Diéta s vysokým obsahom fosforu indukuje upreguláciu expresie Bmp2 a Spp1 MRNA v obličkách potkanov

Hiroshi Matsuzaki, Kikue Mori, Shinichi Katsumata 

Aby sme objasnili mechanizmus rozvoja nefrokalcinózy indukovanej diétou s vysokým obsahom fosforu (P), zamerali sme sa na proteíny súvisiace s kosťou, ako je kostný morfogenetický proteín 2 a osteopontín. Táto štúdia skúmala účinky stravy s vysokým obsahom P na expresiu mRNA Bmp2 a Spp1 u potkanovobličky. Potkany Wistar boli rozdelené do dvoch skupín a kŕmené kontrolnou diétou (kontrolná skupina) alebo diétou s vysokým P (skupina s vysokým P).Obličkykoncentrácie vápnika a P boli významne zvýšené v skupine s vysokým P v porovnaní s kontrolnou skupinou. Expresia mRNA Bmp2 aj Sppl bola významne zvýšená v skupine s vysokým P v porovnaní s kontrolnou skupinou. Tieto výsledky naznačujú, že diéta s vysokým obsahom P indukuje upreguláciu mRNA Bmp2 a Spp1 vobličky.

Kľúčové slová: diéta s vysokým obsahom fosforu, nefrokalcinóza, Bmp2, Spp1,obličky, potkan

Pre viac informácií kontaktujte:emily.li@wecistanche.com

cistanche na liečbu ochorenia obličiek

Úvod

Nefrokalcinóza je porucha charakterizovaná ukladaním vápnika (Ca) v obličkovom parenchýme. Hlavný faktor vo vývoji tejto poruchy je najmä fosfor v potrave (P). Ukázalo sa, že podávanie diéty s vysokým obsahom P vedie k zvýšenej koncentrácii Ca vobličkya depozity Ca v obličkovom parenchýme1-6）. Hoci vplyv diéty s vysokým obsahom P na rozvoj nefrokalcinózy bol stredobodom prebiehajúcej štúdie, o mechanizme zodpovednom za rozvoj tejto poruchy sa vie len málo. Preto je potrebné včasné riešenie tohto problému.

Uviedli sme, že pri histologickom vyšetrení pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie boli v obličkových tubuloch potkanov kŕmených diétou s vysokým obsahom P6, 7）, pozorované ihlovité kryštály podobné hydroxyapatitu. Röntgenová mikroanalýza ukázala, že usadeniny Ca2 vyvolané diétou s vysokým obsahom P sa skladajú hlavne z Ca a P7）. Tieto výsledky odhalili, že usadeniny Ca2 vyvolané diétou s vysokým obsahom P sú formou hydroxyapatitu. Na základe tohto zistenia predpokladáme, že rozvoj nefrokalcinózy je riadený mechanizmom podobným tomu pri tvorbe kostí. Preto sa táto štúdia zamerala na proteíny spojené s kosťou, ako je kostný morfogenetický proteín 2 (BMP2). BMP2 je osteogénny faktor, ktorý vykazuje aktivitu indukujúcu osteogenézu8, 9）. Je pozoruhodné, že BMP2 bol identifikovaný ako faktor vyvolávajúci ektopický stavkosťtvorenie10, 11). Predpokladali sme teda, že ak BMP2 hrá dôležitú úlohu pri rozvoji nefrokalcinózy, expresia tohto proteínu vobličkyby boli upregulované diétou s vysokým P. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť, či diéta s vysokým obsahom P ovplyvňuje expresiu mRNA Bmp2 vobličky.

Naša predchádzajúca štúdia medzitým uviedla, že diéta s vysokým obsahom P zvyšuje expresiu osteopontínu (OPN) v obličkových tubuloch pomocou imunohistochemickej analýzy, čo naznačuje, že OPN sa môže podieľať na vývoji depozitov Ca2 vyvolaných diétou s vysokým obsahom P12）. Preto sme skúmali zmeny v expresii Sp1 mRNA vobličkytiež.

Výsledky tejto štúdie môžu poskytnúť cenné poznatky o mechanizme zodpovednom za rozvoj nefrokalcinózy vyvolanej diétou s vysokým obsahom P.

Materiály a metódy

Zvieratá a diéty.

Táto štúdia bola schválená Výborom pre používanie zvierat Tokijskej poľnohospodárskej univerzity a všetky zvieratá boli chované v súlade s univerzitnými smernicami pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat (č. schválenia 300049).

Je dôležité poznamenať, že u samíc potkanov sa nefrokalcinóza rozvinie ľahšie ako u samcov potkanov13, 14). Okrem toho sme uviedli, že diéta s vysokým obsahom P zvyšuje expresiu OPN v obličkových tubuloch samíc potkanov12）. V tejto štúdii sa potom použili samice potkanov ako experimentálne zvieratá. Štvortýždňové samice potkanov Wistar (Clea Japan, Tokio, Japonsko) boli umiestnené v individuálnych klietkach z drôteného pletiva z nehrdzavejúcej ocele. Počas experimentálneho obdobia boli klietky umiestnené v miestnosti s riadeným osvetlením pod 12-h svetelný cyklus: tma (svetlo, 0800-2000h), teplota 22 ± 1 stupeň a relatívna vlhkosť 60 percent na 65 percent.

Zloženie experimentálnej stravy je uvedené vTable 1. Experimentálne diéty boli pripravené s odkazom na diétu AIN{{0}}G15). Experimentálne diéty obsahovali dve rôzne koncentrácie P (kontrolná diéta, 0,3 percenta; diéta s vysokým obsahom P, 1,5 percenta). Koncentrácia P v strave s vysokým obsahom P bola nastavená na 1,5 percenta, pretože naše predchádzajúce štúdie zistili, že koncentrácia P v strave 1,5 percenta vyvoláva

ťažká nefrokalcinóza6, 7, 12, 14）a vysoká expresia OPN12）. Všetky experimentálne diéty mali rovnakú koncentráciu Ca (0,5 percenta). Koncentrácie P a Ca, stanovené analýzou experimentálnej stravy, sú uvedené vTable 1. Pred začiatkom štúdie boli všetky potkany aklimatizované počas 7 dní, počas ktorých mali voľný prístup ku kontrolnej strave a deionizovanej vode. Po aklimatizačnom období boli potkany náhodne rozdelené do dvoch skupín s podobnou strednou telesnou hmotnosťou a kŕmené buď kontrolnou diétou (kontrolná skupina) alebo diétou s vysokým P (skupina s vysokým P) počas 14 dní. Potkany mali počas experimentálneho obdobia voľný prístup k pridelenej experimentálnej strave a deionizovanej vode. Na konci experimentálneho obdobia boli potkany usmrtené intraperitoneálnou injekciou anestetickej zmesi (medetomidín, midazolam a butorfanol) a krvi aobličkyvzorky sa odobrali na analýzu. Vzorky krvi sa odstredili a supernatanty sa použili ako vzorky séra. Obličky sa odstránili a obličkové puzdro sa vyhodilo. Sérum aobličkyvzorky sa skladovali pri teplote -80 stupňov, kým neboli potrebné na analýzu. Pravá oblička sa použila na kvantitatívnu analýzu mRNA Bmp2 a Sp1 a ľaváobličkysa použil na analýzu koncentrácií Ca a P.

Analýza minerálov.

Vzorky experimentálnych diét aobličkysa spopolnili pri 550 stupňoch počas 48 hodín v muflovej peci a minerály sa extrahovali v 1 mol/l HCl na analýzu. Koncentrácie Ca v experimentálnych diétach aobličkyboli stanovené atómovou absorpčnou spektrofotometriou16). koncentrácie P v experimentálnych diétach aobličkyboli analyzované pomocou metódy Gomori17).

Kvantitatívna analýza Bmp2 a Sppl mRNA.

Celková RNA sa izolovala z homogenizovanej obličky pomocou činidla TRIzol (Life Technologies, CA, USA) podľa špecifikácií výrobcu. Množstvo a čistota RNA boli hodnotené pomocou NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). cDNA bola syntetizovaná pomocou SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix pre qRT-PCR (Life Technologies) a potom podrobená kvantitatívnej RT-PCR v reálnom čase pomocou SYBR Select Master Mix (Life Technologies). Špecifické priméry18-20）boli použité na analýzu Bmp2 (dopredu, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; reverzné, 5'-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA-3'), Spp1 (dopredu, 5'- TGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3'; dozadu, 5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3') a Gapdh (dopredu, 5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3'; dozadu, 5'-GCAT-CACCCCATTTGATGTT{{266}GATGTT{{266}GATGTT }'). Reakcia PCR v reálnom čase sa uskutočnila pomocou systému StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) a hladiny expresie mRNA sa normalizovali na hladiny mRNA Gapdh. Hodnota kontrolnej skupiny bola považovaná za 1,00.

Štatistická analýza.

Výsledky sú prezentované ako priemer ± SEM pre každú skupinu 6 potkanov. Po vykonaní F-testu na stanovenie homogenity rozptylov sa použil Studentov t-test na stanovenie významných rozdielov medzi týmito dvoma skupinami. Ak homogenita rozptylov nebola rovnaká, namiesto Studentovho t-testu sa použil Welchov t-test. Rozdiely sa považovali za významné pri p ＜ 0,05

Výsledky

Telesná hmotnosť, príjem potravy a analýza séra.

Konečná telesná hmotnosť a príjem potravy boli významne znížené v skupine s vysokým P v porovnaní s kontrolnou skupinou (Tabuľka 2). Obličkyhmotnosť a koncentrácie minerálov.Obličkymokré a suché hmotnosti boli významne zvýšené v skupine s vysokým P v porovnaní s kontrolnou skupinou (Tabuľka 3). ObličkyKoncentrácie Ca a P boli tiež významne zvýšené v skupine s vysokým obsahom P v porovnaní s kontrolnou skupinou.

Renálna expresia Bmp2 a Spp1 mRNA.

Hladiny Bmp2 mRNA v skupine s vysokým P boli významne zvýšené v porovnaní s kontrolnou skupinou (Obr.1A). Expresia mRNA Sp1 bola tiež významne zvýšená v skupine s vysokým P v porovnaní s kontrolnou skupinou (Obr. 1B).

Diskusia

Jedným zo známych fyziologických účinkov diéty s vysokým obsahom P je rozvoj nefrokalcinózy. V tejto štúdii boli koncentrácie Ca a P v obličkách zvýšené v skupine s vysokým P v porovnaní s kontrolnou skupinou, čo je v súlade s výsledkami predchádzajúcich štúdií1-6）. Predchádzajúce štúdie uvádzali, že histologické skóre nefrokalcinózy pozitívne korelovalo s koncentráciami Ca a P v obličkách4, 21）. Aj keď sa v tejto štúdii neuskutočnilo žiadne histologické pozorovanie obličiek, zvýšené koncentrácie Ca a P v obličkách naznačujú, že nefrokalcinóza bola vyvolaná diétou s vysokým obsahom P.

Pretože depozity Ca2 vyvolané diétou s vysokým obsahom P sa vo všeobecnosti považujú za formu hydroxyapatitu6, 7）, predpokladali sme, že vývoj nefrokalcinózy je riadený mechanizmom podobným mechanizmu osteogenézy. Skúmali sme teda účinky diéty s vysokým obsahom P na expresiu mRNA Bmp2 v obličkách. Výsledky

ukázali, že renálna expresia Bmp2 mRNA bola zvýšená v skupine s vysokým P a že diéta s vysokým obsahom P indukuje upreguláciu expresie Bmp2 mRNA v obličkách. Toto zistenie môže pomôcť vysvetliť mechanizmus vývoja nefrokalcinózy vyvolaný diétou s vysokým obsahom P. Hoci definitívny dôkaz podporujúci našu hypotézu chýba, jednou z možností je, že expresia osteogénnych transkripčných faktorov je zvýšená v kalcifikovaných oblastiach v obličkách. BMP2 indukuje diferenciáciu osteoblastov a tvorbu kostí reguláciou osteogénnych transkripčných faktorov, ako sú Osterix, Runx2 a Msx28, 9）; teda BMP2 môže podporovať nefrokalcinózu prostredníctvom regulácie takýchto osteogénnych transkripčných faktorov. V súčasnosti zostáva podrobná úloha BMP2 vo vývoji nefrokalcinózy nejasná. Okrem toho, keďže sa v tejto štúdii merala iba expresia mRNA Bmp2, nie je známe, či existuje rozdiel v expresii proteínu BMP2. Naše výsledky však naznačujú možný mechanizmus, ktorým zmeny v expresii BMP2 hrajú silnú úlohu v patogenéze nefrokalcinózy vyvolanej diétou s vysokým obsahom P.

Táto štúdia sa okrem expresie mRNA Bmp2 zamerala aj na expresiu mRNA Spp1. Naša predchádzajúca štúdia využívajúca imunohistochemickú analýzu ukázala vysoké hladiny expresie OPN v obličkových tubuloch potkanov kŕmených diétou s vysokým obsahom P12）. Táto štúdia zistila, že expresia Sp1 mRNA bola zvýšená približne 10--krát v skupine s vysokým P. Výsledky súčasných a predchádzajúcich štúdií ukazujú, že diéta s vysokým obsahom P indukuje expresiu OPN v obličkách. Na druhej strane iní výskumníci ukázali, že OPN ako kamenná matrica je dôležitým faktorom pri tvorbe močových kameňov22, 23）; Naša predchádzajúca správa teda naznačila, že OPN môže zohrávať úlohu matricovej zložky pri tvorbe usadenín Ca2 vyvolaných diétou s vysokým obsahom P12）. Avšak Paloian a spol. nedávno uviedli, že OPN hrá úlohu pri prevencii nefrokalcinózy vyvolanej diétou s vysokým P u myší OPN KO24）. Konkrétne sa zdá, že fyziologická úloha OPN pri nefrokalcinóze vyvolanej diétou s vysokým obsahom P je skôr potlačením než podporou kalcifikácie vobličky. Okrem toho sú v predchádzajúcich správach opísané, že hladiny OPN sa zvyšujú, aby kompenzovali ďalšiu patologickú ektopickú kalcifikáciuobličkya vaskulatúra, pretože OPN je upregulovaný v mieste patologickej kalcifikácie.

Ako je uvedené vyššie, táto štúdia naznačila dôležitosť BMP2 a OPN pri nefrokalcinóze vyvolanej diétou s vysokým P. Je pozoruhodné, že sa predpokladá, že účinky BMP2 a OPN na rozvoj nefrokalcinózy sú regulované rôznymi mechanizmami. Tieto mechanické rozdiely môžu naznačovať, že základný mechanizmus nefrokalcinózy je komplikovaný. Ďalším bodom, ktorý je potrebné zvážiť, je, že inhibícia rastu mohla ovplyvniť expresiu mRNA Bmp2 a Sp1 vobličkypretože táto štúdia pozorovala zníženie konečnej telesnej hmotnosti v skupine s vysokým P. Pozorovania v našich predchádzajúcich12) a súčasných štúdiách môžu pomôcť vysvetliť tento bod. Predtým sme uviedli zvýšenú expresiu proteínu OPN v obličkových tubuloch potkanov, ktorých rast

nebola inhibovaná diétou s vysokým P12). Okrem toho táto štúdia ukázala inhibíciu rastu v skupine s vysokým P, ale vysoké hladiny expresie Sppl mRNA v obličkách. Na základe týchto pozorovaní sa zdá, že táto štúdia má malý vplyv na inhibíciu rastu expresie Bmp2 a Sp1 mRNA. Podrobnosti vzťahu medzi inhibíciou rastu a expresiou génov Bmp2 a Sp1 však zostávajú nejasné. Na objasnenie tohto bodu sú preto potrebné ďalšie výskumy.

Na záver, aby sa objasnil mechanizmus rozvoja nefrokalcinózy vyvolanej diétou s vysokým obsahom P, táto štúdia určila účinky diéty s vysokým obsahom P na expresiu mRNA Bmp2 a Spp1 vobličky. Koncentrácie Ca a P v obličkách boli významne zvýšené v skupine s vysokým P v porovnaní s kontrolnou skupinou. Ďalej, expresia mRNA Bmp2 a Sp1 bola významne zvýšená v skupine s vysokým P v porovnaní s kontrolnou skupinou. Tieto výsledky naznačujú, že diéta s vysokým obsahom P podporuje upreguláciu expresie Bmp2 a Sp1 mRNA vobličky.

Referencie

1） Hitchman AJ, má nejakú SA, Hitchman A, Harrison JE, Tam C: Kalcifikácia obličiek u potkanov vyvolaná fosfátmi. Can J Physiol Pharmacol 57: 92-97, 1979

2） Parker HE: Vzájomné vzťahy horčíka a fosforu na úrovni zodpovedajúcej nadbytku fosforu v strave. Nutr Rep Int 32: 1311-1318, 1985

3） Ritskes-Hoitinga J, Lemmens AG, Danse LHJC, Beynen AC: Fosforom indukovaná nefrokalcinóza a funkcia obličiek u samíc potkanov. J Nutr 119: 1423-1431, 1989

4） Cockell KA, L'Abbe MR, Belonje B: Koncentrácie a pomer vápnika a fosforu v potrave ovplyvňujú vývoj nefrokalcinózy u samíc potkanov. J Nutr 132: 252-256, 2002

5） Katsumata S, Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K: Účinky výživového doplnku vápnika na metabolizmus kostí, koncentrácie minerálov v obličkách a funkciu obličiek u potkanov kŕmených stravou s vysokým obsahom fosforu. J Nutr Sci Vitaminol 61: 195-200, 2015

6） Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K, Liu QL, Sato S, Kanke Y, Goto S: Diéta s vysokým obsahom fosforu rýchlo indukuje nefrokalcinózu a poškodenie proximálnych tubulov u potkanov. J Nutr Sci Vitaminol 43: 627-641, 1997

7) Liu QL, Sato S, Kishikawa T, Matsuzaki H, Yamanaka N: Účinnosť tradičnej čínskej medicíny, Wulingsan, pri potláčaní rozvoja nefrokalcinózy vyvolanej diétou s vysokým obsahom fosforu u mladých potkanov. Med Electron Microsc 34: 103-114, 2001

8） Sirard C, Kim S, Mirtsos C, Tadich P, Hoodless PA, Its A, Maxson R, Wrana JL, Mak TW: Cielené narušenie v myších bunkách odhaľuje variabilnú požiadavku na Smad4 v signalizácii súvisiacej s transformujúcim rastovým faktorom. J Biol Chem 275: 2063-2070, 2000

9） Matsubara T, Kida K, Yamaguchi A, Hata K, Ichida F, Meguro H, Aburatani H, Nishimura R, Yoneda T: BMP2 reguluje Osterix prostredníctvom Msx2 a Runx2 počas diferenciácie osteoblastov. J Biol Chem 283: 29119-29125, 2008

10) Urist MR: Kosť: Tvorba autoindukciou. Science 150: 893-899, 1965

11） Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, Hewick RM, Wang EA: Nové regulátory tvorby kostí: Molekulárne klony a aktivity. Science 242: 1528-1534, 1988

12） Matsuzaki H, Katsumata S, Uehara M, Suzuki S, Miwa M: diéta s vysokým obsahom fosforu indukuje osteopontínovú expresiu renálnych tubulov u potkanov. J Clin Biochem Nutr 41: 179-183, 2007

13) Cousins ​​FB, Geary CPM: Pohlavie podmienená kalcifikácia obličiek u potkanov. Nature 211: 980-981, 1966

14） Matsuzaki H, Katsumata S, Masuyama R, Uehara M, Nakamura K, Suzuki K: Pohlavné rozdiely v koncentráciách minerálov v obličkách a vylučovaní albumínu v moči u potkanov, ktorým sa podávalo krmivo s vysokým obsahom fosforu. Biosci Biotechnol Biochem 66: 1737-1739, 2002

15） Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr: AIN-93 purifikované diéty pre laboratórne hlodavce: Záverečná správa Amerického inštitútu pre výživu ad hoc písania o preformulovaní AIN-76diéty pre hlodavce . J Nutr 123: 1939-1951, 1993

16）Gimblet EG, Marney AF, Bonsnes RW: Stanovenie vápnika a horčíka v sére, moči, strave a stolici pomocou atómovej absorpčnej spektrofotometrie. Clin Chem 13: 204-214, 1967

17）Gomori G: Modifikácia kolorimetrického stanovenia fosforu na použitie s fotoelektrickým kolorimetrom. J Lab Clin Med 27: 955-960, 1942

18) Ming LG, Lv X, Ma XN, Ge BF, Zhen P, Song P, Zhou J, Ma HP, Xian CJ, Chen KM: Prenylová skupina prispieva k aktivitám fytoestrogénu 8-prenynaringenínu pri zlepšovaní tvorby kostí a inhibíciu kostnej resorpcie in vitro. Endokrinológia 154: 1202-1214, 2013

19）Kreke MR, Huckle WR, Goldstein AS: Prietok tekutín stimuluje expresiu osteopontínu a kostného sialoproteínu stromálnymi bunkami kostnej drene v časovo závislých podmienkach. Kosť 36: 1047-1055, 2005

20）Drechsler J, Grotzinger J, Hermanns HM: Charakterizácia potkanieho onkostatínového M receptorového komplexu, ktorý sa podobá ľudskému, ale líši sa od myšacieho cytokínového receptora. PLoS One 7: e43155, 2012

21）Hoek AC, Lemmens AG, Mullink JWMA, Beynen AC: Vplyv pomeru vápnika: fosforu v potrave na vylučovanie minerálov a nefrokalcinózu u samíc potkanov. J Nutr 118: 1210-1216, 1988 

22) Kohri K, Suzuki Y, Yoshida K, Yamamoto K, Amasaki N, Yamate T, Umekawa T, Iguchi M, Shinohara H, Kurita T: Molekulárne klonovanie a sekvenovanie cDNA kódujúcej proteín močového kameňa, ktorý je identický s osteopontínom. Biochem Biophys Res Commun 184: 859-864, 1992

23）Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, Nagata T, Yoshioka K, Iguchi M, Yamate T, Umekawa T, Suzuki Y, Shinohara H, Kurita T: Štruktúra a expresia mRNA kódujúcej proteín močového kameňa (Osteopontín). J Biol Chem 268: 15180-15184, 1993

24）Paloian NJ, Leaf EM, Giachelli CM: Osteopontínové protesty proti nefrokalcinóze vyvolanej vysokými fosfátmi a vaskulárnej kalcifikácii. Kidney Int 89: 1027-1036, 2016

25）Giachelli CM, Bae N, Almeida M, Denhardt DT, Alpers CE, Schwartz SM: Osteopontín je zvýšený počas tvorby neointimy v artériách potkanov a je novou zložkou ľudských aterosklerotických plakov. J Clin Invest 92: 1686-1696, 1993