Tandemová hmotnostná spektrometria s vysokým rozlíšením identifikuje konkrétny gangliozidový vzor u včasného diabetického obličkového ochorenia u pacientov s diabetes mellitus 2. typu Ⅱ

2.2. Podrobná štrukturálna analýza polysialylovaných druhov spojených s makroalbuminúriou pomocou HCD MS/MS

Skríning HR-MS ukázal, že gangliozid makroalbuminurických pacientov je charakterizovaný zvýšeným celkovým obsahom kyseliny sialovej. Nie menej ako štyri pentasialo gangliotetraózy triedy GQ1 boli identifikované vo vzorke A3 s vysokou presnosťou hmotnosti. Ión pri m/z 812,7{{1{19}}}}68, detegovaný len v skríningovom hmotnostnom spektre A3, bol podľa hmotnostného výpočtu priradený trojnásobne deprotonovanému a sodíkovanému GQ1(d18:1/18 :0). Aby sme podrobne štrukturálne charakterizovali tento druh spojený s makroalbuminúriou, izolovali sme ión pri m/z 812,7068 a predložili sme ho HCD MS/MS pri HR v negatívnom iónovom režime. Cieľmi tohto tandemového MS experimentu boli: (i) skúmanie štruktúry oligosacharidového reťazca; (ii) potvrdenie zloženia ceramidu, ktoré bolo predpokladané vzhľadom na hmotnosť celých molekúl GQ1; (iii) zber špecifických údajov o lokalizácii monosacharidov Neu5Ac pozdĺž oligosacharidovej kostry, čo vedie k rozlišovaniu izomérov od piatich najbežnejších štruktúr GQ1 (d18:1/18:0) (obrázok 3), ktoré môžu byť prítomné v moči makroalbuminurických pacientov.

Je znázornené fragmentačné spektrum prekurzorového iónu [M-4H+Na]3- detegovaného pri m/z 812,7068, vytvoreného kombináciou TIC získaného počas dvoch minút pri premenlivej kolíznej energii v rozsahu 30–80 eV. na obrázku 4.

Obrázok 3. Päť najbežnejších izomérov GQ1(d18:1/18:0): (A) izomér GQ1a(d18:1/18:{{10}}); (B) GQ1b(d18:1/18:{{20}}) izomér; (C) GQ1c(d18:1/18:0)izomér; (D) izomér GQ1d(d18:1/18:0); (E) GQ1e(d18:1/18:0) izomér.

Podporná služba Wecistanche - Najväčší vývozca cistanche v Číne:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Nakupujte pre ďalšie špecifikácie Podrobnosti:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIKNITE SEM A ZÍSKAJTE PRÍRODNÝ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 25 % ECHINAKOZIDU A 9 % AKTEOZIDU NA INFEKCIU OBLIČIEK

Údaje MS/MS potvrdzujú (d18:1/18:0) zloženie ceramidu pomocou Y0 pri m/z 564,8704 a Y1 pri m/z 726,5845 čo zodpovedá Glc-Cer sekvencii, ako aj vnútornému štiepnemu iónu, S, pri m/z 325,1828 zodpovedajúcej C18:0 mastnej kyseline (obrázok 5). Podobne je tiež zdokumentovaný celkový stav sialylácie molekuly. Preto ión B1 detegovaný pri m/z 290,0868 a jeho sodíkovaný náprotivok pri m/z 312,0686, čo zodpovedá oddeleniu jedného zvyšku Neu5Ac od materského iónu, spolu s distálnym prvkom detegovaným pri m/z 581,1807 a m/z 603,16262 potvrďte výskyt väzby Neu5Ac-Neu5Ac.

Obrázok 5. Schéma fragmentácie pomocou HCD MS/MS prekurzora [M-4H++Na+] 3- pri m/z 812,7068 a sekvenčných iónov diagnostiky pre štruktúrny izomér GQ1d.

Vzhľadom na najbežnejšiu polohu spojenia zvyškov Neu5Ac buď na vnútornej alebo vonkajšej Gal, existuje päť možných štrukturálnych kandidátov pre GQ1(d18:1/18:0), ako je znázornené na obrázku 3. Avšak ión na m/z 1032,3662 tvorený dvojitou väzbou a vnútornými krížovými kruhovými štiepeniami a priradený k Z4 /Y0/2,4A2 spolu s iónom detekovaným pri m/z 936,7894 ako Y2 / 3,5A1, podporuje pripojenie všetkých štyroch zvyškov Neu5Ac k vnútornej Gal. Hoci výskyt iných štruktúrnych izomérov nemožno úplne vylúčiť, tieto dva fragmentové ióny demonštrujú, že štruktúrny motív je v súlade s kandidátom (D), ktorý zodpovedá d izoméru GQ1(d18:1/18:0) , je určite prítomný vo vzorke A3. Schéma na obrázku 5 znázorňuje dráhu fragmentácie, ktorú prežíva prekurzorový ión zodpovedajúci GQ1d(d18:1/18:0).

Ďalším polysialickým kandidátom asociovaným s makroalbuminúriou na podrobnú štrukturálnu analýzu je ión [M-3H+] 3- zistený výlučne v skríningovom hmotnostnom spektre vzorky A3 pri m/z 708,3379 a priradený, na základe presného výpočtu hmotnosti na GT1(d18:1/18:0). Tento ión bol izolovaný a podrobený fragmentačnej analýze tandemovou MS s použitím HCD. Spektrum iónov produktu vytvorené súčtom skenov získaných počas 2 minút pri premenlivých kolíziových energiách medzi 30 a 80 eV je uvedené na obrázku 6 spolu s chemickou štruktúrou tohto druhu a priradením hlavných signálov. Fragmentačný mechanizmus za použitých MS/MS podmienok spolu s diagnostickými fragmentovými iónmi je znázornený na obrázku 7. Na zlepšenie viditeľnosti všetkých priradených produktových iónov tabuľka 3 dopĺňa zoznam identifikovaných signálov v spektre prezentovanom na obrázku 6.

Obrázok 6. Štrukturálna analýza pomocou (−) nanoESI HR HCD MS/MS prekurzorového iónu [M-3H+] 3− detekovaného vo vzorke A3 pri m/z 70 8,3379, čo podľa na výpočet hmotnosti zodpovedá GT1(d18:1/18:0). Čas akvizície: 2 min; premenlivé kolízne energie v rozmedzí 30–80 eV. Vložka: štruktúra izoméru GT1b(d18:1/18:0) odvodená z údajov MS/MS.

Fragmentácia HCD viedla k vzniku niekoľkých sekvenčných iónov, ktoré sa vyskytli ako výsledok glykozidických väzieb a krížového štiepenia kruhov. Tieto ióny sú veľmi užitočné na priradenie celej sacharidovej sekvencie s identifikáciou pozičných izomérov GT1 a na potvrdenie zloženia ceramidového aglykónu.

Typ ceramidu d18:1/18:0 je odhalený iónom Y0 pri m/z 564,5353 a podporovaný sekvenciou Glc-Cer identifikovanou prostredníctvom Y1 pri m/z 726,5879. Okrem toho priradenie iónov dokazuje prítomnosť izoformy GT1. Ión pri m/z 493,1669 so zložením NeuAc-GalNAc sa môže vyskytovať výlučne z GT1, ktorý je charakterizovaný sialyláciou zvyšku GalNAc. Zvyšok fragmentových iónov naznačuje existenciu štruktúrneho izoméru GT1b vo vzorke A3. Štruktúra GT1b je podporovaná všetkými iónmi vznikajúcimi z neredukujúceho konca molekuly, dokumentovaným sériou typu Y, sprevádzaná dvoma iónmi Z, z ktorých jeden sa vyskytuje v menšom množstve (obrázok 6). Avšak Y2 /B2 detegovaný ako ión s pomerne veľkým množstvom pri m/z 888,6405 poskytuje dôkaz o sekvencii Gal-Glc-Cer, pravdepodobne pochádzajúcej buď z GT1a alebo GT1b izoméru po príslušnej desialylácii buď Neu5Ac alebo Neu5Ac-Neu5Ac oddelením od vnútornej Gal alebo z izoméru obsahujúceho nesubstituovanú vnútornú Gal, ako je GT1d.

Na druhej strane, Y2 detegovaný pri m/z 734,5701 dokazuje disialovú lokalizáciu prvku Neu5AcNeu5Ac vo vnútornej Gal, čo je konfigurácia konzistentná s izomérom GT1b. Prítomnosť distálnej skupiny je doložená aj iónom B2 pri m/z 581,1828.

V HCD MS/MS niekoľko signálov súvisí s čiastočnou desialyláciou molekuly, ako sú ióny Y4 a/alebo Y3 zodpovedajúce desialyzovanej sekvencii Gg4Cer; tieto ióny však nemôžu indikovať miesta pripojenia Neu5Ac na neutrálnom Gg4 glykánovom jadre. Okrem toho signál pri m/z 364,1243 zodpovedajúci sekvencii Gal-GalNAc priradenej k iónu B3/B1 vnútorného štiepenia GT1b možno pripísať izoméru GT1c, pretože táto glykoforma obsahuje nesubstituovaný koncový disacharid Gal-GalNAc. Preto, s výnimkou Y2, ktorý je spojený s GT1b, by všetky ióny mohli pochádzať z iných pozičných izomérov Neu5Ac, ako sú GT1a, GT1, GT1c alebo dokonca zriedkavo uvádzaný GT1d. Na druhej strane, samotný Y2 by mohol byť výsledkom udalosti s nízkou pravdepodobnosťou, ktorá tiež eliminovala Neu5Ac z elementu trials spojeného s vnútorným Gal.

Vzhľadom na to, že s výnimkou zverejnenia GT1 neboli údaje MS / MS súvisiace so štiepením glykozidických väzieb schopné jednoznačne priradiť ďalšie izoméry GT1 v zmesi A3, dôkladnejšie sme analyzovali ióny štiepenia kruhu, aby sme objavili možnú vnútornú fragmentáciu podporujúcu GT1b. Všimli sme si trojnásobne nabitý ión s nízkou intenzitou pri m/z 634,6067, čo je v súlade s 0,2 typom krížového štiepenia kruhu na jednom z koncových zvyškov kyseliny sialovej, ktorý v v prípade druhov GT1b sa môže vyskytovať buď z 0, 2X4 alebo 0,2X3 alebo oboch. Pretože izomér GT1b je všeobecne bežnejší ako GT1, obrázky 6 a 7 predstavujú priradenie iónov a schému fragmentácie špecifickú pre GT1b.

Vzhľadom na symetriu reťazca Gal-GalNAc-Gal nie je možné úplne vylúčiť iné štruktúrne izoméry. Hoci údaje HCD MS/MS preukazujú existenciu GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) a GT1b(d18:1/18: 0) vo vzorke A3 nemožno vylúčiť možný výskyt iných izomérov GQ1 a GT1. Naše zistenia však naznačujú, že tri izoméry – GQ1d(d18:1/18:0), GT1b(d18:1/18:{{30}}) a GT1 (d18:1 /18:0) sú určite prítomné vo vzorke A3 a možno ich ďalej študovať ako molekulárne markery makroalbuminúrie.

3. Materiály a metódy

3.1. Kritériá registrácie predmetov

S cieľom vyvinúť a overiť túto metódu bola v prierezovej pilotnej štúdii hodnotená skríningová kohorta pacientov s DM 2. typu a zdravých kontrolných subjektov. Celkovo 30 pacientov s DM 2. typu navštevujúcich ambulanciu nefrológie a ambulanciu diabetu a metabolických chorôb bolo rozdelených do 3 skupín podľamočový albumín/pomer kreatinínu(UACR) takto: 10 pacientov s normoalbuminúriou (A1, definovaná ako UACR < 30 mg/g), 10 s mikroalbuminúriou (A2, UACR 30–300 mg/g) a 10 s makroalbuminúriou (A3, UACR > 300 mg/g g). Do tejto štúdie bolo zaradených aj desať vekovo a rodovo zodpovedajúcich zdravých kontrolných subjektov (C) navštevujúcich ordináciu praktického lekára bez známej anamnézy renálnych ochorení a bez DM (vylúčené s hodnotou HbA1c menšou alebo rovnou 5,6 %). štúdium

Všetci pacienti zaradení do štúdie mali minimálne 5-ročné trvanie DM, stabilnú funkciu obličiek aspoň 2 roky, dobrú kontrolu krvného tlaku (<130/80 mmHg), negative urinary sediment, and a negative urine culture. The exclusion criteria were represented by other causes of proteinuria (other glomerular diseases, neoplasia, or autoimmune diseases), hematuria, poor control of DM (HbA1c > 10%), liver diseases, and pregnant or lactating women. The patients had no indication for biopsia obličiek(nedostatok hematúrie a iných príčin proteinúrie, bez rýchleho poklesu GFR).

3.2. Etické vyhlásenie

Štúdia bola vykonaná v súlade s Helsinskou deklaráciou a protokol bol schválený Etickou komisiou pre výskum inštitúcie (Board of Human Studies-"Victor Babes" University of Medicine and Pharmacy Timisoara, Nr. 15/12.09.2016 Krajská pohotovostná nemocnica, číslo 100/23.11.2016). Všetci pacienti a kontroly súhlasili s účasťou na štúdii podpísaním informovaného súhlasu.

3.3. Laboratórne hodnotenia

Gangliozid v moči u 30 pacientov s DM 2. typu sa skúmal v prierezovej pilotnej štúdii porovnávacím testom s 10 zdravými kontrolami. Biochemické parametre sa týkali močoviny a kreatinínu v sére, 24-hodinovej proteinúrie, UACR, sedimentu v moči a kultivácie moču. Všetci pacienti boli negatívni na infekcie močových ciest. Zloženie natívnych gangliozidových zmesí sa detegovalo z 24-hodinových vzoriek moču. Vzorky moču pacientov a kontrol boli krátkodobo skladované pri -20 ◦C a rozmrazené pred testom.CKDbola definovaná podľa smernice KDIGO pre hodnotenie amanažment chronického ochorenia obličiek. eGFR sa vypočítal pomocouchronické ochorenie obličiekvzorec rovnice spolupráce epidemiológie (CKD-EPI kreatinín 2009 rovnica) [16].

3.4. Extrakcia a čistenie gangliozidov

Pri extrakcii gangliozidu sa postupovalo podľa metódy vyvinutej Svennerholmom a Fredmanom [17] a modifikovanej Vukeli´com et al. [18]. Tento protokol sme predtým upravili na extrakciu a purifikáciu gangliozidov z telesných tekutín a aplikovali sme ho na gangliozidy mozgovomiechového moku (CSF). Metóda je podrobne opísaná v našej predchádzajúcej štúdii týkajúcej sa profilovania a fragmentačnej analýzy gangliozidov CSF pomocou hmotnostnej spektrometrie [19]. Stručne, lipidy sa extrahovali dvakrát s použitím zmesi chloroform (C)/metanol (M)/voda (W) na celkový objemový pomer 1:2:0,75 C/M/W, pričom „W“ zodpovedá do moču; preto zmes obsahovala 4 ml C, 8 ml M a 3 ml vzorky moču. Chloroform a metanol analytickej kvality boli zakúpené od spoločnosti Merck (Darmstadt, Nemecko) a použité bez ďalšieho čistenia. Po úplnom oddelení fáz podľa postupov opísaných v [19] sa zhromaždila horná fáza obsahujúca polárne glykosfingolipidy.

Purifikácia zozbieraných surových gangliozidov bola dosiahnutá v niekoľkých krokoch [19]: odstránením vyzrážaných komplexov proteín-soľ s následnou centrifugáciou, gélovou filtráciou na kolóne Sephadex G-25 (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, USA ), aby sa odstránili nízkomolekulárne kontaminanty, a nakoniec dialýza cez noc pri 4 ◦C proti vode. Gangliozidy sa extrahovali za rovnakých podmienok zo všetkých alikvótov moču, čím sa získali zmesi A1 (normoalbuminúria), A2 (mikroalbuminúria), A3 (makroalbuminúria) a C (kontrola).

3.5. Príprava vzorky pre hmotnostnú spektrometriu

Vyčistené gangliozidové extrakty Al, A2, A3 a C sa odparili do úplného sucha v systéme SpeedVac Concentrator SPD 111 V (Savant, Düsseldorf, Nemecko) spojenom s vákuovou pumpou. Na skríning MS sa každý suchý extrakt rozpustil v čistom metanole, aby sa vytvoril zásobný roztok a skladoval sa pri -20 °C. Pred MS analýzou sa zásobné roztoky centrifugovali v modelovej centrifúge Sigma 2–16 (Sartorius AG, Göttingen, Nemecko). Pre infúziu Orbitrap MS sa pracovné vzorky s koncentráciou 5 pmol·ul −1 v čistom metanole získali zriedením alikvótov zo zásobného roztoku. Koncentrácia gangliozidu v infúznom roztoku bola vypočítaná pre priemernú molekulovú hmotnosť 2000 g mol-1.

3.6. Hmotnostná spektrometria Orbitrap s nanoESI

MS experimenty sa uskutočnili na hmotnostnom spektrometri LTQ Orbitrap Velos Pro™ (Thermo Fisher Scientific, Brémy, Nemecko) vybavenom offline nanoES zdrojom ES 259 ​​(Thermo Fisher, Brémy, Nemecko).

Prístroj je hybridný hmotnostný spektrometer, ktorý kombinuje dva rôzne typy hmotnostných analyzátorov a poskytuje množstvo výhod: vysoká citlivosť a presnosť, dobrá kvalita údajov a rýchlosť analýzy, potenciál detekcie minoritných zložiek v zložitých zmesiach, nízka spotreba vzorky, a vyhnutie sa krížovému vyšetreniu a prenosu zo vzorky na vzorku.

Prvý analyzátor je dvojtlakový lineárny kvadrupólový iónový lapač schopný izolovať ión so špecifickým pomerom hmotnosti k náboju (m/z) a aktivovať ho vložením kinetickej energie do iónu so špecifickým m/z v poradí spôsobiť kolíziou vyvolanú disociáciu. Druhým analyzátorom je Orbitrap, ktorý pozostáva z valcovej vonkajšej elektródy a valcovej vnútornej elektródy, ktorá zachytáva ióny na kruhových dráhach okolo vnútornej elektródy. Má vynikajúcu rozlišovaciu schopnosť a ponúka možnosť sekvenovania komplexných iónových druhov vo viacstupňových MS (MSn ) experimentoch účinnými fragmentačnými technikami.

Borosilikátové kapiláry (10 cm dlhé) boli vytiahnuté pomocou Sutter p-97 mikropipetového sťahovača, aby sa vytvorili elektrosprejové kapiláry s veľkosťou hrotu 10 µm a dĺžkami kužeľa 4 mm. Objem 10 ul roztoku s koncentráciou 5 pmol·ul -1 v metanole sa zaviedol do zadnej časti žiariča a do roztoku sa vložil 0,25 mm platinový drôt. Hodnoty potenciálu aplikované na platinový drôt a kužeľ boli trvalo nastavené, aby sa dosiahla účinná ionizácia komponentov. Proces nanoESI bol zahájený nastavením inštrumentálnych parametrov nasledovne: napätie nanoESI, 0,80 kV; kužeľové napätie, 40–60 V; desolvatačná teplota, 80 ◦C; RF úroveň objektívu S, 60 %. Tieto hodnoty parametrov MS zosilnili ionizáciu a stály sprej a súčasne minimalizovali fragmentáciu labilného Neu5Ac zvyšku pripojeného k oligosacharidovému jadru gangliozidovej molekuly v zdroji.

Všetky hmotnostné spektrá (MS a tandemová MS) boli získané v režime HR, detekcii v režime negatívnych iónov a v rozsahu 200–2000 m/z. MS skeny boli získané s rozlíšením nastaveným na 60 000. Hmotnostný spektrometer bol prevádzkovaný a riadený LTQ Tune Plus v2.7 (Thermo Scientific, Brémy, Nemecko) a MS získavanie a spracovanie údajov sa dosiahlo pomocou softvéru Xcalibur 3.0.63 (Thermo Scientific, Brémy, Nemecko).

Experimenty MS/MS sa uskutočnili v LTQ pomocou CID v kolíznej bunke s použitím hélia 5.0 čistoty pri tlaku 50 psi ako kolízneho plynu. Skeny MS/MS boli získané s rozlíšením nastaveným na 20,000. Selekcia iónov a fragmentácia sa uskutočňovali manuálne. Prekurzorové ióny boli vybrané v rámci šírky izolácie 1 m/z jednotky a fragmentované pomocou HCD s použitím variabilných kolízií v rozsahu 30–80 eV, aby sa zvýšilo pokrytie fragmentových iónov.

TIC a hmotnostné spektrá odvodené kombináciou akumulovaných skenov boli spracované pomocou softvéru Xcalibur 2.1 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), ktorý umožňuje extrakciu spektier, ako aj ich vyhladzovanie a odčítanie.

Pred experimentmi bola stupnica m/z externe kalibrovaná pomocou špecializovanej referenčnej látky komerčne známej ako roztok negatívnych iónov Pierce® ESI od Thermo Scientific (Waltham, MA, USA). V režime záporných iónov tento štandard poskytoval spektrum s primeraným iónovým pokrytím v rozsahu m/z naskenované v MS aj tandemových MS experimentoch.

Na optimalizáciu podmienok nanoESI MS a MS/MS v režime negatívnych iónov, porovnanie a vyhodnotenie údajov sa merali nasledujúce štandardné gangliozidové frakcie, ktoré sú komerčne dostupné: GM1 (bovinný mozog); GD1a, GD1b, GT1b a GQ1b (bravčový mozog); a GM3 a GD3 (hovädzie mlieko) od Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, USA), ako aj celý gangliozidový extrakt z hovädzieho mozgu, komerčne známy ako zmes Cronassial, z Abano Terme (Padova, Taliansko).

3.7. Skratka Gangliosides

Pre priradenie gangliozidov bol aplikovaný abreviačný systém zavedený v roku 1980 Svenner-holmom [20] spolu s odporúčaniami z roku 1998 komisie IUPAC-IUB pre biochemickú nomenklatúru [21] takto:

LacCer-Gal 4Glc 1Cer; GM3-II3 - -Neu5Ac-LacCer; GD3-II3 - -(Neu5Ac)2-LacCer; GT3-II3 - -(Neu5Ac)3-LacCer; GM2-II3 - -Neu5Ac-Gg3Cer; GD2-II3 - -(Neu5Ac)2-Gg3Cer; GM1a alebo GM1-II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GalNAc-GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg5Cer; GD1a-IV3 - -Neu5Ac, II{48}}Neu5Ac-Gg4Cer; GD1b-II3 - -(Neu5Ac)2- Gg4Cer; GT1b-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -(Neu5Ac)2-Gg4Cer; GQ1b-IV3 - -(Neu5Ac)2, II3 - - (Neu5Ac)2-Gg4Cer; nLM1 alebo 30 -nLM1-IV3 - -Neu5Ac-nLc4Cer; LM1 alebo 30 -isoLM1-IV3 - - Neu5Ac-Lc4Cer; nLD1-disialo-nLc4Cer.

3.8. Interpretácia údajov MS

Pretože do dnešného dňa nie je k dispozícii žiadny vyhradený počítačový softvér, databázy alebo iné IT služby na pomoc pri interpretácii gangliozidového skríningu a tandemových hmotnostných spektier, v tejto štúdii boli zistené molekulárne ióny priradené k gangliozidovým druhom exaktným výpočtom hmotnosti a na základe informácií, ktoré sme predtým získali o tomto type glykosfingolipidu a známych dráhach biosyntézy. Pri interpretácii údajov MS a MS/MS a výpočtov hmotnosti nám pomáhal veľký inventár gangliozidových molekulárnych a fragmentových iónov, ktoré sme doteraz identifikovali a charakterizovali v rôznych ľudských tkanivách a tekutinách pomocou pokročilých MS prístupov. Tieto štruktúry predstavujú naše pôvodné databázy, ktoré boli zahrnuté v našich predtým publikovaných štúdiách [12,19,22–31]. Nové druhy uvedené v tejto práci dopĺňajú náš v súčasnosti existujúci gangliozidový záznam.

Priradenie iónov oligosacharidovej kostry sekvencie generovaných v HCD MS/MS sa riadilo všeobecne akceptovanou nomenklatúrou [24,25].

4. Závery

V tejto štúdii sme vyvinuli prístup založený na HR MS a tandemovej MS na stanovenie gangliozidu v DKD komparatívnym testom močových extraktov od normo, mikro- a makroalbuminurických pacientov, ako aj zdravých kontrol, uskutočnených v identickom roztoku a inštrumentálne podmienky. Konečným cieľom našej štúdie bolo určiť zmeny vyskytujúce sa v zložení a štruktúre renálnych gangliozidov exprimovaných v DKD oproti kontrolám a v rôznych štádiách ochorenia.

Vysoká citlivosť, reprodukovateľnosť, rozlíšenie a presnosť hmotnosti, ktorú poskytuje platforma MS optimalizovaná na tento účel, nám umožnila zistiť, že stupeň sialylácie exprimovaných druhov zrejme hrá dôležitú úlohu v progresii ochorenia, čo predstavuje marker DKD. dokonca aj v štádiu normoalbuminúrie u pacientov s DM 2. typu. Okrem toho pozorované modifikácie v zložení Cer ukazujú, že okrem glykánovej štruktúry môže byť lipidová skupina tiež považovaná za molekulárny odtlačok pre štádiá DKD.

V pokročilejšej fáze výskumu sa na štrukturálnu analýzu druhov s možnou úlohou biomarkerov použila MS/MS by HCD. V prípade vzorky A3 molekulárne ióny, o ktorých sa podľa hmotnostného výpočtu zistilo, že zodpovedajú GQ1(d18:1/18:0) a GT1(d18:1/18:{{1 0}}), v tomto poradí, boli izolované a podrobené fragmentácii v kolíznej bunke prístroja. Cieľom týchto experimentov bolo zhromaždiť informácie o podrobnej štruktúrnej konfigurácii molekuly. Optimalizované sekvenčné podmienky, najmä rozsah kolíznej energie a kolízny tlak plynu, vyvolali špecifické štiepenie glykozidických väzieb, čo viedlo k vytvoreniu fragmentových iónov detegovaných ako relevantné signály v tandemovom hmotnostnom spektre. Zistilo sa, že niekoľko iónov je diagnostických pre určité izoméry súvisiace s lokalizáciou skupín Neu5Ac v sacharidovom reťazci gangliozidovej molekuly. Na základe týchto štruktúrne informatívnych sekvenčných iónov sme zistili, že GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) a GT1b(d18:1/18: 0) izoméry sú prítomné vo vzorke A3 a sú spojené s makroalbuminúriou.

Získané výsledky si vyžadujú ďalšie overenie niektorých hypotéz v longitudinálnych štúdiách uskutočnených na väčších kohortách, aby sa dokázal vzťah kauzality medzi komplexnosťou gangliozidov zistených v močipacienti DKDa veľmi skoré postihnutie obličiek v priebehu DM 2. typu, dokonca aj v štádiu normoalbuminúrie. Domnievame sa však, že súčasné zistenia otvárajú výskumný smer k skúmaniu úlohy, ktorú v progresii ochorenia zohráva sialylácia, O-acetylácia a O-fukozylácia gangliozidov, ako aj ich modifikácie pomocou O-GalNAc a CH3COO-. Ďalším prínosom týchto výsledkov je možný vývoj postupov pre včasnú diagnostiku DKD na základe gangliozidového profilovania pomocou pokročilej hmotnostnej spektrometrie.

Referencie

1. Ghaderian, SB; Beladi-Mousavi, SS Úloha diabetes mellitus a hypertenzie pri chronickom ochorení obličiek.J. Ren. Inj. Predch.2014, 3, 109–110. [CrossRef] [PubMed] 

2. Johansen, KL; Chertow, GM; Foley, RN; Gilbertson, DT; Herzog, CA; Ishani, A.; Israni, AK; Ku, E.; Tamura, MK; Li, S. Výročná správa údajov o obličkách USA za rok 2020: Epidemiológia ochorenia obličiek v Spojených štátoch.Am. J. Kidney Dis.2021, 77, A7–A8. [CrossRef] [PubMed] 

3. Lin, YC; Chang, YH; Yang, SY; Wu, KD; Chu, TS Aktualizácia patofyziológie a manažmentu diabetickej obličkovej choroby.J. Med. Doc.2018, 117, 662–675. [CrossRef] [PubMed] 

4. Vallon, V.; Thomson, SC Renálna funkcia v modeloch diabetickej choroby: Tubulárny systém v patofyziológii diabetickej obličky.Annu. Physiol.2012, 74, 351–375. [CrossRef] 

5. Milas, O.; Gadalean, F.; Vlad, A.; Dumitrascu, V.; Velciov, S.; Gluhovschi, C.; Bob, F.; Popescu, R.; Ursoniu, S.; Jianu, DC; a kol. Prozápalové cytokíny sú spojené s poškodením podocytov a dysfunkciou proximálnych tubulov v ranom štádiu diabetickej obličkovej choroby u pacientov s diabetes mellitus 2. typu.J. Diab. Komplikované.2020, 34, 107479. [CrossRef] 

6. Petrica, L.; Ursoniu, S.; Gadalean, F.; Vlad, A.; Gluhovschi, G.; Dumitrascu, V.; Vlad, D.; Gluhovschi, C.; Velciov, S.; Bob, F.; a kol. Hladiny mRNA súvisiace s podocytmi v moči korelujú s dysfunkciou proximálneho tubulu pri včasnej diabetickej nefropatii diabetes mellitus 2.Diabetol. Metab. Syndr.2017, 9, 31–43. [CrossRef] 

7. Kwak, DH; Rho, YI; Kwon, OD; Ahan, SH; Song, JH; Choo, YK; Kim, SJ; Choi, BK; Jung, KY Zníženie gangliozidu GM3 v diabetických glomeruloch potkanov vyvolaných streptozocínom.Life Sci.2003, 72, 1997–2006. [CrossRef] 

8. Masson, E.; Troncy, L.; Ruggiero, D.; Wiernsperger, N.; Lagarde, M.; El Bawab, S. Gangliozidy série a sprostredkovávajú účinky konečných produktov pokročilej glykácie na proliferáciu pericytov a mezangiálnych buniek: spoločný mediátor retinálnej a renálnej mikroangiopatie?Diabetes2005, 54, 220–227. [CrossRef] 

9. Zador, Z.; Deshmukh, GD; Kunkel, R.; Radin, NS; Shayman, JA Úloha akumulácie glykosfingolipidov pri renálnej hypertrofii diabetes mellitus vyvolaného streptozocínom.J. Clin. Vyšetrovať.1993, 91, 797–803. [CrossRef]

10. Ene, CD; Penescu, M.; Anghel, A.; Neagu, M.; Budu, V.; Nicolae, I. Monitorovanie diabetickej nefropatie pomocou cirkulujúcich gangliozidov.J. Immunoass. Immunochem.2016, 37, 68–79. [CrossRef]