Vysoký P16INK4a, marker bunkového starnutia, je spojený s poškodením obličiek, poškodením a výsledkom pri lupusovej nefritíde
Mar 24, 2022
CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN
ÚVODLupusová nefritída (LN) je závažná komplikácia systémového lupus erythematosus (SLE), iniciovaná ukladaním imunitných komplexov alebo autoprotilátok v glomerulárnej bazálnej membráne, po ktorej nasleduje hromadenie zápalových buniek.'Poranenie obličiekvedie k ireverzibilnej fibróze, čo vedie k strate funkcie obličiek. LN sa lieči vysokými dávkami kortikosteroidov a iných imunosupresív. Jedna tretina pacientov napriek tomu vykazuje poklesfunkcie obličiek, pričom 5 percent -10 percent rozvíja konečnú fázuobličkové ochoreniedo 10 rokov." Preto sa dychtivo hľadajú prognostické markery, ktoré by umožnili včasnú eskaláciu alebo úpravu liečby, rovnako ako nové terapeutické ciele. Bunková senescencia, spustená stimulmi, ako je erózia telomér, oxidačný stres a chronický zápal, v konečnom dôsledku vedie k nezvratnému rastu zastavenie prostredníctvom akumulácie inhibítorov cyklín-dependentnej kinázy (CDK) vrátane proteínu pl6Na (CDKN2A): hlavný znak vedy o celulárnych zénoch. Senescentné bunky zostávajú metabolicky aktívne a podliehajú mnohým morfologickým a fyziologickým zmenám vrátane zvýšenej regulácie aktivity -galaktozidázy a získavania prozápalového sekrečného fenotypu spojeného s profibrotickým starnutím (SASP). Zatiaľ čo je nevyhnutné pri oprave a prestavbe tkaniva (napr. počas embryogenézy), bunková starnutie môže mať nepriaznivé účinky na starnutie a chronické ochorenia, ako aj rakovinu. boli pozorované bunky pozitívne na pl6Nk alebo -galaktozidázuobličkovéstarnutie a niektoré ochorenia obličiek a boli spojené s histologickými léziami aobličkovéoslabenie. Prítomnosť buniek pozitívnych na galaktozidázu korelovala s proteinúriou u myší so sklonom k MRL/lprlupus; bunková senescencia však ešte musí byť jasne preukázaná pri pozitívnej LN. Tu uvádzame výskyt pl6ka. buniek v obličkových biopsiách od (n=40) pacientov s aktívnou LN a ich spojenie spoškodenie obličieka funkčné poškodenie.
Kľúčové slová:funkcia obličiek; ochorenia obličiek; biopsie obličiek; poškodenie obličiek; obličkové
CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU OBLIČIEK/RENÁL
METÓDY:Pacienti a biopsie obličiekPacienti boli prijatí na oddelenie reumatológie, Cliniques Universitaires Saint-Luc (Brusel, Belgicko). Všetci splnili revidované kritériá klasifikácie ACR pre SLE z roku 1982 a mali biopsiou potvrdenú LN. Vo formalíne fixované parafínom zaliate (FFPE) renálne biopsie boli reziduálnym telesným materiálom zozbieraným na diagnostické účely medzi januárom 1996 a novembrom 2019. Hodnoty odhadovanej glomerulárnej filtrácie (eGFR) boli vypočítané pomocou vzorca Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration (CKD-EPI). V súlade s belgickými predpismi o štúdiách na ľuďoch sa na použitie zvyškového telesného materiálu nevyžadoval súhlas pacienta.
Histológia a imunohistochémiaISN/RPS 2003 klasifikácia SLEobličkovébiopsie, semikvantitatívne skóre sklerózy a index aktivity (AI) a index chronicity (C) Národného inštitútu zdravia (NH) boli získané z lekárskych záznamov. Imuno tréning s anti-CD8 (C8/144B, Dako) a anti-p16INK4 (E6H4, Roche Ventana CINtec Histology) a farbením Picrosirius Red (PSR) sa uskutočnilo na 5 μm FFPE sériových rezoch. Sklíčka boli digitalizované na skeneri SCN400 (Leica Biosystems, Nemecko) alebo na skeneri Pannoramic Confocal (3DHistech, Maďarsko) pri 20-násobnom zväčšení. Počítačom podporovaná kvantifikácia celého povrchu rezov sa uskutočnila pomocou Author V2017.2 (Visi Biopharm, Dánsko). Uvedené výsledky predstavujú počet pl6K alebo CD{18}}pozitívnych buniek na μm² tkaniva. Semikvantitatívne skóre PSR (škála:2-6) sú stredné skóre (glomerulárna plus intersticiálna fibróza) od troch (zaslepených) hodnotiteľov. Ďalšie podrobnosti sú uvedené v online doplnkových metódach 1, online doplnkovom obrázku 1.Štatistické analýzyŠtatistické analýzy sa vykonali na GraphPad Prism V.9.1.0: Mann-Whitney alebo Wilcoxon párový test so znamienkom pre dvojskupinové porovnania, Kruskal-Wallis pre viacskupinové porovnania a Spearmanov korelačný koeficient poradia.
VÝSLEDKY:p16k4-pozitívne bunky v biopsiách obličiek od pacientov s aktívnou LNVyhodnotili sme proteín p16Nk imunohistochémiou naobličkovébiopsie odobraté pri diagnóze od 40 pacientov s aktívnou LN, vrátane incidentu nefritídy (n=31) a relapsu (n=9). Demografické, biologické a klinické údaje sú zhrnuté v online doplnkovej tabuľke 1.p16INkA. pozitívne bunky boli detegované vo všetkých, ale so značnou variabilitou medzi vzorkami: od prakticky žiadnych po občasné rozptýlené bunky až po silne pozitívne oblasti (obrázok 1A, online doplnkový obrázok 2A-D). Kvantifikácia farbenia pl6 potvrdila heterogenitu biopsií LN (rozsah: 1,76 × 10~-260×10~, medián: 14,7×10-buniek/μm）））））））））））））(obrázok 1B,C）. Zafarbené bunky zahŕňali mezangiálne bunky, endotelové bunky alebo podocyty v glomerulách, parietálne epitelové bunky v Bowmanových kapsulách, proximálne alebo distálne tubulárne bunky a intersticiálne bunky (obrázok ID). Hoci hustota pl6-pozitívnych buniek (na μm) bola výrazne vyššia v glomeruloch ako v interstíciách (obrázok 1C) tieto hodnoty (na vzorku) vykazovali významnú pozitívnu koreláciu (r=0.7591, p<0.0001)(online supplemental="" figure="" 3).="" importantly,="" pl6ka="" accumulation="" was="" not="" associated="" with="" patient="" age,="" gender,="" or="" ethnicity="" (online="" supplemental="" figure="">
CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCIU OBLIČIEK/OBLIVÍN
p16"K4 je spojený s poruchou funkcie obličiek na začiatku a 5 rokov po liečbePozitivita p16INKEa bola významne spojená s poruchoufunkcie obličiek: biopsie od pacientov s eGFR<60 at="" the="" time="" of="" sampling="" had="" significantly="" higher="" pl6inf-positive="" cells/μm²,="" and="" conversely,="" samples="" with="" high(="">75. percentil) p16a boli spojené s výrazne nižšou východiskovou hodnotou eGFR (obrázok 2AB). Spojenie s eGFR platilo pre glomerulárny aj intersticiálny pl6a (online doplnkový obrázok 5A, B). Je zaujímavé, že zatiaľ čo vysoký glomerulárny p16 bol tiež spojený s výrazne vyššou proteinúriou (pomer proteín/kreatinín v moči), čo odráža najmä glamour – nebol (online poranenie supleulárneho tkaniva, intersticiálna pl6ka mentálna postava 5C,D). Na rozdiel od jeho spojenia s nebol spojený s chudobnýmifunkcie obličiek,pl6NK4a parametre systémového ochorenia, ako je sérová protilátka proti dvojvláknovej DNA alebo hladiny C3, alebo s ISN/RPS klasifikáciou (online doplnkový obrázok 6A-D). Mierne (nevýznamne) vyšší pl6k bol pozorovaný v biopsiách od pacientov s dlhším trvaním medzi diagnózou SLE a LN a pri relapse v porovnaní s incidentom nefritídy (online doplnkový obrázok 7A, B). Dôležité je, že analýza iba incidentových prípadov LN potvrdila súvislosť medzi pl6 a eGFR (online doplnkový obrázok 7C), čo naznačuje, že nezávisí iba od trvania ochorenia obličiek. Napokon, vysoký p16Nkia v základných biopsiách bol tiež spojený s nižším eGFR 5 rokov po liečbe (ale nie v roku), čo naznačuje, že môže predpovedať zlé dlhodobéobličkovéevolúcia (obrázok 2C,D).
Obrázok 1 P16NK43-pozitívne bunky v obličkových biopsiách od pacientov s aktívnou LN.(A) p16, CD8 a PSR farbením sériových rezov FFPE zo základnej biopsie obličky LN. Prehľad (ľavé panely), detail (vpravo) zobrazujúci p16 pozitívne bunky v glomerulu, periglomerulárne CD8-pozitívne bunky a depozity kolagénu v Bowmanovom puzdre a okolo neho rovnakého glomerulu. (B) Kvantifikácia p16xa （pozitívne bunky/μm² ukazujúce stupeň heterogenity medzi vzorkami. （C） Kvantifikácia p16< （positive="" cells/um²）="" in="" glomerular="" vs="" interstitial="" areas="" of="" the="" same="" samples.p-value:="" wilcoxon="" matched-pair="" signed-rank="" test.="" (d)="" representative="" image="" from="" a="" sample="" showing="" p16-positive="" cells="" within="" glomeruli="" (#),="" in="" bowman's="" capsules="" (filled="" star),="" proximal="" tubules(filled="" arrow),="" distal="" tubules(arrow)="" and="" dispersed="" in="" the="" interstitium="" (arrowhead).ffpe,="" formalin-fixed="" paraffin-embedded;="" ln,="" lupus="" nephritis;="" psr,="" picrosirius="">
p16NK43 je spojený s renálnou infiltráciou CD8* T buniek a fibrózou p16MaUkázalo sa, že CD8tT lymfocyty sú prevládajúcim typom imunitných buniek infiltrujúcich obličky LN a že ich prítomnosť je spojená sobličkové ochoreniezávažnosť Zistili sme, že pl6-vysoké biopsie vykazovali významne vyššiu infiltráciu CD8t T buniek (obrázok 3A). Významne súviseli aj so zvýšenou fibrózou: kolagénom
ukladanie, ako sa odráža v semikvantitatívnych skóre farbenia PSR a skóre sklerózy a NHCI poskytnutých neuropatológom (obrázok 3B-D). Naopak, skóre NIH AI sa medzi skupinami p16INK4as významne nelíšilo (údaje nie sú uvedené). Je zaujímavé, že pri skúmaní tkanivových rezov sme si všimli to, čo sa zdalo byť priestorovou spoločnou distribúciou medzi silným farbením pl6k (ktoré malo tendenciu byť glomerulárne) a zhlukovanými CD8-pozitívnymi bunkami (najčastejšie periglomerulárnymi) v určitých biopsiách LN (obrázok IA, online doplnkový obrázok 2). My teda. kvantifikovali počet CD8* T buniek umiestnených v okruhu 30 μm okolo každého glomerulu, hrúbku jeho Bowmanovho puzdra a počet pl6k-pozitívnych buniek v ňom (online doplnkový obrázok 1). Toto sa uskutočnilo na všetkých glomeruloch viditeľných na troch sériových rezoch vo všetkých vzorkách. Glomeruli s vysokou akumuláciou pl6K4-pozitívnych buniek vykazovali významne vyššie perigo-makulárne CD8 T bunky (obrázok 3E), ako aj zväčšenú hrúbku Bowmanových puzdier, čo odráža glomerulárnu fibrózu (obrázok 3F).
DISKUSIAToto je prvý dôkaz na veľkej sérii pacientov, že pl6Na, hlavný znak starnutia buniek, je spojený so závažnosťou ochorenia v LN. IHC pre proteín pl16 sa široko používa na hodnotenie starnutia ex vivo a spája sa so závažnosťou inýchobličkovéOkrem toho sa ukázalo, že selektívna eliminácia pl6-pozitívnych buniek v myších modeloch starnutia a indukovanej nefropatie zmierňuje fibrotické lézie a zlepšujefunkcie obličiek“, čo naznačuje kľúčovú úlohu vobličkovépatogenézy. Prečo môže dôjsť k starnutiu buniek v LN, nie je známe. Zápalové, oxidačné prostredie obličiek LN môže byť zdrojom bunkového stresu. Na indukcii starnutia sa podieľa niekoľko prozápalových faktorov, 14 vrátane interferónu-B3, ktorý je spojený so senescentným fenotypom mezenchymálnych kmeňových buniek kostnej drene od pacientov so SLE15Zatiaľ čo naša štúdia zdôrazňuje významnú súvislosť medzi množstvom pl6-pozitívnych buniek a závažnosťou LN, použitie ďalších markerov bunkovej starnutia vo väčšej kohorte bude nevyhnutné na potvrdenie jej relevantnosti v LN. Či a ako bunková starnutie prispieva k progresii ochorenia (alebo či jednoducho odráža poškodenie tkaniva), je potrebné preskúmať. Škodlivý účinok sa môže prejaviť prostredníctvom profibrotického, prozápalového sekretómu (SASP) typického pre senescentné bunky. V súlade s touto hypotézou opisujeme tesnú priestorovú spoločnú distribúciu medzi pl6Nk pozitívnymi bunkami, fibrózou a infiltráciou CD8* T buniek v obličkách LN. Ďalší patogénny mechanizmus môže zahŕňať akumuláciu funkčne nekompetentných buniek, napr.obličkovéprogenitorové bunky (RPC, podskupina parietálnych epitelových buniek umiestnených v Bowmanovom puzdre glomerulov).'" Zatiaľ čo zdravé RPC regenerujú glomerulárne a tubulárne štruktúry vďaka svojej schopnosti proliferovať a diferencovať sa doobličkovépodmnožiny buniek, „starnúce RPC by mohli brániť oprave tkaniva.“ Napokon, zatiaľ čo SASP je obzvlášť vhodný na zapojenie imunitného systému (vrátane CD8t T lymfocytov)“8 na odstraňovanie starnúcich buniek, tieto môžu zastaviť proces inhibíciou Cyto lyická bunka." Bolo navrhnuté, že pretrvávanie starnúcich buniek (v dôsledku ohromenia alebo inhibície imunitnej odpovede) nakloní rovnováhu z pozitívneho na negatívny vplyv." Na rozbor úloha pl6Nk-pozitívnych buniek v patogenéze LN. To môže mať dôležité dôsledky pre terapiu, prvá otvorená pilotná štúdia s použitím senolytických liekov dasatinib plus kvercetín (DQ), ktorá ukázala sľubné výsledky pri idiopatickej pľúcnej fibróze a diabetickom ochorení obličiek.Nakoniec spojenie vysokej základnej línie pl6INk4 s poruchoufunkcie obličiek5 rokov po začatí liečby naznačuje, že môže byť sľubným prediktorom závažnosti ochorenia. Bolo by zaujímavé vyhodnotiť pl6 a s ním spojené markery (fibrózu a infiltráciu T-buniek CD8) v 1-ročných následných biopsiách, ako aj vo väčšej kohorte, pretože vývoj týchto markerov od východiskovej hodnoty k 1rok môže lepšie odrážať odpoveď na liečbu ako ktorýkoľvek časový bod samostatne.
