Účinok extraktov z Cistanche Tubulosa na samčiu reprodukčnú funkciu u diabetických potkanov indukovaných streptozotocínom-nikotínamidom-Ⅱ

3.2. In vivo analýza

3.2.1. Účinky CTE na telesnú hmotnosť a príjem kalórií

Po 6 týždňoch experimentovania vykazovala diabetická skupina (HFD-DM) vyššiu telesnú hmotnosť ako kontrolná skupina. Skupina HFD-DME4 vykazovala nižšiu telesnú hmotnosť ako skupiny HFD-DM a HFD-DMER (obrázok 7a). Príjem kalórií v kontrolnej skupine bol výrazne nižší ako v ostatných skupinách. Medzi príjmom kalórií ostatných piatich skupín nebol žiadny významný rozdiel (obrázok 7b).

3.2.2. Orálny test glukózovej tolerancie (OGTT) na určenie úspešnej indukcie cukrovky

Perorálny glukózový tolerančný test (OGTT) sa používa ako sľubný nástroj na detekciu diabetes mellitus. Zvýšené hladiny glukózy v krvi naznačujú diabetický stav. Ako je znázornené na obrázku 8a, hladina glukózy v plazme bola nižšia v skupinách CTE ako v skupine s DM po 0, 30, 90 a 120 minútach. Ďalej plocha pod krivkou (AUC) koncentrácie glukózy v plazme ukázala, že v skupinách CTE a RSG sa rýchlosť vychytávania glukózy v krvi zvýšila (obrázok 8b).

3.2.3. Celkový obsah plazmatickej glukózy, cholesterolu a triglyceridov

Plazmatická hladina glukózy v krvi nalačno bola vyššia v skupine DM a nižšia v skupine DME2 (okrem kontroly) ako v iných. Medzi skupinami nebol žiadny významný rozdiel v celkovom cholesterole s výnimkou skupiny DME4. V skupine DME4 bola hladina cholesterolu nižšia ako u ostatných. Hladina triglyceridov bola vyššia v skupine DM a nižšia v skupine DME4 a obsah triglyceridov sa znížil so zvýšením koncentrácie CTE (tabuľka 2). Výsledky ukazujú, že hladina glukózy v plazme, cholesterolu a triglyceridov bola vyššia v skupine DM a hladina bola významne znížená pri liečbe CTE.

3.2.4. Hladiny inzulínu v plazme, hladina leptínu v plazme a hodnotenie modelu homeostázy – hodnoty inzulínovej rezistencie (HOMA-IR)

Hladiny inzulínu v plazme, leptínu a hodnoty HOMA-IR sú uvedené v tabuľke 3. Skupina DM mala vyššie hladiny inzulínu a leptínu v plazme ako kontrolná skupina. Index HOMA-IR bol tiež významne vyšší v skupine DM. Hodnoty plazmatického inzulínu, leptínu a HOMA-IR sa znížili so zvýšením koncentrácie CTE. Plazmatický leptín bol významne znížený v skupinách CTE, ale skupina s liekmi RSG (DMR) nevykazovala žiadny významný rozdiel od skupiny DM.

3.2.5. Účinok CTE na hladiny LH a testosterónu v plazme u diabetických potkanov

Ako je uvedené v tabuľke 4, koncentrácie testosterónu u diabetických potkanov (DM) boli významne zníženékoncentrácie testosterónu sa výrazne zvýšilipri rôznych dávkach CTE. Ďalej výsledky ukázali mierny pokles hladiny LH v skupine DM v porovnaní s DMR, DME1, DME2 a DME4. Produkcia LH bola vyššia v skupine DME4.

3.2.6. Vplyv CTE na parametre spermií diabetických potkanov

Experimentálne výsledky ukázali, že skupina DM mala signifikantný pokles počtu a pohyblivosti spermií ako kontrolná skupina, zatiaľ čo miera abnormalít spermií bola významne zvýšená v skupine DM. Je zaujímavé, že počet spermií, pohyblivosť spermií a miera abnormality spermií v skupine DMR sa zlepšili, ale pohyblivosť spermií nedosahuje významnú úroveň v porovnaní s DME4. DME2 vykazoval lepší počet spermií ako všetky z nich a rýchlosť motility bola významne zvýšená v skupine DME4. Medzi skupinami liečenými RSG a CTE nebol žiadny významný rozdiel medzi počtom abnormálnych spermií (tabuľka 5).

3.2.7. Účinok CTE na morfológiu semenných kanálikov u diabetických potkanov

Obrázok 9 ukazuje zafarbenie H&E rezu semenníkov. Čierna šípka označuje Leydigovu bunku a biela šípka označuje Sertoliho bunku. Leydigove bunky aj Sertoliho bunky v skupine s DM vykazovali významnú atrofiu a v lúmene bola pozorovaná dutina. Štruktúra Leydigových buniek a Sertoliho bola obnovená v skupinách liečených CTE a RSG. Hrúbka semenného tubulu bola vyššia v skupinách CTE a RSG ako v skupine DM.

3.2.8. Účinok CTE na KiSS1, GPR54, SOCS-3 a SIRT1 MRNA v hypotalame diabetických potkanov

Expresia KiSS1 (obrázok 10a), GPR54 (obrázok 10b), SOCS{4}} (obrázok 10d) a SIRT1 (obrázok 10c) bola znázornená na obrázku 10. Expresia mRNA KiSS1 a receptora GPR54 u diabetických potkanov bola výrazne nižšia ako v kontrolnej skupine. Hladiny expresie KiSS1 a GPR 54 mRNA v DMR, DME1, DME2 a DME4 boli významne zvýšené. Najmä expresia mRNA GPR54 bola významne zvýšená v DME4 a bola takmer podobná kontrolnej skupine.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA OCHRANU PRODUKCIE TESTOSTERÓNU PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tento experiment ďalej skúmal množstvo mRNA SOCS{0}} a SIRT1 v hypotalame potkanov. Expresia SOCS-3 mRNA u diabetických potkanov sa významne zvýšila, čo naznačuje, že impedancia leptínu bola závažnejšia. Skupiny DMR, DME1, DME2 a DME4 vykazovali významné zlepšenie v porovnaní so skupinou diabetikov. Expresia mRNA SIRT1 v skupine DM bola významne znížená a bola významne zvýšená v skupinách DME1 a DME4.

3.2.9. Účinok CTE na antioxidačné enzýmy v plazme a semenníkoch diabetických potkanov

Tabuľka 6 ukazuje, že plazmatická aktivita SOD, GPx aktivita a katalázová aktivita diabetických potkanov boli významne znížené a aktivity boli zvýšené v skupinách liečených CTE a RSG. Okrem toho DME4 vykazoval významné zlepšenia v aktivite GPx ako iné. Výsledky ukázali, že aktivity SOD a katalázy u diabetických potkanov boli po šiestich týždňoch významne znížené. Aktivita SOD a katalázy skupiny DMR nedosahuje významnú úroveň. Skupiny liečené CTE vykazovali významné zlepšenie v SOD a katalázovej aktivite. Zvýšené aktivity katalázy a SOD v skupinách CTE boli tiež pozorované v semenníkoch (tabuľka 7). Najvyššia aktivita SOD a katalázy bola pozorovaná v skupine DME1 a DME2.

3.2.10. Účinky CTE na oxidačný stres a zápal v plazme a semenníkoch diabetických potkanov

Produkcia oxidu dusnatého (NO) v plazme (obrázok 11a) a semenníkoch (obrázok 11b) bola znázornená na obrázku 11. Produkcia NO v skupine s DM bola významne zvýšená v semenníkoch aj v plazme v porovnaní s kontrolnou skupinou. Postupné znižovanie produkcie NO sa pozorovalo v skupinách DME1, DME2 a DME4 (v plazme). Skupina DMR tiež preukázala významné zníženie produkcie NO. V prípade semenníkov došlo k miernemu zníženiu produkcie NO v skupinách CTE, zatiaľ čo skupina DMR významne neznížila produkciu NO.

Ako je znázornené na obrázkoch 12 a 13, hladiny TNF- a IL-6 boli významne zvýšené u diabetických potkanov (v plazme aj semenníkoch), čo naznačuje, že zápal je vážnejší. V plazme je hladina TNF- podobná v skupinách liečených CTE a RSG (obrázok 12a). Skupiny CTE (najmä DME2) významne znížili hladinu TNF- v semenníkoch (obrázok 12b). Hladina IL-6 bola významne znížená v plazme skupín CTE a RSG (obrázok 13a). V semenníkoch bol zaznamenaný trend znižovania hladiny IL-6, ale nedosiahol významnú úroveň (obrázok 13b).

3.2.1.1. Účinky CTE na oxidačný stres a zápal u spermií diabetických potkanov vyvolaný diétou s vysokým obsahom tukov

Obrázok 14 ukazuje obsah superoxidových aniónov v spermiách potkanov. Výsledky ukázali, že produkcia superoxidových aniónov v spermiách diabetických potkanov sa výrazne zvýšila a v skupine DMR nebolo pozorované žiadne významné zlepšenie. Skupiny DME1 a DME4 vykazovali výrazne zníženú produkciu superoxidového aniónu.

3.2.12. Účinky CTE na peroxidáciu lipidov v spermiách diabetických potkanov vyvolanú diétou s vysokým obsahom tukov

Štúdie ukázali, že peroxidácia lipidov bola zvýšená u pacientov s diabetom 1. aj 2. typu [19]. Hladina malondialdehydu (MDA) v plazme, spermiách a semenníkoch je uvedená v tabuľke 8. Hladina MDA v plazme, semenníkoch a spermiách skupiny DM bola významne vyššia a liečba CTE a RSG znížila produkciu MDA. V plazme sa pozorovalo významné zníženie v skupinách DME4 a DMEI. Táto štúdia zistila, že diabetické potkany nielen zvýšili stupeň peroxidácie lipidov v plazme, ale zvýšili sa aj v semenníkoch a spermiách. Významné zlepšenie bolo pozorované pri rôznych dávkach CTE.

4. Diskusia

Cukrovka je chronické ochorenie spojené s vysokou hladinou cukru v krvi. Nerovnováha medzi hladinami antioxidantov a ROS povedie k stavu nazývanému oxidačný stres. Superoxid, hydroxylový radikál, peroxid vodíka, oxid dusnatý a singletový kyslík sú niektoré z príkladov ROS, ktoré prispejú k cukrovke prostredníctvom oxidačného stresu [20].Cistanche tubulosaje púštna rastlina, ktorá obsahuje aktívne zložky ako naprpolysacharidy, oligosacharidy, fenyletanoidové glykozidy (echinakozid, verbaskozid)kyselina palmitová, kyselina linolová, iridoidy, alditoly a lignany. Táto rastlina je schopná produkovať protizápalové, neuroprotektívne, antibakteriálne, antivírusové, antioxidačné, protinádorové a imunomodulačné účinky [21]. Literárne štúdie ukazujú, že fenyletanoidové glykozidy z Cistanche tubulosa sú hlavným dôvodom antioxidačnej aktivity [22]. Resveratrol (RES) a rosiglitazón (RSG) sa považovali za pozitívnu kontrolu pre štúdie in vitro a in vivo. RSG je silný inzulínový senzibilizátor a má afinitu k izoforme receptora aktivovaného peroxizómovým proliferátorom (PPARc). Kontroluje hyperglykémiu u diabetických pacientov [23]. RES má prirodzenú antioxidačnú aktivitu a pôsobí ako vazodilatátor, reguluje metabolizmus lipoproteínov, inhibuje agregáciu krvných doštičiek a je prevenciou rakoviny [24,25]. Naše vyšetrovanie ukázalo, že ECH vykazuje lepšiu aktivitu zachytávania radikálov ako CTE a RES (obrázok 1). Tiež sa rozumie, že ECH nespôsobuje žiadnu významnú toxicitu pre LC-540 a TM3 Leydigove bunky (obrázok 2).

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA PRE MUŽSKÉ SEXUÁLNE FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

AGE sa použili na vyvolanie stresových podmienok v Leydigových bunkách. Produkcia AGE, zápal, oxidačný stres a cukrovka sú vzájomne prepojené. Hyperglykemický stav cukrovky podporuje poškodenie buniek prostredníctvom produkcie AGE a oxidačného stresu. AGE indukujú bunkovú toxicitu, ktorá ďalej podporuje nábor imunitných buniek a bunkovú smrť. Zvýšená hladina AGE podporuje expresiu dvoch typov receptorov nazývaných RAGE a AGER1 [26]. Odkvapkávanie a následný prenos elektrónu z mitochondriálneho dýchacieho reťazca na molekulárny kyslík počas oxidačného stresu vedie k tvorbe superoxidového aniónu. Naše výsledky ukazujú, že produkcia superoxidového aniónu indukovaného AGE bola zvýšená v kontrolnej skupine a ďalšie zlepšenia boli pozorované pri liečbe ECH aj RES. Podľa našej štúdie sa pochopilo, že produkcia superoxidu (obrázok 3) a H2O2 (obrázok 4) indukovaná AGE bola znížená v prítomnosti ECH a RES.

NF-κB je známy ako dôležitý mediátor zápalu spojeného s diabetom [27]. Expresia NF-KB vedie k bunkovej dysfunkcii a bunkovej smrti. Aktivácia NF-κB oxidačným stresom stimuluje prozápalovú odpoveď, upreguláciu endotelínu a apoptózu [28]. Expresia RAGE a NF-KB sa zvýšila v skupinách stimulovaných AGE a následné zníženie sa pozorovalo v bunkách ošetrených ECH a RES (obrázok 5).

Testosterónje anabolický steroid a primárnymužský pohlavný hormónsyntetizované z cholesterolu. Proces začína oxidačným štiepením bočného reťazca cholesterolu génom na štiepenie bočného reťazca cholesterolu (CYP11A). Tento gén je lokalizovaný v mitochondriálnej membráne a premieňa cholesterol na pregnenolón. Ďalej gén CYP17A1 z endoplazmatického retikula odstraňuje dva ďalšie atómy uhlíka a produkuje viacero C19 steroidov. Okrem toho sa pregnenolón oxiduje za vzniku androstendiónu/progesterónu hydroxysteroiddehydrogenázou (3- -HSD). Nakoniec sa testosterón produkuje redukciou ketoskupiny v 17. uhlíkovej polohe androstendiónu pomocou 17-beta-hydroxysteroid dehydrogenázy (17- -HSD). Leydigove bunky sa podieľajú na hlavnej produkcii testosterónu. Transfer cholesterolu do vnútornej mitochondriálnej membrány vyžaduje pôsobenie steroidogénneho akútneho regulačného proteínu (StAR). Súčasné štúdie ukazujú, že expresia StAR, CYP11A1, CYP17A1 a HSD17 3 bola znížená v bunkách ošetrených AGE (kontrola) a došlo k obrovskému zvýšeniu v bunkách ošetrených ECH a RES (obrázok 6) . Výsledky teda ukazujú, že produkciatestosterón sa zvýšil v skupinách liečených ECH a RES. 

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXU PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Počas diabetického stavu je transport glukózy do orgánov obmedzený a v dôsledku toho sa hladiny glukózy zvyšujú [29]. Preto je hyperglykemický stav jedným z dôležitých markerov pre detekciu diabetu. Naše štúdie ukazujú, že hladina glukózy v plazme bola zvýšená v diabetických skupinách a AUC skupiny DM bola významne vyššia ako u ostatných skupín (obrázok 8). Spolu s plazmatickou glukózou bol v skupine s DM významne zvýšený obsah celkového cholesterolu a triglyceridov (tabuľka 2). Ateroskleróza je podporovaná zvýšenou hladinou cholesterolu a triglyceridov [30]. Avšak hladina cholesterolu a triglyceridov bola znížená v skupinách liečených CTE a RSG. Obsah triglyceridov v skupine DME4 dosiahol takmer podobné hodnoty ako v kontrolnej skupine.

Inzulín je hormón produkovaný bunkami pankreasu a funkcionalizovaný na kontrolu hladiny cukru v krvi v tele, zatiaľ čo leptín je hormón produkovaný adipocytmi, ktoré sú schopné regulovať príjem potravy a využitie energie. Štúdie ukázali, že leptín sa podieľa na patofyziológii obezity a existuje pozitívna interakcia medzi leptínom a inzulínom [31]. Naše štúdie ukazujú, že hladina plazmatického inulínu a leptínu bola vyššia v skupine DM a hladina inzulínu bola znížená so zvýšením koncentrácie CTE. Skupina RSG nevykazuje žiadny významný rozdiel od skupiny DM. Inzulínová rezistencia a funkcia buniek boli hodnotené metódou HOMA-IR. Hodnota HOMA-IR sa zvýšila v skupine DM a bola významne odlišná od ostatných skupín (tabuľka 3).

DM ovplyvňuje reprodukčnú funkciu prostredníctvom hormonálnej alternácie v HPG osi a štúdie ukázali, že expresiu inzulínu v semenníkoch ovplyvňuje aj diabetes. Je charakterizovaná vakuolizáciou Sertoliho buniek, zvýšenou fragmentáciou DNA, zhoršenou spermatogenézou a zvýšenou depléciou zárodočných buniek. Oxidačný stres tiež prispieva k abnormalitám v reprodukčnej funkcii [32]. Proces tvorby spermií v mužskom reprodukčnom orgáne (semenníky) sa nazýva spermatogenéza. Semenník sa skladá z tesne stočených tubulov nazývaných semenotvorné tubuly. Sertoliho bunky sú viditeľné v stenách semenných kanálikov a poskytujú výživu nezrelým spermiám. Vyšetrenie parametrov spermií ukázalo, že v skupine s DM sa znížil počet spermií a pohyblivosť a zvýšili sa abnormality (tabuľka 5). Opačný účinok sa pozoroval v skupinách liečených CTE a RSG. Leydigove bunky aj Sertoliho bunky v skupine DM vykazovali významnú atrofiu a dutina bola viditeľná v lúmene. Hrúbka semenného tubulu sa tiež znížila v skupine DM. Zlepšený výsledok bol pozorovaný v skupinách liečených CTE a RSG (obrázok 9). Okrem toho hladina LH a testosterónu klesla v skupine DM a hladiny sa zvýšili v skupinách liečených CTE (tabuľka 4). U mužov boli nízke hladiny testosterónu v sére a nižšia frekvencia pulzov LH často spojené s obezitou a diabetes mellitus 2. typu [33].

Kisspeptíny kódované génom KiSS1 sú známe ako silný stimulátor HPG osi a akákoľvek mutácia v géne kisspeptínu povedie k nízkym hladinám pohlavných steroidov a gonadotropínu. Štúdie ukazujú, že u diabetických potkanov vyvolaných STZ boli hladiny Kiss1 mRNA znížené [33]. Iniciácia a udržiavanie neplodnosti u cicavcov sú spojené s receptorom 54 spojeným s G-proteínom (GPR54). Mutácia v GPR 54 je charakterizovaná absenciou sexuálneho dozrievania a nízkymi hladinami gonadotropných hormónov (LH a FSH). Prozápalové cytokíny ako IL-6 a TNF-up regulujú expresiu supresora cytokínovej signalizácie 3 (SOCS3), ktorá sa podieľa na zápalom sprostredkovanej inzulínovej rezistencii v pečeni a adipocytoch [34]. SIRT 1 je gén spojený s reguláciou niekoľkých chorôb starnutia. Tento gén je výrazne exprimovaný v bunkách pankreasu a reguluje sekréciu inzulínu a zabraňuje apoptóze. Súčasné štúdie ukázali, že expresia KiSS1, GPR54 a SIRT1 sa znížila v skupine DM, ale expresia sa zvýšila v skupinách liečených CTE (obrázok 10). Zvýšenie expresie SOCS{22}} v skupine DM naznačuje zápalový stav. Prvým molekulárnym spojením identifikovaným medzi obezitou a zápalom bol TNF-. Zvýšená hladina TNF- je teda indikátorom zápalu. Znížená hladina prozápalových cytokínov, ako sú TNF- a IL-6, bola pozorovaná v skupinách liečených CTE (obrázky 12 a 13).

Nerovnováha medzi ROS a antioxidantmi vedie k diabetickému stavu. Superoxiddismutáza (SOD), kataláza (CAT) a glutatiónperoxidáza (GPX) sú známe ako primárne antioxidanty zodpovedné za udržiavanie optimálnej hladiny ROS [35]. Z výsledkov sa zistilo, že aktivita antioxidantov bola výrazne nižšia v skupine DM. Skupiny liečené CT preukázali zlepšenie v produkcii antioxidantov. Skupina liečená RSG nepreukázala žiadne významné zlepšenie antioxidačnej aktivity (tabuľky 6 a 7).

Oxid dusnatý (NO) je známy ako dôležitý ROS, ktorý prispieva k zápalom. Naše štúdie poukazujú na to, že hladina NO bola znížená v skupinách liečených CTE (obrázok 11). Výsledky ukázali, že obsah superoxidových aniónov v spermiách diabetických potkanov sa výrazne zvýšil a po podaní RSG nenastalo žiadne významné zlepšenie. V skupinách CTE bola znížená produkcia superoxidu.

Stanovenie MDA je veľmi užitočné na hodnotenie peroxidácie lipidov. Peroxidácia lipidov je proces oxidácie lipidov a nakoniec vedie k poškodeniu buniek. MDA sa vyrába ako výsledok lipidovej peroxidácie polynenasýtených mastných kyselín. Štúdie ukazujú, že hladina MDA koreluje s vekom a hladinou glukózy v krvi nalačno [36]. Súčasná štúdia ukázala, že CTE zlepšuje peroxidáciu lipidov v plazme, semenníkoch a spermiách (tabuľka 8).

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Závery

Oxidačný stres počas diabetických stavov narúša mužský reprodukčný systém prostredníctvom poškodenia spermií a gonadálnej dysfunkcie. Cistanche tubulosa je púštna rastlina široko akceptovaná v čínskej medicíne pre jej farmakologické účinky.Echinakozid (ECH)je hlavnou zložkou CTE zodpovednou za jeho antioxidačné a protizápalové aktivity. Naše výsledky in vitro ukázali, že ECH obnovila dráhu syntézy testosterónu a znížila hladinu expresie proteínov NF-KB a RAGE. ECH účinne inhibovala produkciu superoxidového aniónu a H2O2 v Leydigových bunkách. Štúdie in vivo odhalili, že ECH znižuje hladiny cholesterolu, triglyceridov, TNF- a IL-6. Okrem toho sa výrazne zlepšili expresie mRNA v hypotalame diabetických potkanov. Je tiež potrebné poznamenať, že ECH znížila peroxidáciu lipidov a zlepšila inzulínovú rezistenciu u diabetických samcov potkanov. Antioxidačné aktivity sa zvýšili v plazme aj v semenníkoch. Naše štúdie preto naznačujú, že ECH poskytuje účinnú ochranu pred reprodukčnou dysfunkciou u samcov potkanov s cukrovkou vyvolanou STZ.