej odhaľuje dôležitú úlohu proteínov pri tvorbe a ukladaní pamäte.

Štúdie zistili, že expresia presynaptických neurónových proteínov úzko súvisí s tvorbou a ukladaním pamäte. Napríklad počas procesu učenia a pamäte neuróny menia expresiu presynaptických proteínov a táto zmena súvisí s tvorbou a ukladaním nových spomienok. Okrem toho niektoré štúdie tiež zistili, že zmeny v expresii niektorých proteínov súvisia s neurodegeneratívnymi ochoreniami, ako je Alzheimerova choroba.

Preto môže blotting proteínov poskytnúť hĺbkové pochopenie stavu spojenia medzi neurónmi a zmien v expresii príbuzných proteínov, čo odhalí molekulárny mechanizmus neurónov. To má veľký význam pre štúdium mechanizmu tvorby pamäti a neurodegeneratívnych ochorení.

Stručne povedané, vzťah medzi prenosom proteínov a pamäťou ukazuje úlohu proteínov v spojení medzi neurónmi a ukladaním pamäte. To poskytuje nové nápady a smery pre štúdium mechanizmu tvorby pamäti a neurodegeneratívnych ochorení. Aktívne propagujme neurovedecký výskum a prispejme k zdraviu a dlhovekosti! Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche dokáže výrazne zlepšiť pamäť, pretože má antioxidačné, protizápalové a anti-aging účinky, ktoré môžu pomôcť znížiť oxidačné a zápalové reakcie v mozgu, a tým chrániť zdravie nervovej sústavy. systém. Okrem toho môže Cistanche tiež podporovať rast a opravu nervových buniek, čím zvyšuje konektivitu a funkciu neurónových sietí. Tieto účinky môžu pomôcť zlepšiť pamäť, schopnosť učenia a rýchlosť myslenia a môžu tiež zabrániť výskytu kognitívnej dysfunkcie a neurodegeneratívnych ochorení.

Kliknite na vedieť spôsoby, ako zlepšiť funkciu mozgu

Vzorky boli uskladnené alebo ďalej spracované homogenizáciou v lyzovacom pufri (20 mM HEPES, pH 7,7, 251 mM sacharóza, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA a kokteil proteázy (Sigma-Aldrich) a inhibítory fosfatázy (Roche, Basel, Švajčiarsko) ) s Potterovým homogenizátorom na ľade.

Po centrifugácii lyzátov pri 800 x g počas 20 minút pri 4 °C sme odobrali supernatant ako postnukleárnu frakciu a kvantifikovali proteíny pomocou BCAassay (Pierce Chemical Co.).

Pre western blotting sme naniesli 30 µg postnukleárnych frakcií segmentov L4–L5 z každého zvieraťa na 12% SDS-polyakrylamidové gély, aby sme vykonali elektroforetickú separáciu proteínov s následným prenosom na PVDF membránu v systéme BioRadcuvette v 25 mM. Tris, pH 8,4, 192 mM glycín, 20 % (v/v) metanol.

Témy sme zablokovali 5 % BSA v PBS plus 0,1 % Tween-20 na 1 hodinu pri izbovej teplote a potom sme inkubovali pri 4 ◦C cez noc s primárnou protilátkou: myšací anti- -aktín ( 1:10000), myšacia anti-GRP78 (1:500, Sigma-Aldrich), myšacia anti-CV (1:1000, Invitrogen), králičia anti-HSP60 (1:500, protilátky-online), myšacia anti- NDUFA9 (1:1000, Invitrogen),myšia anti-OPA1 (1:1000, BD Biosciences), králičia antiparkina (1:500, Abcam, Cambridge, UK), myšacia anti-PINK1 (1:500, Abcam), králičia anti-NRF2 (1:500, Abcam), anti-MNF2 (1:500, Abcam), králičia anti-GRP75 (1:500, Abcam).

Po niekoľkých premytiach sa membrány inkubovali 2 hodiny s vhodnou sekundárnou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou (1:50}00, vektor). Membrána sa vizualizovala pomocou chemiluminiscenčnej zmesi 1:1 (0,5 M luminol, 79,2 mM kyselina p-kumarová, 1 M Tris-HCl, pH 8,5) a (8,8 M peroxid vodíka, 1 M Tris-HCl; pH 8,5). snímky boli urobené pomocou prístroja Gene Genome a analyzované pomocou softvéru Gene Snap a Gene Tools (Syngene).

2.6. Model in vitro

Bunky NSC34 sa kultivovali v modifikovanom Eaglovom médiu s vysokým obsahom glukózy (DMEM, Biochrom, Cambridge, UK) doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom (Sigma-Aldrich), 100 jednotiek/ml penicilínu a 0,5-násobným roztokom penicilín/streptomycín (Sigma-Aldrich) a udržiavané vo zvlhčenom inkubátore pri 37 ◦C pod 5 % CO2, v podstate ako je opísané vyššie [26].

Po 4 dňoch kultivácie buniek bez výmeny média mali bunky NSC34 fenotyp podobný diferenciácii charakterizovaný prítomnosťou dlhých neuritov. Na 4. deň boli do buniek pridané liečivá. Roztoky Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) a EFV (Bristol-Myers Squibb, New York, USA) boli pripravené v koncentrácii 10X a rozpustené v DMEM.

Po 24 hodinách sa životaschopnosť buniek vyhodnotila inkubáciou buniek s roztokom 4 mg/ml MTT počas 3 hodín. Vytvorené modré formazanové kryštály sa rozpustili v DMSO a merala sa absorbancia pri 570 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, USA).

2.7. Nukleofekcia

Transfekovali sme milión buniek s 2 µg plazmidom na expresiu GFP, GRP78, HAPARK, myšieho sh-eGFP, myšieho sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), myšieho sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio) a /alebo myš sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) s použitím Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Basel, Švajčiarsko) a súpravy Nucleofactor V (Lonza) podľa odporúčaní výrobcu.

Pre statickú cytometrickú analýzu sme bunky naočkovali do {{0}}jamkových platní potiahnutých 10 % kolagénom. Po kultivácii sme bunky zafixovali 4 % PFA, dvakrát premyli PBS a uskladnili alebo následne pridali blokovací pufor obsahujúci PBS 0,3 % (v/v) Triton X-100 a 10 % fetálneho hovädzieho séra. Po 3 dňoch kultivácie buniek sa pridali liečivá rozpustené v DMEM.

Na tieto experimenty sme použili 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich) alebo 10 µM BAPTA-AM (Sigma -Aldrich). Po 5 hodinách po ošetrení sme bunky buď fixovali na imunocytochémiu pomocou 4 % PFA, alebo sme ich homogenizovali v modifikovanom RIPA pufri (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA , 1 % NP-40, 0,5 % deoxycholát sodný, 0,1 % SDS, proteázové a fosfatázové koktaily) na imunoblotovanie. Imunohistochémia sa uskutočnila tak, že sa vzorky dvakrát prepláchli PBS a inkubovali sa s blokovacím pufrom obsahujúcim PBS plus 0,3 % (v/v) Triton X-100 a 10 % fetálne hovädzie sérum.

Inkubovali sme s nasledujúcimi primárnymi protilátkami: králičie anti-IP3R (1:200, Abcam), myšacie anti-HA (1:2000, Abcam), myšacie anti-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich) a králičie anti-HSP60 (1:500, Protilátky-online). Na posúdenie životaschopnosti pomocou MTT, ako je opísané vyššie, sme liečbu nechali 24 hodín.

2.8. Meranie produkcie mitochondriálneho superoxidu a ∆ψM

Bunky boli inkubované s 2,5 uM MitoSOX na analýzu superoxidu alebo s 2,5 uMTMRM na analýzu ∆ψM, ako od Molecular Probes, tak Invitrogen počas posledných 30 minút liečby. Fluorescencia sa detegovala mikroskopom IX81 Olympus a kvantifikovala sa pomocou softvéru statickej cytometrie.

2.9. Elektrochemické meranie spotreby kyslíka

Bunky (1 x 106 na 1 ml v HBSS) sa pretrepávali v plynotesnej komore pri 37 ◦C. Merania sa robili pomocou elektródy Clark typu O2 (Rank Brothers, Cambridge, UK) a zaznamenávali sa s údajmi Dup.18 akvizičné zariadenie (WPI) ihneď po 5-ošetrení vozidlom alebo Tun.

2.10. Mitochondriálna a cytosolická frakcionácia

Bunky sa homogenizovali v lyzovacom pufri (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EGTA, 250 mM sacharóza a kokteil proteáz (Sigma-Aldrich) a inhibítorov fosfatázy (Roche)) s Potterovým homogenizátorom na ľade.

Po centrifugácii lyzátov pri 2000x g počas 5 minút sa supernatant centrifugoval pri 10 000 x g počas 12 minút. Supernatant bol považovaný za rozpustnú frakciu (S2) a obsahuje cytosolické proteíny a mikrozómy.

Peleta (P2) bola obohatená mitochondriálna frakcia, ktorá bola resuspendovaná v modifikovanom RIPA pufri (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 % NP{{8 }}, 0,5 % deoxycholátu sodného, ​​0,1 % SDS, proteázových a fosfatázových koktailov) a koncentrácia proteínu sa stanovila BCA testom. Vzorky sa potom spracovali na Western blot.

2.11. Transmisná elektrónová mikroskopia

Segmenty L5 miechy L{{0}}} (1-mm plátky) sme ponorili do fixačného roztoku 2 % (w/v) PFA a 2,5 % (v/v) glutaraldehydu (EM grade) v 0,1 M PBS, pH 7,4 a umiestnili ich na hojdaciu plošinu na 2 hodiny, potom sa fixovali v 1 % (w/v) PFA a následne sa dodatočne fixovali 1 % (w/v) oxidom osmičelým (TAAB Lab s obsahom 0,08 % (hmotn./obj.) hexakyanoželezitanu draselného (Sigma-Aldrich) v PBS počas 2 hodín.

Vykonali sme štyri premytia deionizovanou vodou a sekvenčnú dehydratáciu v acetóne. Všetky postupy sa uskutočňovali pri 4 °C, ako už bolo opísané [33]. Vzorky sme vložili do EPON živice a polymerizovali pri 60 ◦C počas 48 hodín.

Vzorky boli spracované, aby sa získali polotenké rezy (1 um) pomocou mikrotómu Leicaultracut UCT, zafarbené 1 % (w/v) vodným roztokom toluidínovej modrej a skúmané svetelným mikroskopom na identifikáciu oblastí ventrálnych rohov obohatených o MN.

Ultratenké rezy (70 nm) sa narezali diamantovým nožom, umiestnili sa na potiahnuté mriežky a kontrastovali sa s konvenčnými roztokmi octanu uranylu a Reynoldsovho citrátu olovnatého.

Nakoniec sme rezy pozorovali transmisným elektrónovým mikroskopom (Jeol 1400) vybaveným kamerou GatanUltrascan ES1000CCD. Vybrali sme tri rezy na stav, analyzovali sme tri MN na sekciu a zmerali sme plochy jadier v porovnaní s celkovou plochou MN pomocou nástrojov ImageJ.

2.12. Bioinformatika a štatistika

Použili sme analýzy rozptylu (ANOVA) na porovnanie hodnôt medzi rôznymi experimentálnymi skupinami pre údaje, ktoré spĺňali predpoklad normality. Rozdiely medzi skupinami sa analyzovali pomocou jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval Tukeyho post hoc viacrozsahový test, alebo pomocou Studentovho t-testu. Všetky štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou softvéru GraphPad Prism5 (n=3–5; p < 0,05 pre významnosť).

3. Výsledky

3.1. Text

3.1.1. Proteomická analýza nadmernej expresie GRP78 odhalila mitochondrie ako hlavný cieľ

Aby sme identifikovali molekulárne mechanizmy vedúce k neuroprotekcii sprostredkovanej nadmernou expresiou GRP78, vykonali sme porovnávaciu proteomickú analýzu bez označenia, aby sme identifikovali kvantitatívne aj kvalitatívne rozdiely medzi zvieratami s poranením RA infikovanými adenovírusmi na nadmernú expresiu GRP78 (Ad-GRP78), o ktorých sa predtým zistilo, že sú neuroprotektívne. MN alebo beta-galaktozidáza (Ad-ß-Gal) ako kontrola [20].

Sedem dní po úraze (dpi) bol zvolený časový bod pre analýzu podľa predchádzajúcich štúdií vykonaných v našom laboratóriu [20,25]. V predchádzajúcom porovnaní medzi modelom regenerácie po distálnej axotómii a sutúre sedacieho nervu oproti nášmu modelu degeneratívnej RA sme pozorovali, že signalizačné udalosti boli podobné až do 7 dpi, keď sa po RA objavili divergentné prodegeneratívne udalosti [20,25].

LC-MS/MS analýza postnukleárnych frakcií zo segmentov miechy L4-L5 bez značenia LC-MS/MS viedla k identifikácii 1420 proteínov s najmenej dvoma peptidmi na proteín, ako už bolo uvedené pre iné vzorky a štúdie [25]. .

Celkovo 566 a 732 proteínov alebo peptidov bolo významne zmenených v dôsledku nadmernej expresie Ad-GRP78 alebo Ad-ß-Gal u zvierat s poranením RA v porovnaní so zvieratami s poranením RA neinfikovaných vírusom (p < 0 .05) (Tabuľky S1 a S2).

Porovnali sme oba zoznamy a zistili sme, že 220 bolo jedinečne zmenených v dôsledku nadmernej expresie Ad-GRP78 (tabuľka S3). Funkčná anotácia týchto proteínov pomocou nástroja Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) nám umožnila identifikovať najvýznamnejšie biologické funkcie v súbore údajov (FDR < 0,05) [34,35].

Nadmerná expresia GRP78 viedla k rozdielom v hladinách proteínov zapojených do mitochondriálnych procesov, funkcií a komponentov (tabuľka S4A–C, obrázok S1A–C). Pojmy génovej ontológie (GO) a analýza obohatenia dráhy KEGG týchto údajov odhalili, že u zvierat infikovaných Ad-GRP78 došlo k významnému zníženiu hladín mnohých proteínov s mitochondriálnymi funkciami, vrátane proteínov z vonkajšej a vnútornej mitochondriálnej plochy, proteínov respiračného komplexu, a matricové proteíny.

Potvrdili sme rozdiely v hladinách proteínov odhalených v proteomickom zozname, ako je GRP75, ktorý bol upregulovaný (p < 0,05) a podjednotka komplexu V (CV ), znížená (p=0,03) v skupinách GRP78 podľa očakávania (obrázok 1A).

V rámci celého zoznamu najviac zníženou reguláciou boli 2-oxoglutarát/malátový nosičový proteín OGC (SCL25A11), MT-ND3 (supresor nádorov, ktorý sa zúčastňuje kyvadlovej dopravy themalát-aspartát a regeneruje zásobu NADH v mitochondriálnej matrici, ktorá umožňuje komplex I), podjednotka 3 NADH dehydrogenázy komplexu I, aminotransferáza kyseliny gamaaminomaslovej ABAT a podjednotka reduktázy ubichinol-cytochróm C komplexu III. Na rozdiel od toho bolo veľmi málo proteínov upregulovaných (obrázok 1B).

Jeden upregulovaný proteín bol GRP78, ako sa očakávalo, a ďalšie upregulované proteíny boli transportér aminokyselín EAAT2, ktorý sa primárne nachádza v plazmatickej membráne a niekedy v mitochondriách na excitačných synapsiách, a hydroxyacyl-CoA dehydrogenáza HADHA, ktorá katalyzuje posledné tri kroky mitochondriálnej beta - oxidácia mastných kyselín s dlhým reťazcom.

Rozšírili sme analýzu, aby sme zistili, či iné proteíny v proteínoch súvisiacich s funkciou mitochondrií alebo mitochondrií boli modifikované z proteomického zoznamu, aby sme potvrdili funkčné ovplyvnenie mitochondrií (obrázok 1C).

Pozorovali sme, že mitochondriálna konzervovaná dynamická optická atrofia 1 GTPázy (OPA1), ktorá sa podieľa na fúzii [36], bola znížená (p < 0.1); LONP1, ATP-dependentná proteáza, ktorá sprostredkováva selektívnu degradáciu chybne zložených polypeptidov, mala tendenciu sa zvyšovať, ale neboli pozorované žiadne rozdiely v hladinách ubichinónu NDUFA9, transkripčného faktora NRF2, ktorý reguluje gény, ktoré obsahujú prvky antioxidačnej odozvy alebo iný dynamín. GTPáza súvisiaca s infúziou, ako je mitofusín 2 (MFN2) [36].

Komplexné zhrnutie zmien nájdených v mitochondriách je znázornené v schéme na obrázku 1D. Mitochondriálna dynamika je dôležitá pre stresové reakcie, pretože poškodené mitochondrie sa spájajú s výmenou materiálu a mitochondriálne štiepenie umožňuje segregáciu poškodených mitochondrií a následnú mitofágiu [37].

Vzhľadom na to, že hlavný počet downregulovaných proteínov sa lokalizuje v mitochondriách a neboli pozorované žiadne evidentné zmeny týkajúce sa mitochondriálnej fúznej aktivity analýzou MFN2 a pomeru foriem L/S OPA1 (obrázok 1C), skúmali sme markery súvisiace s mitofágiou.

Klasicky po depolarizácii nastáva degradácia mitochondrií závislá od autofágie a zvyčajne sa spúšťa zvýšenou akumuláciou domnelej kinázy 1 (PINK1) indukovanej fosfatázou a tensinhomológom (PTEN) v plnej dĺžke na vonkajšej mitochondriálnej membráne.

Následne sa medzikruhová E3 ubikvitín-proteínová ligáza Parkin získa na označenie mitochondriálneho vonkajšieho membránového proteínu depolarizovaných mitochondrií ubikvityláciou [38–41]. Horná časť obrázku 2A neukazuje žiadne zmeny v hladinách Parkina, ale významné zníženie plnej dĺžky PINK1 spôsobeného poranením RA v ipsilaterálnom segmente L4-L5 miechy vzhľadom na kontrolu pri 7 dpi. Na rozdiel od toho nadmerná expresia GRP78 znížila Parkin, ale zdvojnásobila hladiny PINK1 po RA v porovnaní s kontrolnou expresiou nesúvisiaceho proteínu -Gal (obrázok 2A, dole).

Upregulácia PINK1 plnej dĺžky je konzistentná s indukciou mitofágie [42] a Parkinova redukcia môže súvisieť s pokročilým stavom rozkladu organel, ako to pozorujú ostatné mitochondriálne proteíny.

Ďalej skúmame ko-lokalizáciu mitochondrií a proteínov asociovaných s mikrotubulami 1A/1B s ľahkým reťazcom 3 (LC3)-pozitívnych bodiek, kľúčovej zložky jadrového makroautofágneho aparátu a nevyhnutnej pre mitofágový proces [43].

Pomocou konfokálnej mikroskopie sme pozorovali významné zvýšenie spoločnej lokalizácie mitochondrií, označených pomocou anti-COX IV, s LC3- pozitívnym bodom po RA iba v poškodených MN nadmerne exprimujúcich GRP78 pri 7 dpi (obrázok 2B).

Existenciu mitofágie v avulzovaných MN sme potvrdili iba pri nadmernej expresii GRP78 analýzou vzoriek pomocou transmisnej elektronickej mikroskopie.

Pozorovali sme hojné vakuoly s pohltenými mitochondriami, charakteristickým znakom mitofágie [37], pripomínajúce mitofagozómy, a niekoľko ERcisternae v úzkom spojení s mitochondriami v MN od zvierat Ad-GRP78, ale nezistili sme ich u Ad{3}}Gal RA-poškodených vzorky potkanov pri 5 dpi (obrázok 2C).

Obrázok 1. Nadmerná expresia GRP78 u zvierat s poranením RA sa zameriava na mitochondriálne proteíny. (A) Imunoblot a stĺpcové grafy znázorňujúce priemerné násobné zmeny (± SEM) hladín proteínov GRP78, GRP75 a CV v segmentoch miechy L4-L5 v GRP78 vs.

-Gal nadmerne exprimujúce RA-zranené potkany o 7 dpi. Hladiny boli normalizované na hodnoty aktínu (n=4; * p < 0,05 vs. Ad- -Gal, Studentov t-test). (B) Histogram zmien zloženia mitochondriálneho proteínu získaný proteomickou analýzou segmentov miechy L4-L5 u zvierat s poranením RA, ktoré nadmerne exprimujú GRP78 v porovnaní so skupinou Ad{12}}Gal o 7 dpi. (C) Imunoblot a stĺpcové grafy zobrazujúce priemerné násobné zmeny (± SEM) NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1 normalizované na aktín. (Žiadne významné rozdiely medzi skupinami. Studentov t-test). (D) Schematické mitochondrie s proteínmi zmenenými nadmernou expresiou GRP78 v segmentoch miechy L4-L5 zo zvierat s poranením RA zvýraznené žltou (znížené) alebo modrou (zvýšené) pri 7 dpi.

Obrázok 2. Mitofágia je modulovaná in vivo po RA u potkanov, ktoré nadmerne exprimujú GRP78. (A) Imunobloty a zodpovedajúce stĺpcové grafy pre analýzu PINK1 a PARK násobnej zmeny hladín proteínov (priemer ± SEM) normalizovaných na hladiny aktínu v segmentoch L4-L5 miechy RA-poškodených vs.

ovládacieho prvku (hore) alebo zo skupín Ad{{0}}Gal a Ad-GRP78 (dole) o 7 dpi. (n=4; * p < 0,05, Študentov t-test). (B) Vľavo, mikrofotografie reprezentatívnych MN na ipsilaterálnom mieste od zvierat s poranením RA, ktoré dostali intratekálnu injekciu skupín AAVrh10-GFP alebo AAVrh10-GRP78 pri 7 dpi. Vzorky boli zafarbené na COX IV (červená) a LC3 (zelená) a kontrastne zafarbené fluorescenčným Nissl (modrá).

Mierka=10 µm a 10-násobné digitálne priblíženie.

Upozorňujeme, že spoločná lokalizácia sa pozoruje iba v skupine AAVrh10-GRP78. Vpravo, stĺpcový graf znázorňujúci analýzu % ko-lokalizačných bodov COX IV a LC3. Priemer ± SEM spoločnej lokalizácie COX IV a LC3 (n=4; ** p < 0,01,Studentov t-test). (C) Reprezentatívne snímky transmisnej elektrónovej mikroskopie, kde sú mitochondrie rozlíšené v MN miechy: a, obraz MN cytoplazmy zobrazujúci mitochondrie nekontrolované zviera; b, obrázok MN cytoplazmy z potkana s poranením RA zo skupiny Ad- -gal; c, obraz MN cytoplazmy z RA-zraneného potkana zo skupiny Ad-GRP78 s niektorými pohltenými mitochondriami označenými červenými hviezdičkami; d, obrázok s väčším zväčšením je znázornený na (C), ktorý poukazuje na veľký mitochondriálny a ER kontakt. Na obrázkoch sú vyznačené mierky.

Celkovo tieto výsledky naznačujú, že nadmerná expresia GRP78 môže indukovať MN odpojené od mitofagyínu po RA a mohla by podporovať neuroprotekciu.

3.1.2. Nadmerná expresia GRP78 obnovuje poškodenú mitochondriálnu funkciu

Potom sme ďalej skúmali účinok nadmernej expresie GRP78 na mitochondrie pomocou in vitro modelu stresu ER, pretože tento urážka sa objavuje skoro po RA poranení in vivo, ako bolo uvedené vyššie [20,26], a je to spoľahlivá metóda na skríning nových neuroprotektívnych činidiel [2,44 ].

Tento model využíva tunicamycín (Tun), ktorý je induktorom ER-stresu, ktorý spôsobuje tvorbu N-acetylglukózamín-lipidových medziproduktov, čím zabraňuje glykozylácii novo syntetizovaných proteínov a vedie k nesprávnemu poskladaniu proteínov. Použili sme to, pretože sa tiež uvádza, že zastavená sekrečná dráha je kľúčová v neurodegeneratívnom procese po RA [26].

Najprv sme overili, že nukleofekcia buniek podobných motoneurónu NSC34 s vhodným vektorom viedla k produkcii GRP78 (obrázok 3A). V týchto bunkách expresia GRP78 významne zvýšila prežitie v médiu obsahujúcom Tun (obrázok 3B).

Hoci liečba Tun normálne indukuje samotný GRP78, táto endogénna nadmerná expresia je pomerne neskoro (o 24 hodín) (obrázok S2). Tiež nás zaujímalo, či by sme mohli určiť, či nadmerná expresia GRP78 má neuroprotektívne účinky v inom in vitro modeli, o ktorom sme predtým uviedli, že reprodukuje niekoľko charakteristík smrti MN po poranení RA [26].

Tento model je založený na poškodení cytoskeletu indukovanom nokodazolom, ktorý interferuje s polymerizáciou mikrotubulov. Expresia GRP78 zvýšila životaschopnosť buniek kultivovaných aj v prítomnosti nokodazolu (obrázok 3B).

Potom sme hodnotili mitochondriálnu funkciu meraním tvorby druhov reaktívneho kyslíka (ROS) v mitochondriách pomocou MitoSOX, potenciálu mitochondriálnej membrány (∆ψm) pomocou metylesteru tetrametylrodamínu (TMRM) a spotreby O2 v našich bunkách NSC34 vystavených stresu ER. s nadmernou expresiou GRP78 alebo bez nej.

Ako pozitívnu kontrolu sme použili efavirenz (EFV), mitotoxickú látku, ktorá mení všetky tri parametre [45]. Zistili sme, že hladiny MitoSOX sa po pridaní Tun progresívne zvyšovali a dosiahli štatistickú významnosť o 24 hodín a že tvorba ROS sa významne zvýšila v bunkách ošetrených EFV od prvej hodiny po ošetrení, pokiaľ ide o kontroly ošetrené vehikulom (obrázok S3A).

Nadmerná expresia GRP78 viedla k významne nižším hladinám mitochondrií ROSin v porovnaní s bunkami exprimujúcimi GFP 24 hodín po liečbe Tun alebo EFV (obrázok 3C). ∆ψm sa zrútil po 5 a 24 hodinách liečby Tun a po 24 hodinách liečby EFV (obrázok S3B). Obnovenie tohto parametra sa dosiahlo nadmernou expresiou GRP78 v bunkách ošetrených Tun alebo EFV (obrázok 3D).

Rýchlosť spotreby O2 sa znížila počas 80 min analýzy po pridaní Tuna v bunkách, ktoré exprimujú GFP (sklon −0.063,R2=0.98), ale spotreba O2 bola stabilné v bunkách nadmerne exprimujúcich GRP{7}} napriek prítomnosti Tun (sklon −0,221, R2=0 0,99) (obrázok 3E, vľavo).

Po 5 hodinách bolo dýchanie normálne v bunkách nadmerne exprimujúcich GRP{1}} a vážne narušené v bunkách exprimujúcich GFP (obrázok 3E, vpravo). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že GRP78 zoslabuje mitochondriálnu dysfunkciu spôsobenú ER stresom alebo mitotoxicitou.

For more information:1950477648nn@gmail.com