Extrakt z Herba Cistanche zlepšuje stav mitochondriálneho glutatiónu a dýchanie v srdciach potkanov s možnou indukciou odpájania proteínov

Úvod

Reperfúzia predtým ischemického myokardu spôsobuje sériu mitochondriálnych zmien vrátane zvýšenej produkcie reaktívnych foriem kyslíka (ROS), Ca2+preťaženie a pokles produkcie adenozíntrifosfátu (ATP), čo všetko môže viesť k nekróze a/alebo apoptózou sprostredkovanej bunkovej smrti (Redegeld a kol., 1992; Lemasters a kol., 1998). Ako mitochondrie hrajú kľúčovú úlohu pri určovaníPri osude kardiomyocytov po ischémii/reperfúzii (I/R) by sa preto ochrana pred I/R poškodením myokardu mala zamerať na zachovanie mitochondriálnej štrukturálnej a funkčnej integrity. Udržiavanie mitochondriálneho energetického metabolizmu po I/R výzve je obzvlášť dôležité, pretože kontraktilná funkcia srdca je takmer úplne závislá od ATP generovaného mitochondriami. Kardiomyocyty, ktoré sú živé, ale nezmršťujú sa, sú veľmi málo užitočné.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZVÝŠENIE IMUNITY PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, celá sušená rastlinaCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae), je parazitická rastlina rastúca najmä v púštnych oblastiach severnej a severovýchodnej Číny. Herba Cistanche, v čínskej medicíne klasifikovaná ako bylina „povzbudzujúca jang“, sa predpisuje pri nedostatku obličiek, ženskej sterilite a zápche spôsobenej suchosťou čriev u senilných pacientov (Chen, 1998). Predchádzajúce štúdie v našom laboratóriu ukázali, že metanolextrakt z Herba Cistanchezvyšuje kapacitu tvorby ATP myokardu (Leung & Ko, 2008) a chráni pred I/R poranením myokardu u potkanov (Leung, 2006). Zatiaľ čo stimulácia kapacity generovania ATP bola paralelná so zvýšením mitochondriálneho transportu elektrónov (Leung & Ko, 2008), kardioprotekcia proti poškodeniu I/R poskytovaná liečbou Herba Cistanche bola spojená so znížením deplécie myokardu ATP (Leung, 2006). V tejto štúdii, aby sme definovali úlohu mitochondrií v kardioprotektívnom pôsobení Herba Cistanche, sme skúmali účinok liečby Herba Cistanche na stav mitochondriálneho glutatiónu, obsah Ca2+, membránový potenciál a rýchlosť dýchania v srdciach potkanov. .

Materiály a metódy

Rastlinný materiál

Herba Cistanche bola zakúpená od miestneho (v Hongkongu) predajcu byliniek (Lee Hoong Kee). Bylina bola overená dodávateľom a exemplár poukážky (HKUST00301) bol uložený na Katedre biochémie Hong Kongskej univerzity vedy a techniky (HKUST). Metanolová extrakcia byliny sa uskutočnila na základe predchádzajúcich štúdií, ktoré naznačujú, že takýto extrakt zvýšil mitochondriálnu tvorbu ATP a chránil pred I/R poranením v srdciach potkanov (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Stručne povedané, Herba Cistanche (400 g) sa narezal na malé kúsky a extrahoval zahrievaním pod spätným chladičom v 300 ml metanolu pri 60 stupňoch počas 2 hodín, ako už bolo opísané (Leung & Ko, 2008). Postup sa opakoval dvakrát. Spojený extrakt sa vysušil odparením rozpúšťadla za zníženého tlaku; výťažok bol 42 % (hmotn./hmotn.) vzhľadom na množstvo surovej byliny. Extrakt sa skladoval pri 4 stupňoch až do použitia. Aj keď sa čínske bylinky tradične extrahujú vodou na orálnu konzumáciu, v našej skoršej štúdii sa použil metanol na uľahčenie spracovania a skladovania vzoriek (Yim & Ko, 2002) a zistili sme, že extrakcia metanolom je vo všetkých ohľadoch uspokojivá.

Starostlivosť o zvieratá a liečba drogami

Dospelé samice potkanov Sprague-Dawley (vo veku 8 až 10 týždňov; 200 až 230 g) boli umiestnené v miestnosti s kontrolovanou vlhkosťou s 12-hodinovým cyklom tma/svetlo, pri teplote približne 22 stupňov a potrava a voda im bola povolená ad libitum. Zvieratá boli náhodne rozdelené do rôznych skupín, pričom v každej skupine bolo päť zvierat. Potkany dostaliExtrakt z Herba Cistancheintragastricky ({{0}},2 g/ml vo vode) pri 0,5g/kg alebo 1,0 g/kg počas 3 po sebe nasledujúcich dní. Kontrolné (neliečené) zvieratá dostávali iba vodu. Dvadsaťštyri hodín po poslednej dávke bolo od anestetizovaných zvierat odobraté srdcové ventrikulárne tkanivo na biochemickú analýzu. Všetky experimentálne protokoly boli schválené Výborom pre výskumnú prax, HKUST.

Príprava mitochondriálnych frakcií

Rozdrvené srdcové ventrikulárne tkanivá (~{0}},6 g) sa homogenizovali v 10--násobnom (w/v) prebytku ľadovo studeného sacharózového tlmivého roztoku [0,32 M sacharóza, 1 mM kyselina etyléndiamíntetraoctová (EDTA), 50 mM Tris/HCl; pH 7,4] s použitím homogenizátora z teflónového skla, pri 4000 ot./min., s 25–30 zdvihmi. Mitochondriálne pelety sa pripravili z tkanivových homogenátov centrifugáciou pri 800 x g pri 4 stupňoch počas 30 minút a čistota sa stanovila meraním relatívnych špecifických aktivít sukcinátdehydrogenázy a laktátdehydrogenázy v supernatante a pelete, ako už bolo opísané (Evans, 1992). Mitochondriálne pelety sa suspendovali v 1 ml homogenizačného pufra.

Meranie hladín mitochondriálne redukovaného glutatiónu a oxidovaného glutatiónu

Hladiny mitochondriálne redukovaného glutatiónu (GSH) boli stanovené enzymaticky pomocou 5,59-ditiobis(2- nitrobenzoovej kyseliny) (DTNB) a glutatiónreduktázy (GR), v protokole upravenom podľa Griffitha (198{17} }). Alikvotná časť (210 µl) mitochondriálnej frakcie bola zmiešaná s 90 µL 10% (v/v) 5-kyseliny sulfosalicylovej (SSA) a zmes sa centrifugovala pri 600 x g počas 10 minút. Na meranie hladín oxidovaného glutatiónu (GSSG) sa 100 ul množstvá supernatantov SSA zmiešali s 10 ul 20 % (w/v) 2-vinylpyridínu a 10 ul 60 % (v/v) trietanolamínu v mikrocentrifugačných skúmavkách. Každá skúmavka sa nechala stáť pri teplote miestnosti aspoň 1 hodinu. Reakčná zmes obsahujúca 0,63 mM DTNB a 0,053 mM NADPH (redukovaný nikotínamid adenín dinukleotid fosfát) vo fosfátovom pufri (0,1 M, s 5 mM Na2EDTA; pH 7,5) sa predinkubovala pri 30 stupňoch počas 2 minút. Alikvót (30 ul) buď supernatantu vzorky SSA (celkový glutatión) alebo vzorky GSSG sa pridal do jamky 96-jamkovej mikrotitračnej platne a 180 ul predhriatej reakčnej zmesi obsahujúcej 0,525 U/ Ďalej sa pridal ml GR. Zmeny absorbancie pri 412 nm boli monitorované spektrofotometricky počas 5 minút. Koncentrácie GSH a GSSG boli odhadnuté z kalibračných kriviek s použitím GSH a GSSG [rozpustených v 3 % (w/v) SSA] ako štandardov a vyjadrené ako nmol/mg proteínu. Hladiny GSH sa odhadli odpočítaním dvojnásobného množstva GSSG od celkového množstva GSH.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Meranie mitochondriálneho obsahu Ca2+

Mitochondriálny obsah Ca{{0}} sa meral pomocou fluorescenčnej sondy citlivej na Ca2+-, Fluo-5N AM ester (Molecular Probes, Eugene, OR) s použitím počítadla Victor2 Multi-Label Counter (Model 1420; PerkinElmer, Turku, Fínsko), ako je opísané v Menze et al. (2005). Disociačné konštanty Ca2+ (hodnoty Kd) boli stanovené pomocou kalibračnej súpravy Ca2+ platnej v koncentračnom rozsahu 1–1000 µM; odhadované hodnoty Kd boli 90–100 µM s vysokou spoľahlivosťou podľa údajov výrobcu súpravy. Alikvot (25 ul) mitochondriálnej frakcie (konečná koncentrácia 0,5 mg proteínu/ml) sa zmiešal s 25 ul inkubačného pufra {100 mM KCI a 30 mM MOPS [3-(N-morfolino)propánsulfónová kyselina]; pH 7,2} v 96-jamkovej čiernej mikrotitračnej doštičke. Zmes sa inkubovala pri 25 stupňoch počas 15 minút; Potom sa pridalo 25 ul digitonínu (50 ug/ml) a 25 ul Fluo-5N AM esteru (1 uM v 0,005 % (w/v) Pluronic F-127). Uľahčením membránovej permeácie sprostredkoval digitonín mitochondriálny vstup fluorescenčného farbiva. Zistili sme, že hladiny Fluo-5N v mitochondriálnych prípravkoch zo srdca potkanov boli 20-násobne zvýšené v prítomnosti digitonínu. Reakčné zmesi sa inkubovali pri 25 stupňoch počas 30 minút a hodnoty fluorescencie sa merali pri excitačnej vlnovej dĺžke 488 nm a emisnej vlnovej dĺžke 532 nm. Obsah mitochondriálneho Ca{40}} bol odhadnutý pomocou kalibračnej krivky a vyjadrený ako µmol/mg proteínu.

Meranie mitochondriálneho membránového potenciálu

Membránový potenciál (ΔΨm) bol hodnotený metódou modifikovanou z metódy Bonavita et al. (2003), s použitím fluorescenčného farbiva, lipofilnej katiónovej sondy 5596,69-tetrachlór-1,193,39-tetraetylbenzimidazolylkarbocyanínjodidu, bežne nazývaného JC-1. Alikvóty (50 ul) mitochondriálnych frakcií (upravené na 1 mg proteínu/ml) sa inkubovali pri 37 stupňoch s 50 ul roztoku substrátu (obsahujúceho 6 mM pyruvát a 6 mM malát), 25 ul vopred upraveného roztoku adenozíndifosfátu (ADP) (30 mM) a 25 ul 3 uM JC-1 v tme. Hodnoty ΔΨm sa získali meraním fluorescencie pri 535 nm (FL1) oproti 580 nm (FL2) s použitím Victor2 MultiLabel Counter. JC-1 tvorí agregáty v mitochondriách, čo vedie k vysokým hodnotám fluorescencie FL2 a naznačuje normálny mitochondriálny potenciál. Strata ΔΨm vedie k zníženiu fluorescencie FL2 (JC-1 agregáty v menšom rozsahu) a súčasnému zvýšeniu fluorescencie FL1 (z JC-1 monomérov). Údaje boli vyjadrené ako pomery hodnôt fluorescencie FL1/FL2. Na validáciu testu sa použil karbonylkyanid m-chlórfenylhydrazón (CCCP), ΔΨm-kolapsujúce činidlo.

Meranie mitochondriálneho dýchania

Mitochondriálna rýchlosť dýchania bola meraná pri 37 stupňoch pomocou prístroja Hansatech Oxygraph-Plus vybaveného kyslíkovou elektródou Clarkovho typu (Sarasota, FL, USA). Mitochondriálne frakcie (0,6 mg proteínu/ml) sa suspendovali v dýchacom pufri obsahujúcom 125 mM KCI, 2 0 mM MOPS, 10 mM Tris, 0,5 mM kyseliny etylénglykoltetraoctovej (EGTA) a 2 mM KH2P04; pH 7,2. Po inkubácii pri 37 stupňoch počas 2 minút každá vzorka dostala 50 ul substrátového roztoku (5 mM pyruvát a 5 mM malát). Rýchlosti dýchania sa merali v prítomnosti (stav 3) 1 mM ADP a po fosforylácii všetkého ADP na ATP (stav 4). Pomer frekvencií dýchania v stave 3:stav 4 je index kontroly dýchania, ktorý indikuje tesnosť spojenia medzi dýchaním a fosforyláciou (Javadov a kol., 2005; Kuwabara a kol., 1997). Pred pridaním roztoku substrátu sa merala rýchlosť dýchania v stave 1 až do začiatku dýchania v stave 2 a rýchlosť dýchania v stave 2 sa odhadovala pred pridaním ADP.

Štatistická analýza

Dáta boli analyzované jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA) pre viacnásobné skupinové porovnania. Hodnoty najmenej významného rozdielu (LSD) sa použili na identifikáciu významných rozdielov medzi týmito dvoma skupinami, keď hodnoty p boli < 0,05.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Výsledky

Ako je znázornené na obrázkoch 1 a 2, spracovanie s metanolomextrakt z Herba Cistanche({{0}},5 alebo 1,0 g/kg/deň × 3) významne zvýšil stav mitochondriálneho glutatiónu v srdciach potkanov, čo dokazujú na dávke závislé zvýšenia hladín GSH (11–30 %) a zníženia úrovne GSSG (31 %).

Liečba Herba Cistanche v závislosti od dávky znižovala hladiny mitochondriálneho Ca2+ v srdciach potkanov v porovnaní s kontrolami; supresia bola 41 % pri dávke 10 g/kg (obrázok 3).

Liečba Herba Cistanche zvýšila mitochondriálne ΔΨm, čo dokazuje pokles (14–16 %) pomeru FL1/FL2. CCCP (100 uM) spôsobil kolaps ΔΨm, ako je indikované zvýšením pomeru FL1/FL2 (obrázok 4).

Liečba Herba Cistanchezosilnené mitochondriálne dýchanie, čo dokazuje výrazne vyššia miera dýchania v stave 3 (84 %) u testovaných zvierat v porovnaní s kontrolami (tabuľka 1). Úrovne dýchania v 2. a 4. stave sa zvýšili o 47 a 80 %, ale stimulácia dýchania v 4. stave bola úplne potlačená 1 mM guanozín{9}}'-difosfátom, inhibítorom odpájacieho proteínu 2/3. Liečba Herba Cistanche neovplyvnila index kontroly dýchania, ako sa odhaduje pomerom frekvencie dýchania v stave 3/stave 4.

Diskusia

Mitochondrie izolované zo sŕdc potkanov liečených Herba Cistanche vykazovali zvýšený glutatiónový stav, čo naznačovali zvýšené hladiny GSH a znížené hladiny GSSG. Udržiavanie redoxného stavu mitochondriálneho glutatiónu je rozhodujúce pre kardioprotekciu proti I/R poraneniu (Chiu & Ko, 2003). Cytosolický obsah Ca2+ sa zvyšuje počas ischémie myokardu prostredníctvom vychytávania Ca2+ uniporterom vnútornej membrány (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990), čo vedie k mitochondriálnemu Ca{{6} } akumulácia. Naše výsledky naznačujú, že liečba extraktom Herba Cistanche zvýšila redoxný stav mitochondriálneho glutatiónu a znížila hladinu mitochondriálneho Ca2+, čo môže poskytnúť ochranu pred I/R poranením myokardu (Leung, 2006). Neschopnosť liečby Herba Cistanche pri vyššej dávke 1,0 g/kg ďalej znižovať hladiny GSSG a Ca2+ môže súvisieť s existenciou samoobmedzujúceho regulačného mechanizmu ovplyvňujúceho redoxný potenciál glutatiónu a stav vápnika v mitochondriách.

Mitochondrie generujú elektrochemický protónový gradient cez vnútornú membránu transportom elektrónov. Tento gradient využíva ATP syntáza na fosforyláciu ADP na ATP. Znížený potenciál mitochondriálnej membrány, ako pri hypoxii/reoxygenácii po poškodení kultivovaných kardiomyocytov (Chiu et al., 2008), vedie k zníženiu tvorby ATP. Liečba Herba Cistanche, ktorá môže zvýšiť potenciál mitochondriálnej membrány myokardu, pravdepodobne zvyšuje tvorbu ATP, najmä počas postischemickej reperfúzie. Existencia samoobmedzujúceho regulačného mechanizmu môže opäť vysvetliť, prečo účinky liečby Herba Cistanche na potenciál mitochondriálnej membrány nie sú závislé od dávky.

Liečba Herba Cistanche výrazne zvýšila rýchlosť dýchania v stave 3 v mitochondriách srdca potkanov, ako bolo hodnotené spotrebou kyslíka. Toto zistenie je v súlade s výsledkami získanými z in vitro a situ meraní kapacity mitochondriálnej tvorby ATP (Leung & Ko, 2008). Je zaujímavé, že hoci liečba Herba Cistanche znížila ustálenú hladinu myokardiálneho ATP (údaje nie sú uvedené), liečba zvýšila tvorbu mitochondriálneho ATP. Zapojenie neviazaného dýchania môže vysvetliť tieto rozdielne pozorovania. Neviazaná oxidatívna fosforylácia nastáva, keď sa protóny presúvajú cez vnútornú mitochondriálnu membránu späť do mitochondriálnej matrice, čím sa rozptýli membránový potenciál vytvorený reťazcom transportu elektrónov. To má za následok zníženie protónovej hybnej sily, ktorá poháňa tvorbu ATP (Garvey, 2003). V dôsledku toho je koncentrácia Ca2+ a produkcia ROS v mitochondriách dramaticky oslabená (Teshima et al., 2003). Tento návrh je v súlade s výsledkami tejto štúdie, ktorá preukázala pokles hladín mitochondriálneho Ca2+ v srdciach liečených Herba Cistanche. Čo sa týka neviazaného dýchania, syntéza uncoupling proteínov (UCPs) môže byť indukovaná liečbou Herba Cistanche. Je známe, že UCP odpájajú oxidačnú fosforyláciu a expresiu UCP1 v srdciach transgénnych myší chránia pred I/R-indukovaným poškodením myokardu (Hoerter et al., 2004). Uncoupling efekt UCP bol inhibovaný purínovými nukleotidovými difosfátmi a trifosfátmi (ako sú ADP, ATP, guanozíndifosfát (GDP) a GTP) (Echtay et al., 2002). V tejto štúdii sa mitochondriálne parametre, ako je membránový potenciál a rýchlosť dýchania, merali v prítomnosti ADP (ako substrátu); odpájací účinok UCP bol preto inhibovaný. Keď sa však merala rýchlosť dýchania mitochondriálneho stavu 4 v neprítomnosti ADP, táto rýchlosť bola vyššia v mitochondriách pripravených zo sŕdc ošetrených Herba Cistanche ako v srdciach neošetrených kontrol. Rýchlosť dýchania 4. stavu odráža spotrebu kyslíka mitochondriami, keď protóny unikajú späť do mitochondriálnej matrice prostredníctvom mechanizmu, ktorý nezahŕňa F1 F0 -ATPázu (Garvey, 2003). Možné zapojenie UCP do zvýšenia dýchania v stave 4 vyvolanom Herba Cistanche je podporené zistením, že toto zvýšenie bolo potlačené HDP (Bento et al., 2007).

Záverom možno povedať, že liečba Herba Cistanche môže zlepšiť stav mitochondriálneho glutatiónu, znížiť hladinu mitochondriálneho Ca{0}} a zvýšiť potenciál mitochondriálnej membrány a rýchlosť dýchania v srdciach potkanov. Zlepšenie stavu a funkčnej schopnosti mitochondriálneho glutatiónu a predpokladaná indukcia UCP môže súvisieť s kardioprotekciou poskytovanouLiečba Herba Cistanchepo úraze I/R.

PRÍRODNÝ EXTRAKT Z RASTLINY CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE PHGS75% ECH 30% ACT 12%