Vylepšená pamäť na rozpoznávanie objektov pomocou opakovanej transkraniálnej magnetickej stimulácie po kódovaní, časť 1

abstraktné

Pozadie: Je známe, že stimulácia mozgu ovplyvňuje kanonické dráhy a proteíny zapojené do pamäte. Existujú však protichodné výsledky o schopnosti stimulácie mozgu zlepšiť pamäť, čo môže byť spôsobené zmenami v načasovaní stimulácie.

Medzi stimuláciou mozgu a pamäťou je úzke prepojenie. Stimulácia mozgu môže podporiť aktivitu mozgových neurónov, a tým zlepšiť pamäť a kognitívne schopnosti.

Po prvé, stimulácia mozgu môže podporiť spojenie medzi neurónmi. Stimuláciou mozgu sa komunikácia a spojenie medzi neurónmi stane častejšou a efektívnejšou. Tieto spojenia budú stabilnejšie a reálnejšie, vďaka čomu bude mozog flexibilnejší, kreatívnejší a premyslenejší. Tieto výhody vám poskytnú výhodu v učení a živote.

Po druhé, stimulácia mozgu môže priniesť silnejšiu pamäť. Častá stimulácia mozgu môže zvýšiť vitalitu a zdravie mozgu, a tým zlepšiť pamäť. Medzi zdravím mozgu a pamäťou a kognitívnymi aktivitami existuje životne dôležitý vzťah. Stimulácia mozgu pomôže mozgu zotaviť sa, rásť a opraviť. Takto sa budeme ľahšie učiť vedomostiam či získavať zmysluplné informácie zo života a budeme si ich môcť lepšie uchovávať a vybavovať v mozgu.

Okrem toho môže stimulácia mozgu podporiť aj učenie a aplikáciu nových informácií. V živote sa neustále stretávame s rôznymi problémami, s ktorými si nevieme rady. Častým stimulovaním mozgu dokážeme rýchlejšie a presnejšie porozumieť týmto zložitým informáciám, postupne sa im prispôsobiť, nájsť spôsoby, ako ich spracovať a lepšie sa s nimi vysporiadať, vďaka čomu sme pri riešení vecí šikovnejší.

Skrátka, vďaka stimulácii mozgu môžeme byť flexibilnejší, kreatívnejší a premyslenejší. S väčšou dôverou budeme čeliť aj problémom a výzvam v živote. Stimulácia mozgu je dobrý spôsob, ako zlepšiť naše kognitívne schopnosti, posilniť učenie a zlepšiť pamäť. Držme sa svojho plánu na cvičenie mozgu, udržujme si pozitívny prístup, buďme pozitívni, usilujme sa o lepší osobný rozvoj a realizujme svoje ideály. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche dokáže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche dokáže regulovať aj rovnováhu neurotransmiterov, ako je zvýšenie hladín acetylcholínu a rastových faktorov, ktoré sú veľmi dôležité pre pamäť a učenie. Okrem toho môže Cistanche tiež zlepšiť prietok krvi a podporiť dodávku kyslíka, čo môže zabezpečiť, že mozog dostane dostatočnú výživu a energiu, čím sa zlepší mozgová vitalita a vytrvalosť.

Kliknutím na tlačidlo Know zlepšíte pracovnú pamäť

Hypotéza: Predpokladali sme, že opakovaná transkraniálna magnetická stimulácia (rTMS) podaná po upozorňovacej úlohe a v období pred vyvolaním by mohla pomôcť zlepšiť pamäť. Metódy: Implantovali sme samcom myši B6129SF2/J (n ¼ 32) kraniálny nástavec na zaistenie cievky rTMS že myšiam bolo možné poskytnúť dôslednú stimuláciu prednej oblasti pri voľnom pohybe.

Myši potom prešli fázou odberu vzoriek na test rozpoznávania objektov a dostali liečbu þ3, þ24, þ48 hodín po teste. Liečba pozostávala z 10 minút 10 Hz rTMS stimulácie (TMS, n ¼ 10), simulovanej liečby (SHAM, n ¼ 11) alebo kontrolnej skupiny, ktorá nerobila test správania alebo nedostala rTMS (CONTROL n ¼ 11).

Pri þ72 hmice boli testované na ich skúmanie nového vs známeho objektu. Výsledky: O 72- h mali iba myši, ktoré dostali rTMS, väčší prieskum nového objektu ako známy objekt.

Ďalej ukazujeme, že pre tento účinok je dôležitá podpora synaptického GluR2 a udržiavanie synaptických spojení v peririnálnom kortexe a hipokampálnom CA1.

Okrem toho sme našli dôkaz, že tieto zmeny súviseli s dráhami CAMKII a CREB v hipokampálnych neurónoch.

Záver: Spojením známych biologických účinkov rTMS s pamäťovými dráhami poskytujeme dôkaz, že rTMS je účinný pri zlepšovaní pamäte, keď sa podáva počas konsolidačných a udržiavacích fáz.

1. Úvod

Je známe, že neinvazívna stimulácia mozgu ovplyvňuje kanonické dráhy a proteíny zapojené do pamäte. Súčasné štúdie, ktoré skúmali účinky stimulácie mozgu, konkrétne repetitívnej transkraniálnej magnetickej stimulácie (rTMS), na pamäť však mali protichodné výsledky [1].

Dôvodom môže byť zacielenie stimulácie v rôznych časoch počas formovania a získavania pamäte [1]. Dôkazy naznačujú, že zacielenie rTMS vo fázach po kódovaní alebo konsolidácii by sa mohlo ukázať ako prospešné pre vývoj stabilných dlhodobých pamätí [2]e4].

Konsolidácia je fáza, ktorá mení krátkodobú pamäť na dlhodobú pamäť (LTM). Proces je závislý od časovo špecifickej syntézy proteínov, ktorá transformuje nové informácie na stabilné synaptické modifikácie so zvýšenou hustotou postsynaptických receptorov [5,6].

Dôležitosť tejto časovo a regionálne špecifickej syntézy proteínov bola preukázaná v štúdiách, ktoré blokujú syntézu denovo proteínov. Napríklad jedna štúdia, ktorá blokovala syntézu bielkovín v hipokampe 3-h, ale nie 6-h po udalosti upozornenia, zhoršila LTM, ale nie krátkodobú pamäť u potkanov[7].

Z týchto proteínov bolo identifikovaných niekoľko dôležitých signálnych dráh, ktoré sú v tomto procese upregulované a dôležité.

Na synapsii existuje viacero signálnych dráh, ktoré signalizujú inerváciu receptora a stabilitu chrbtice potrebnú pre LTM. Tie sa aktivujú prostredníctvom dlhodobého potenciačného (LTP) stimulu a často sú zosilnené neurotrofickými faktormi, ako je neurotrofický faktor odvodený od mozgu (BDNF) [8].

BDNF má mimoriadny význam pri vytváraní dlhodobých spomienok, pretože blokovanie syntézy BDNF v špecifických časových bodoch blokuje jeho konsolidáciu [5].

BDNF sa viaže na receptory tyrozínkinázy (TrkB) a môže iniciovať viaceré signálne dráhy, ako sú mitogénom aktivovaná proteínkináza/kináza regulovaná extracelulárnym signálom (ERK) alebo fosfolipázové Cg dráhy. Tieto signálne dráhy sa zbiehajú pri aktivácii transkripčného regulačného faktora cyklického AMP-responzívneho proteínu viažuceho element (CREB).

Vápnikom aktivované proteíny, ako je vápnik/kalmodulín-dependentná proteínkináza II (CAMKII), tiež hrajú úlohu v regulácii génov aktivovaných CREB[9e11] a môžu tiež priamo sprostredkovať synaptickú expresiu glutamátergických AMPA receptorov a stabilizovať synaptické lešenie [12e15] .

Tieto signálne dráhy spolu vedú k expresii a translokácii posunového receptora, ktorá sprostredkuje zvýšenú aktiváciu na synapsii, čím slúži na stabilizáciu synapsií a prispieva k udržaniu predĺženého LTP [16]. Dôležité je, že predchádzajúce štúdie ukázali, že je možné zlepšiť konsolidáciu pamäte. prostredníctvom periodickej reaktivácie týchto konsolidačných dráh v experimentálnych podmienkach [17].

Predchádzajúce štúdie ukázali schopnosť rTMS priamo ovplyvňovať tieto špecifické dráhy v mozgu. In vivo štúdie ukázali, že rTMS zvyšuje hladiny BDNF v mozgu [18e20]. Presnejšie povedané, in vitro rTMS vedie k zvýšeniu Ca2þ v neurónoch, prevládajúcej signálnej molekule v dráhe CAMKII [18]. Zvýšená fosforylácia CAMKII a CREB bola tiež preukázaná in vitro po rTMS [20,21].

rTMS tiež priamo ovplyvňuje expresiu synaptikreceptorov, zvyšuje hustotu AMPA receptorov [22e24] a reguluje AMPA receptorové podjednotky Glutamátový receptor 1 (GluR1) a Glutamátový receptor 2 (GluR2) [25,26].

Preto asrTMS aktivuje tieto dráhy, čo by bolo najefektívnejšie pri zlepšovaní pamäte počas konsolidačnej fázy. Táto štúdia skúmala použitie rTMS na zlepšenie pamäte zameraním sa na stimuláciu konsolidačných a udržiavacích fáz pamäte.

Predpokladali sme, že rTMS podávaný po učiacej sa úlohe a v období pred získaním by mohol zlepšiť výkon pamäte. To by bolo výsledkom periodickej reaktivácie dráh, ktoré sú zapojené do pamäte, ktoré sú tiež ovplyvnené rTMS.

Pomocou zvieracieho modelu špecifického epizodického LTM sme ukázali, že rTMS zlepšuje pamäť objektu, keď sa podáva v priebehu 72- h medzi kódovaním a získavaním, zatiaľ čo myši, ktorým bola podaná liečba SHAM, si pamäť neudržali.

Tento účinok podporili zmeny na synaptické spojenia v peririnálnej kôre a CA1, zvýšená aktivácia CREB a CAMKII a dynamický posun v podjednotkách AMPA receptora na synapsii.

2. Materiál a metódy

2.1. Zvieratá

Na túto štúdiu sme použili n ¼ 33 samcov myší B6129SF2/J vo veku 2 až 4 mesiace. Všetky myši žili pod cyklom 12-h svetlo/12-h tmy s voľným prístupom k suchému krmivu a vode. Všetka starostlivosť o zvieratá a postupy boli v súlade so zákonom o dobrých životných podmienkach zvierat a boli podľa inštitucionálnych smerníc a schválené výborom VA Palo Alto pre výskum zvierat.

2.2. Operácia podpory cievky

Každá z myší podstúpila operáciu na pripevnenie podpery cievky, ktorá umožnila konzistentnú rTMS stimuláciu bdelých zvierat. Podrobnosti o chirurgickom zákroku možno nájsť v Poh et al., 2018[27].

Stručne povedané, zvieratá boli anestetizované 3% izofluránom a udržiavané na 2,3% pomocou kužeľa nosa. Po oholení a vyčistení miesta na sterilitu sa skalpelom urobil sagitálny rez s dĺžkou približne 10 mm.

Periosteum sa jemne zoškrabalo a na bregma s kyanoakrylátom sa pripevnila vopred vyrobená podpera cievky a vystužila sa dentálnym cementom. Rana bola potom prišitá okolo podpory cievky.

2.3. Postupy správania a stimulácie

Prehľad správania a stimulačných postupov nájdete na obr. 1a. Po piatich dňoch zotavenia z chirurgického zákroku na podporu cievky boli myši privykané na samostatnú stimulačnú klietku a procedúry cievky počas troch dní.

V posledný deň privykania si myši podstúpili test otvoreného poľa (OFT) na 10- min, ktorý slúžil aj ako návyk na test rozpoznávania objektov (ORT). Nasledujúci deň boli myši vystavené ORT vzorkovacej fáze s dvoma rovnakými objektmi počas 10 minút. Predmety mali podobnú veľkosť, ale rôzne farby a tvary. Tieto objekty boli umiestnené v protiľahlých rohoch štvorcovej testovacej arény.

O tri hodiny neskôr boli tematické skupiny náhodne rozdelené do dvoch liečebných skupín, TMS, ktoré dostali aktívnu stimuláciu 10- min 10 Hz rTMS, a SHAM, ktoré boli ošetrené rovnako, s výnimkou toho, že cievka bola počas stimulácie vypnutá.

Myši TMS aj SHAM boli liečené znova24- a 48-h po oboznámení sa. Posledný deň (72-h po zoznámení) boli myši vystavené testovacej fáze ORT na 10-min s jedným známym objektom a jedným novým objektom.

Aby sme určili, či prieskum nového objektu bol väčší ako známy objekt, vypočítali sme rozlišovací index (((prieskum nového objektu)-(prieskum známeho objektu))/((prieskum nového objektu)þ(preskúmanie známeho objektu))). Vybrali sme 72-h, pretože predchádzajúce štúdie [28] aj pilotné údaje (neuvedené) ukázali, že za normálnych podmienok si myši v tomto časovom bode neuchovávajú pamäť ORT.

Typy objektov aj umiestnenie nového objektu boli medzi skupinami vyvážené. Na habituáciu, odber vzoriek a reláciu sondy sa myšiam vždy pred pokusmi poskytlo 30 minút na aklimatizáciu v experimentálnej miestnosti a objekty a aréna sa po každej myši vyčistili 70 % etanolom.

Aby sme preskúmali účinky výlučne behaviorálnej úlohy, zahrnuli sme aj skupinu, s ktorou sa zaobchádzalo rovnako ako s myšami SHAM okrem toho, že nerobili ORT.

Namiesto toho boli vystavení odberu vzoriek a relácii sondy, ale bez predmetov. Jedna myš v skupine TMS nedosiahla požadovaný prah celkového 20- skúmania oboch objektov v relácii odberu vzoriek, a preto bola zo štúdie vylúčená. Táto myš bola vylúčená z následnej biochemickej analýzy.

Všetky ostatné myši dosiahli kritériá v relácii odberu vzoriek aj sondy. S výnimkou jednej myši boli konečné čísla v experimentálnych skupinách TMS n ¼ 10, SHAM n ¼ 11 a CONTROLn ¼ 11.

2.4. Western blot

Tri hodiny po relácii sondy boli myši usmrtené predávkovaním ketamínom a tkanivá hipokampu a frontalcortexu boli rýchlo rozrezané na suchý ľad a uložené pri 80 °C.

Tieto vzorky sa homogenizovali s 300 ml ľadovo vychladeného Synaptického proteínového extrakčného činidla (Thermo Scientific) s 1 x kokteilovým inhibítorom proteázy (Roche) a 1 x koktailovými tabletami inhibítora fosfatázy (Roche) (na 10 ml), počas 5 sekúnd.

Homogenáty sa centrifugovali pri 1200 g počas 10 minút, aby sa odstránili bunkové zvyšky. Odobral sa supernatant a časť supernatantu sa rozdelila na alikvóty na analýzu úplného homogenátu. Zvyšok sa centrifugoval pri 15,000 g počas 20-min pri 4 °C.

Pelety obsahujúce synaptozómy sa jemne resuspendovali v Syn-Per pri 1,5 ml/g tkaniva, aby sa vytvoril synaptický homogenát. Na kvantifikáciu koncentrácie proteínu vo vzorke sa použila nanokvapka.

Úplný homogenát a synaptický homogenát sa skladovali pri 80 °C až do analýzy. Úplné aj synaptické homogenáty sa zriedili na 4 mg/ml ľadovo vychladeného PBS a zmiešali sa s 1:4 Protein Loading Buffer (LiCor) a 1:4000 merkaptoetanolom. Potom sa zahriali na 95 °C počas 5-min a vložili do gélov Mini PROTEAN TGX (Bio-Rad).

Po separácii pomocou elektroforézy pri 100 V sa proteíny preniesli na nitrocelulózovú blotovaciu membránu (GE Healthcare Lifesciences). Membrány boli premyté v roztoku SuperSignal WesternBlot Enhancer Antigen Pretreatment Solution (Thermo Scientific) a potom blokované blokovacím pufrom (Rockland) a 1 % kozím sérom počas 1-h.

Po blokovaní bola membrána inkubovaná s primárnymi protilátkami zriedenými v SuperSignal Western BlotEnhancer Primary Antibody Diluent (Thermo Scientific) cez noc pri teplote miestnosti.

Primárne použité protilátky boli myšacie monoklonálne ERK 1/2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology), králičie monoklonálne fosfo-p44/42 MAPK (pERK 1:1000, Cell SignalingTechnologies), myšie monoklonálne CREB (1:500, Cell SignalingTechnologies), králičie monoklonálne fosfo-CREB (S133) (pCREB1:500, Cell Signaling Technologies), králičí monoklonálny CAMKIIalfa (1:1000, Cell Signaling Technologies), myšací monoklonálny fosfo-CAMKII (Thr286) (pCAMKII 1:1000, Invitrogen), myš (1:1000, GluR1 750, Santa Cruz Biotechnology), králičí monoklonálny fosfo-GluA1 (S845) (pGluR1(845) 1:750, CellSignaling Technologies), králičí monoklonálny fosfo-GluA1 (S831)(pGluR1(831) 1:750, Cell Signal Technologies, Cell Signal Technologies monoklonálny GluR2 (1:750, Invitrogen), králičí polyklonálny fosfo-GluR2(S880) (pGluR2 1:500, Invitrogen), myší monoklonálny TrkB (1:500, BD Transduction Laboratories) alebo králičí polyklonálny fosfo-TrkB( Tyr816) (pTrkB 1:500, EMD Millipore).

Na štandardnú kontrolu zaťaženia sa použil králičí polyklonálny Cofilin (1:2000, Sigma). Po opláchnutí v TBS-Tween sa membrána inkubovala 1 hodinu pri izbovej teplote v kozej anti-králičej 800 a kozej anti-myšej 680 (1:3000, LiCor).

Imunoblot sa zobrazil pomocou infračerveného zobrazovacieho systému Odyssey Clx (LiCor) a analýza údajov o intenzite pásu sa uskutočnila pomocou Image Studio (LiCor).

2.5. Imunohistochémia

Tri hodiny po relácii sondy boli myši usmrtené predávkovaním ketamínom transkardiálne perfundované 50 ml studeného 1 M PBS.
Mozgy boli okamžite postfixované v 4% roztoku paraformaldehydu pri 4 °C a prenesené do 30% sacharózy v PBS na aspoň 48-h pred kryosekciou na 30 mm rezy. Voľne plávajúce rezy boli blokované a permeabilizované 10 % kozím sérom v 0,1 % Tritone v 1 M PBS a potom inkubované 48-h s králičím polyklonálnym PSD95 (1:300, Thermo Scientific) a myším monoklonálnym SV2A (1:300, Biotechnológia Santa Cruz).

Rezy sa potom inkubovali 1-h so sekundárnymi protilátkami Alexa Fluor kozí anti-králičí 568 (1:500, Invitrogen) a Alexa Fluorgoat anti-myš 488 (1:500, Invitrogen. Plátky sa potom premyli jadrovým farbivom DAPI (1:1000, Sigma), namontované na sklíčka a pokryté Fluoromount (Thermo Scientific).

Farbenie sa kvantifikovalo vo frontálnom kortexe (FC), dorzálnom CA1 hipokampe, entorinálnom kortexe (EC) a peririnálnom kortexe (PC).

Naskladané obrázky boli nasnímané pomocou fluorescenčného mikroskopu BZ-X700 (Keyence) pri 40-násobnom zväčšení, aby sa identifikovali synaptické body v celom reze. Celkové PDS95 puncta, SV2A puncta a kolokalizované (definované ako dve bodky vedľa seba alebo prekrývajúce sa) boli spočítané z najmenej štyroch obrázkov pre každú oblasť a priemer výsledkov získaných pre každú myš. Kvantifikácia % kolokalizovaných sa dokončila počítaním (prekrývajúce sa SV2A a PSD95)/(celkové SV2A a PSD95) bodiek.

2.6. Štatistiky

Všetky údaje spĺňali predpoklady normality, ako bolo hodnotené skúmaním zošikmenia, špičatosti a hodnoty Shapiro Wilk vypočítaných zvyškov a nezistili sa žiadne porušenia homogenity rozptylu, ako bolo hodnotené pomocou štatistiky Levene.

Pre testy správania sa použili študentské t-testy na porovnanie SHAM a TMS, na skúmanie nových a známych objektov v rámci skupín sa použila dvojcestná ANOVA s opakovanými meraniami.

Imunohistochémia a údaje Western blot boli testované na významnosť pomocou One-WayANOVA. Pre všetky post-hoc párové porovnania sa použila Tukeyova úprava s významnosťou p < 0,05.

Ak bola porušená homogenita odchýlky, významnosť bola stanovená pomocou WelchTest a následne post-hoc korigovaná pomocou Games-Howell, tieto prípady sú zaznamenané vo výsledkoch. Všetky štatistiky boli vykonané pomocou SPSS (verzia 22, IBM) a grafy boli vytvorené pomocou GraphPad (verzia 7, Prism).

For more information:1950477648nn@gmail.com