Ako polysacharid Cistanche znižuje melanogenézu a znižuje oxidačný stres?

Pre viac informácií kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

Polysacharid Cistanche deserticola indukuje melanogenézu v melanocytoch a znižuje oxidačný stres

1Katedra dermatológie, Tretia nemocnica Xiangya, Central South University, Changsha, Čína

2Urologická klinika, tretia nemocnica Xiangya, Central South University, Changsha, Čína

3Medicine Experimental Center, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Čína

Cistanchedeserticolamá veľa účinkov, kliknite sem a dozviete sa viac

Abstraktné: Ako hlavná súčasť porúch pigmentácie sú ochorenia depigmentácie kože, ako je vitiligo a achrómny névus, veľmi časté a teraz im venujeme väčšiu pozornosť. Patogenéza depigmentácie zahŕňa dysfunkciu a stratu melanocytov, ktoré sú pravdepodobne spôsobené dedičnosťou, autoimunitou a oxidačným stresom. Medzi nimi,oxidačný streshrá kľúčovú úlohu; len málo klinických liečebných postupov si však dokáže poradiť s oxidačným stresom. Ako bolo oznámené,Cistanchedeserticola polysacharid(CDP) je účinný antioxidant; na základe toho sme zhodnotili jeho úlohu v melanocytoch a ďalej odhalili mechanizmy. V tejto štúdii sme zistili, že CDP by mohol podporovať melanogenézu v ľudských epidermálnych melanocytoch (HEM) a myších melanómových B16F10 bunkách a tiež indukoval pigmentáciu u zebričiek. Okrem toho by CDP mohla aktivovať signálnu dráhu mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK), potom upregulovať expresiu transkripčného faktora spojeného s mikroftalmiou (MITF) a downstream génov TYR, TRP1, TRP2 a RAB27A. V opačnom prípade sme zistili, že CDP by mohol zmierniť H2O2-indukovanú cytotoxicitu a apoptózu v melanocytoch. Ďalšie dôkazy odhalili, že CDP môže zvýšiť antioxidačnú dráhu NRF2/HO{11}} a zachytávať intracelulárne ROS. Stručne povedané, CDP môže podporovať melanogenézu a predchádzať poškodeniu melanocytov oxidačným stresom, čo naznačuje, že CDP pomáha udržiavať normálny stav melanocytov. CDP teda môže byť novým liekom na liečbu depigmentačných ochorení.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ:

Cistanche deserticola polysacharid, depigmentačné ochorenie, melanocyt, melanogenéza, NRF2,oxidačný stres

1. ÚVOD

Ochorenia spojené s depigmentáciou kože, ako je vitiligo a achrómny névus, sú charakterizované nerovnomernou alebo rozsiahlou depigmentáciou kože.1 Hoci kožné lézie len zriedka spôsobujú vážne fyzické poškodenie, ovplyvňujú vzhľad pacienta a vytvárajú závažnú psychickú záťaž, dokonca aj poruchy duševného zdravia.2 hlavné patologické zmeny v depigmentácii zahŕňajú dysfunkciu a stratu melanocytov, čo výrazne ovplyvňuje syntézu a transport melanínu3, čo vedie k nedostatočnej akumulácii melanínu v koži.

Mechanizmy zapojené do depigmentácie sú v súčasnosti neznáme, ale štúdie identifikovali niektoré súvisiace faktory. Na jednej strane funkcia melanocytov čiastočne závisí od transkripčného faktora spojeného s mikroftalmiou (MITF), ktorý je dobre známy tým, že podporuje expresiu génov súvisiacich s melanogenézou vrátane tyrozinázy (TYR), proteínu súvisiaceho s tyrozinázou 1 (TRP1), súvisiaceho s tyrozinázou. proteín 2 (TRP2), ras-príbuzný proteín Rab-27a (RAB27A) a fascinujúci aktín viažuci proteín 1 (FSCN1).4 Spomedzi týchto génov hrá TYR kľúčovú úlohu v syntéze melanínu prostredníctvom oxidácie l-dopa na dopachinón.5 Na druhej strane štúdie naznačujú kombináciu niekoľkých faktorov, ktoré môžu byť zodpovedné za stratu melanocytov, vrátane dedičnosti, prostredia, autoimunity a oxidačného stresu.{17}} Spomedzi týchto faktorov sa za najdôležitejší považuje oxidačný stres .

Mechanizmyoxidačný stresspôsobujúce depigmentáciu boli čiastočne odhalené; Preťaženie reaktívnymi druhmi kyslíka (ROS) je jedným z kľúčových faktorov.10 Preťaženie ROS pri depigmentácii zahŕňa nerovnováhu medzi pro- a antioxidačnými systémami.11 Jedným z prvkov, ktoré sa podieľajú na tejto nerovnováhe, je jadrový faktor erytroidný 2- faktor 2/prvok antioxidačnej odozvy (NRF2/ARE) poškodenie antioxidačnej dráhy.12 Táto dráha pozostáva z NRF2 a antioxidačných enzýmov, ako je hemoxygenáza-1 (HMOX-1, HO-1) , kataláza (CAT), glutatiónperoxidáza 1 (GPX1) a NAD(P)H chinóndehydrogenáza 1 (NQO1).13 Keď sú melanocyty vystavené nadmernému ROS, NRF2 sa môže premiestniť do jadra a viazať sa na konzervované ARE, potom podporovať expresia antioxidačných enzýmov. Pri niektorých depigmentačných ochoreniach, ako je vitiligo, však poškodená antioxidačná dráha NRF2/ARE nemôže účinne vychytávať ROS.14 Klinické terapie bežne používané pri depigmentácii zahŕňajú lokálne alebo systémové kortikosteroidy, inhibítory kalcineurínu, úzkopásmové ultrafialové žiarenie B (NBUVB; 311 nm) , 308-nm excimerové svetlo, autológna epidermálna transplantácia a terapia tradičnej čínskej medicíny (TCM). Kortikosteroidy a inhibítory kalcineurínu môžu znížiť abnormálnu imunitnú aktiváciu15, zatiaľ čo fototerapia sa používa ako liečba prvej línie; najmä NBUVB stimuluje proliferáciu melanocytov a deštrukciu T-buniek,16 kým 308-nm excimerové svetlo indukuje apoptózu T-buniek.17 Okrem toho účinky terapií TCM súvisia s podporou melanogenézy.18 Do určitej miery tieto metódy sú užitočné na zlepšenie depigmentácie, ale kontrola progresie ochorenia zostáva náročná. Je potrebné vyvinúť nové terapie, najmä pri oxidačnom strese, ktorý bol predtým zanedbávaný.

Cistanche deserticolaje známy ako „púštny ženšen“.19 Jeho zložky sú užitočné pri etanolom indukovanom poškodení pečene a črevnej zápalovej hyperplázii; možno ho použiť aj ako činidlo proti únave, zápalu a nádoru.{5}} Nedávno Guo a kol.Cistanche deserticola polysacharid(CDP), jedna z jeho hlavných zložiek, mala antioxidačnú a hepatoprotektívnu aktivitu20; ďalšie dve štúdie identifikovali jeho úlohu pri ochrane buniek pred poškodením pri kyslíkovo-glukózovej deprivácii/reperfúzii a osteoporóze.23,24 Úloha CDP pri depigmentačných ochoreniach však nebola objasnená. Tu sme sa snažili potvrdiť, či CDP coxidačný stresOvplyvňuje melanogenézu a chráni melanocyty pred oxidačným stresom.

2.|MATERIÁL A METÓDY

2,1|Chemikálie a protilátky

Cistanche deserticolapolysacharid(CDP) a l-dopa boli zakúpené od Yuanye Biotec (čistota väčšia alebo rovná 98 percent; Shanghai, Čína). Peroxid vodíka (H2O2), dimetylsulfoxid (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimetyltiazol-2-yl-2,5-difenyltetrazóliumbromid ( MTT) a Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit boli zakúpené od Sigma-Aldrich. 4 percentá neutrálneho paraformaldehydu boli zakúpené od Biosharp (Hefei, Čína); a Immunofluorescence Stained Kit (Alexa Fluor 488) a 2,7-dichlórfluoresceín-diacetát (DCFH-DA) boli zakúpené od Beyotime Biotec (Shanghai, Čína). Fontana-Masson Stain Kit a Nucleoplasmic Protein Extraction Kit boli zakúpené od Sloarbio (Peking, Čína). Doplnok na rast ľudských melanocytov (HMGS), Dulbeccovo modifikované Eagle médium (DMEM) a médium 254 boli zakúpené od Gibco. Fetálne bovinné sérum (FBS) bolo zakúpené od BI (Kibbutz Beit-Haemek, Izrael). Primárne protilátky pre -aktín, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK,

p38, p-p38, NRF2 a HO-1 boli zakúpené od Cell Signaling Technology, primárna protilátka pre MITF bola zakúpená od St John's Laboratory, primárna protilátka pre p-MITF bola zakúpená od Affinity Biosciences, primárna protilátka pre GAPDH bola zakúpená od Bioworld a primárna protilátka pre TRP1 bola zakúpená od EMD Millipore.

2,2| Bunková kultúra a liečba

Bunky myšacieho melanómu B16F10 sa kultivovali v médiu DMEM doplnenom 10 percentami FBS a 1 percentom zmesi antibiotika penicilín-streptomycín. Ľudské epidermálne melanocyty (HEM) boli oddelené od ľudskej predkožky (pozri našu predchádzajúcu štúdiu25) a kultivované v médiu 254 doplnenom HMGS, 5 percentami FBS a 1 percentom zmesi antibiotika penicilín-streptomycín. Všetky bunky boli kultivované vo vlhkom inkubátore pri 37 stupňoch s 5 percentami CO2. CDP sa rozpustil v DMSO a zriedil

s médiom pred použitím bola konečná koncentrácia DMSO nižšia ako 0,1 percenta . H202 sa pred použitím zriedila médiom.

2,3|Kultivácia a liečba zebrafish

Embryá a médium zebrafish boli zakúpené od EzeRinka Biotech. Experimentálny protokol schválila Etická komisia Central South University. Zebričky boli kultivované v 12-jamkových platniach pri 37 stupňoch od svetla a ošetrené rôznymi koncentráciami CDP. Na denné pozorovanie a zaznamenávanie melanínov v hlavách a chvostoch zebričiek sa použil inverzný mikroskop. Po pozorovaní sme vymenili médium a znovu pridali CDP. Hustota melanínu v chvostoch zebrafish bola meraná pomocou obrázka J a hodnoty sú prezentované ako integrované optické hustoty (IOD).

2,4| Životaschopnosť buniek

Životaschopnosť buniek sa merala pomocou MTT testu. Na vyšetrenie cytotoxicity CDP sa bunky HEM a B16F10 implantovali do 96-jamkových platní v hustote 2 × 1{{30}}3 buniek/jamku a kultivovali sa, kým bunky boli pripevnené k platniam. Bunky sa potom ošetrili rôznymi koncentráciami (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 a 320 ug/ml) CDP počas 24, 48 alebo 72 hodín. Pred meraním sa do každej jamky pridalo 20 ul MTT a platne sa inkubovali pri 37 stupňoch počas 4 hodín. Potom sme odstránili supernatant a do každej jamky pridali 160 ul DMSO, aby sa rozpustili kryštály formazanu. Hodnota absorbancie pri 490 nm sa merala multimódovou čítačkou platní (PerkinElmer). Aby sa preskúmal účinok CDP v stave cytotoxicity vyvolanej H2O{24}}, bunky HEM a B16F10 sa naniesli na 96-jamkové platne v hustote 4 x 103 buniek/jamku. Bunky boli ošetrené rôznymi koncentráciami CDP (0, 20, 40 alebo 80 ug/ml) počas 24 hodín, kedy sme do každej jamky pridali H2O2 (konečné koncentrácie: 500 μm pre HEM a 1,0 mm pre bunky B16F10). a inkubovali bunky ďalších 24 hodín. Vytvorili sme skupiny liečené CDP a negatívne kontrolné (NC) skupiny. Kroky detekcie boli rovnaké, ako bolo opísané vyššie.

2,5|NaOH stanovenie obsahu melanínu

Bunky boli kultivované v {{0}}mm Petriho miskách a ošetrené CDP v rôznych koncentráciách (0, 20, 40 a 80 ug/ml) počas 48 hodín, potom štiepené trypsínom a zozbierané v 1. 5-ml skúmavky. Bunky sme dvakrát premyli dvakrát destilovanou vodou, resuspendovali sme ich v 1 ml etanolu a vortexovali, aby sa uvoľnil melanín. Potom sme zmes odstredili (200 g, 5 minút) a odstránili sme supernatant, do každej skúmavky sme pridali 1 ml 10 percentného DMSO (zriedeného 1 mm roztoku NaOH) a suspendovali sediment. Suspenziu sme inkubovali vo vodnom kúpeli pri 80 stupňoch počas 1 hodiny, aby sa rozpustil melanín. Nakoniec sme preniesli 200 μl kvapaliny na 96-jamkovú doštičku a použili sme multimódovú čítačku doštičiek na meranie hodnoty absorbancie pri 470 nm.

2,6|Merania aktivity tyrozinázy

Bunky boli kultivované v {{0}}mm Petriho miskách a pred meraním ošetrené CDP, štiepené trypsínom a zozbierané do 1,{2}}ml skúmaviek a dvakrát premyté fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS ). Premiestnili sme 106 buniek z každej vzorky do novej skúmavky a supernatant sme po centrifugácii zlikvidovali, potom sme pridali 1 ml 0,5 percenta Tritonu X-100 do bunkovej pelety a uskladnili zmes pri 0 stupňoch počas 15 minút. Potom sme pridali 1 ml l-dopa (1 mm, zriedený 0,1 M fosfátovým tlmivým roztokom) ako substrát a roztok sme premiešali, 200 μl zmesi sme presunuli na 96-jamkovú platňu okamžite a zmerali hodnotu absorbancie (A0) pri 475 nm pomocou multimódovej čítačky doštičiek, pričom meranie opakovali po 10 minútach (A10). Aktivita tyrozinázy bola vypočítaná pomocou (A10-A0)/105 a výsledky sú vyjadrené ako percento (percento) oproti negatívnej kontrole.

2,7| Farbenie melanínom Fontana-Masson

Bunky sa kultivovali v 12-jamkových doštičkách, kým sa nedosiahla 50-percentná hustota. Po ošetrení boli bunky fixované 4% neutrálnym paraformaldehydom počas 30 minút a premyté destilovanou vodou. Potom sme do každej jamky pridali 500 ul roztoku amoniaku a striebra Fontana a platne sme uložili v tme na 16 hodín, aby sa zafarbil melanín. Potom sme bunky päťkrát premyli destilovanou vodou (vždy 1 minútu) a namočili ich do 500 μl hyposulfitu na 5 minút; nakoniec sme odstránili hyposiričitan a bunky opäť oplachovali destilovanou vodou počas 1 minúty. Potom sme použili inverzný mikroskop na pozorovanie a zaznamenávanie melanínov.

2,8|Extrakcia RNA a kvantitatívna reverzná transkripcia-polymerázová reťazová reakcia

Bunky sa kultivovali v 6-jamkových platniach. Po ošetrení boli bunky štiepené trypsínom a zozbierané do 1,{2}}ml skúmaviek. Bunky sme dvakrát premyli PBS, potom sme pridali 1 ml lyzačného tlmivého roztoku, pretrepali zmes a umiestnili skúmavky na ľad na 5 minút, aby sa bunky úplne lyzovali. RNA bola extrahovaná pomocou súpravy Total RNA Kit (Omega Bio-Tek) a reverzne transkribovaná (RT) s použitím ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). Kvantitatívna reverzná transkripcia-polymerázová reťazová reakcia (PCR) sa uskutočnila s použitím KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). Reakčný objem RT zmesi bol 20 μl, zatiaľ čo reakčný objem PCR zmesi bol 20 μl (cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, primer F 1 μL, primer R 1 μL, pridajte DEPC H2O do 20 μL ). Experimenty sa uskutočňovali podľa protokolov. Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke S1.

2,9|Extrakcia proteínov a Western blotting / imunofluorescencia

Bunky sa kultivovali v 100- mm Petriho miskách. Po ošetrení boli bunky štiepené trypsínom a zozbierané do 1,{2}}ml skúmaviek. Bunky sme dvakrát premyli PBS, potom sme pridali 500 ul RIPA lyzačného pufra (Thermo Fisher) doplneného 1 mm fenylmetylsulfonylfluoridom (Thermo Fisher) a 1:100 zriedeným koktailom inhibítora fosfatázy (Roche). Jadrový a cytoplazmatický proteín sa extrahoval s použitím súpravy na extrakciu nukleoplazmatického proteínu podľa protokolu výrobcu. Skúmavky sme umiestnili na ľad na 30 minút a každých 5 minút sme ich vortexovali, aby sa bunky úplne lyzovali. Bunky sme odstredili (200 g, 4 stupne, 15 minút), premiestnili sme supernatant do novej skúmavky a zmerali sme koncentráciu celkového proteínu pomocou súpravy na testovanie proteínov BCA (KeyGEN Biotec). Proteíny sme povarili s 5x nakladacím pufrom (Beyotime Biotec, Čína) pri 100 stupňoch počas 10 minút, potom sme ich skladovali pri -80 stupňoch. Metóda elektroforézy na polyakrylamidovom géli (PAGE) sa použila pri Western blottingu a 20 ug proteínu z každej skupiny sa oddelilo a prenieslo na polyvinylidénfluoridovú membránu. Po blokovaní antigénu sme membránu inkubovali v primárnej protilátke zriedenej v pomere 1:1000 počas 16 hodín pri 4 stupňoch, potom sme membránu premyli PBST a inkubovali ju v 1:10 000 zriedenej fluorescenčnej sekundárnej protilátke počas 1 hodiny pri 37 stupňoch . Intenzita fluorescencie bola detegovaná pomocou Odyssey CLx Imaging System (LI-COR). Imunofluorescencia sa uskutočnila pomocou súpravy Immunofluorescence Stained Kit (Alexa Fluor

488) s primárnou protilátkou v riedení 1:100.

2,10|Meranie bunkovej apoptózy

Bunky boli kultivované v {{0}}mm Petriho miskách a ošetrené rôznymi koncentráciami (0, 20, 40 a 80 ug/ml) CDP počas 24 hodín a bol pridaný H2O2 ( konečné koncentrácie: 500 μm pre HEM, 1,0 mm pre bunky B16F10) do každej jamky a inkubované ďalších 24 hodín. Založili sme aj skupiny ošetrené CDP a skupiny NC. Po ošetrení sme bunky štiepili trypsínom bez EDTA a zhromaždili ich do skúmaviek, potom sme bunky dvakrát premyli PBS a resuspendovali ich v 100 ul PBS. Bunky boli zafarbené pomocou Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit podľa protokolu a detegované prietokovou cytometriou (FCM). Na analýzu rýchlosti apoptózy sa použil softvér FlowJo.

2.11| Intracelulárne meranie ROS

Bunky boli kultivované v {{0}}jamkových platniach a ošetrené rôznymi koncentráciami (0, 20, 40 a 80 ug/ml) CDP počas 24 hodín, ku ktorým sme pridali H2O2 (konečné koncentrácie: 500 μm pre HEM,

1.0 mm pre bunky B16F10) do každej jamky, inkubujte ich ďalšiu

24 hodín a nastavte skupiny ošetrené CDP a NC. Po ošetrení sme bunky dvakrát premyli PBS, aby sa odstránilo všetko médium a FBS, potom sme DCFH-DA sondu zriedili na 1:1000 médiom a pridali do každej jamky. Bunky sme inkubovali pri 37 stupňoch počas 30 minút a premyli sme ich trikrát médiom bez séra. Použili sme an

invertovaný fluorescenčný mikroskop na pozorovanie a zaznamenávanie fluorescencie, potom použil ImageJ na meranie intenzity fluorescencie.

2,12|Štatistiky a analýzy

Údaje v tejto práci sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka (SD) a štatistická analýza bola vykonaná pomocou GraphPad Prism (verzia 7.0) alebo SPSS (verzia 22.0) a Student's Na porovnanie viacerých skupín sa použil t-test alebo jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA). Šedá hodnota pásov proteínu WB bola štandardizovaná pomocou GAPDH alebo -aktínu. Hodnoty P < 0,05="" sa="" považovali="" za="" významné.="" všetky="" experimenty="" sa="" opakovali="" aspoň="">

3|VÝSLEDKY

3.1|CDP indukoval melanogenézu v HEM a B16F10 bunkách

Predtým, ako sme začali, použili sme test MTT na preskúmanie potenciálnej cytotoxicity CDP na HEM a bunky myšacieho melanómu B16F10. Bunky boli ošetrené CDP v rôznych koncentráciách počas 24, 48 alebo 72 hodín. Testovanie životaschopnosti HEM ukázalo, že keď boli koncentrácie nižšie ako 320 ug/ml, CDP nemal žiadny vplyv na životaschopnosť buniek; avšak životaschopnosť významne klesla, keď koncentrácia dosiahla 320 ug/ml po 24, 48 a 72 hodinách (P < 0,05;="" obrázok="" 1a).="" životaschopnosť="" buniek="" b16f10="" sa="" tiež="" znížila="" po="" 48="" a="" 72="" hodinách,="" keď="" cdp="" dosiahol="" 320="" ug/ml="" (p="">< 0,01),="" ale="" pri="" nižších="" koncentráciách="" nebola="" pozorovaná="" žiadna="" zmena="" (obrázok="" 1b).="" potom="" sme="" predbežne="" preskúmali="" úlohu="" cdp="" v="" melanogenéze="" a="" porovnali="" sme="" jeho="" účinky="" s="" účinkami="" hormónu="" stimulujúceho="" melanocyty="" (-msh;="" koncentrácie:="" 20,="" 100="" a="" 400="" nm)="" a="" dmso="" (0,1="" percenta)="" v="" hem.="" výsledky="" testov="" farbenia="" melanínu,="" aktivity="" tyrozinázy="" a="" obsahu="" melanínu="" naznačujú,="" že="" cdp="" bol="" porovnateľný="" s="" -msh="" na="" podporu="" melanogenézy,="" zatiaľ="" čo="" ošetrenie="" 0,1="" percenta="" dmso="" nespôsobilo="" žiadny="" rozdiel="" (obrázok="">

Podľa toho sme ďalej zdokonalili náš prieskum. HEM boli ošetrené CDP v rôznych koncentráciách (20, 40 a 80 ug/ml) počas 48 hodín; vykonali sa testy farbenia melanínu, obsahu melanínu a aktivity tyrozinázy a všetky vykazovali významné zvýšenie po liečbe CDP spôsobom závislým od koncentrácie, ktorý vrcholil v skupine s 80 ug/ml (P < 0,05,="" obrázok="" 2a-c)="" .="" potom="" sme="" zmerali="" hladiny="" mrna="" a="" proteínov="" génov="" súvisiacich="" s="" melanogenézou="" (mitf,="" tyr,="" trp1,="" trp2,="" rab27a="" a="" fscn1).="" cdp="" významne="" zvýšilo="" hladiny="" mrna="" týchto="" génov="" v="" hem="" (p="">< 0,05;="" obrázok="" s2a).="" okrem="" toho="" sa="" zvýšili="" hladiny="" proteínov="" mitf,="" tyr,="" trp1="" a="" rab27a,="" rovnako="" ako="" pomer="" fosforylovaného="" mitf="" k="" celkovému="" mitf="" (p="">< 0,05),="" zatiaľ="" čo="" trp2="" a="" fscn1="" nevykazovali="" žiadny="" rozdiel="" (obrázok="" 2d,="" e).="" výsledky="" ukázali,="" že="" cdp="" môže="" podporovať="" melanogenézu="" a="" up-regulovať="" expresiu="" génov="" súvisiacich="" s="" melanogenézou="" v="" ľudských="">

Ďalej sme znovu overili účinky CDP s bunkami B16F10 a zistili sme, že obsah melanínu v bunkách B16F10 sa významne zvýšil (P < 0,01;="" obrázok="" s2b).="" okrem="" toho="" cdp="">

3,2|CDP podporoval melanogenézu u zebričiek

Skúmať, či by CDP mohla propagovaťmelanogenézain vivo sme použili embryá zebričiek. Embryá zebrafish boli rozdelené do štyroch skupín a kontinuálne ošetrené samotným médiom (NC) alebo CDP v rôznych koncentráciách (20, 40 a 80 ug/ml); hustota a distribúcia melanínových granúl sa pozorovala a zaznamenávala každý deň. Ako embryá zebričiek rástli, zistili sme, že hustota melanínu sa postupne zvyšuje v hlavách a chvostoch. Na 3. deň boli rozdiely medzi skupinami rozlíšiteľné a rozdiel sa ďalej zväčšoval, až kým sme neukončili experiment na 6. deň (obrázok 3A). Použili sme obrázok J na meranie hustoty melanínu v chvostoch zebričiek; hustota melanínu v skupinách liečených CDP bola významne vyššia ako v kontrolnej skupine (P < 0,05;="" obrázok="">

3,3|CDP aktivovaná signálna dráha MAPK v bunkách HEM a B16F10

Odhaliť mechanizmy, ktorými sa CDP propagovalomelanogenézaliečili sme HEM s CDP v rôznych koncentráciách (20, 40 a

80 ug/ml) počas 48 hodín a potom skúmali fosforylované a celkové hladiny proteínov ERK, JNK a p38 v signálnej dráhe MAPK. Ako bolo merané Western blotovaním, hladiny p-ERK, p-JNK a p-p38 sa zvýšili po ošetrení CDP (P < 0,05),="" zatiaľ="" čo="" ich="" celkové="" hladiny="" sa="" nezmenili="" (obrázok="" 4a,="" b).="" experimenty="" sa="" opakovali="" s="" bunkami="" b16f10="" a="" fosforylované="" hladiny="" proteínov="" erk,="" jnk="" a="" p38="" sa="" zvýšili="" (p="">< 0,05),="" ale="" celkové="" hladiny="" mapk="" sa="" nezmenili="" (obrázok="" 4c,="" d),="" čo="" je="" v="" súlade="" s="" výsledkami="" v="" hem.="">

3,4|CDP zoslabená H2O2-indukovaná

cytotoxicitu a apoptózu v bunkách HEM a B16F10

Na simuláciu sme použili H2O2oxidačný stresprostredí a ďalej skúmal úlohu CDP v melanocytoch podoxidačný stres. Konečná koncentrácia H2O2 použitá v HEM bola 500 μm, zatiaľ čo v bunkách B16F10 bola 1,0 mm. Na preskúmanie účinku CDP na H2O2-indukovanú cytotoxicitu sme HEM a B16F10 bunky vopred ošetrili CDP v rôznych koncentráciách (20, 40 a 80 ug/ml) počas 24 hodín, potom sme pridali H2O2 a pokračovali v ich liečbe. 24 hodín pred vykonaním pozorovania a testu MTT.

H2O2 spôsobila zjavné pľuzgiere membrány a zmršťovanie buniek v HEM, v skupinách vopred ošetrených CDP sa situácia zmiernila. Liečba samotným CDP nemala žiadny účinok (obrázok 5A). Test MTT ukázal podobný výsledok v tom, že liečba H2O2 znížila životaschopnosť HEM, zatiaľ čo CDP výrazne zlepšila tento škodlivý vplyv

3,5|CDP vychytáva H2O2-indukované intracelulárne ROS v HEM a bunkách B16F10

Aby sme preskúmali mechanizmy CDP na zníženie cytotoxicity a apoptózy indukovanej H2O{1}}, ďalej sme detegovali intracelulárne ROS v bunkách HEM a B16F10 pomocou fluorescencie DCFH-DA

4|DISKUSIA A ZÁVERY

V tejto štúdii sme skúmali úlohu CDP v bunkách HEM a B16F10. Prvýkrát sme zistili, že CDP môže propagovaťmelanogenézav melanocytoch a podporujú pigmentáciu u zebričiek. Následný experiment ukázal, že signálna dráha MAPK bola aktivovaná pri liečbe CDP. Ďalej sme skúmali jeho úlohu voxidačný stresa zistili, že CDP môže zmierniť H2O2- indukovanú cytotoxicitu a apoptózu v melanocytoch; medzitým by CDP mohla aktivovať antioxidačnú dráhu NRF2/HO-1 a zachytávať vnútrobunkové ROS podoxidačný strespodmienky.

Mitogénom aktivovaná proteínkináza je životne dôležitá dráha zapojená do regulácie MITF, kľúčového transkripčného faktora, ktorý podporuje expresiumelanogenézapríbuzných génov a následne ovplyvňuje syntézu a transport melanínu.26,27 V našej štúdii sa ak- aktivácia ERK, JNK a p38 v melanocytoch významne zvýšila po liečbe CDP; medzitým výrazy MITF/p-MITF a TYR, TRP1, TRP2 a RAB27A riadené MITF

boli primerane upravené. Preto navrhujeme, aby CDP mohol

propagovaťmelanogenézaprostredníctvom aktivácie dráhy MAPK, ale ako CDP aktivuje MAPK, zostáva neznáme. Podľa nedávnych štúdií je toll-like receptor 4 (TLR4) vysoko exprimovaný v melanocytoch a podieľa sa na melanogenéze.28,29 TLR4 je dôležitý transmembránový proteín, ktorý môže špecificky viazať lipopolysacharid (LPS)30; štúdie uvádzajú, že LPS môže indukovať melanogenézu.29 Zaujímavé je, že niekoľkopolysacharidyextrahované z rastlín alebo húb údajne aktivovali TLR a downstream signálne dráhy, ako je MAPK a jadrový faktor kappa beta (NF-κB).31,32 Preto máme podozrenie, že CDP môže byť rozpoznaný a viazaný TLR, potom aktivuje downstream signál MAPK- ling cestu a podporujemelanogenéza. Okrem toho je známe, že nukleotidové väzbové oligomerizačné receptory podobné doménam (NLR) rozpoznávajú intracelulárne ligandy a riadia aktiváciu signálnych dráh MAPK a NF-κB.33,34 Ako bolo uvedené, polysacharidy extrahované z Ganoderma lucidum a Astragalus môžu vstúpiť do buniek a ovplyvňujú NLR.35,36 Je teda možné, že CDP môže vstúpiť do melanocytov a regulovať signálnu dráhu MAPK prostredníctvom NLR. Na overenie tejto hypotézy sú však potrebné ďalšie štúdie.

Niektoré štúdie k dnešnému dňu uvádzajú aplikáciu byliniekpolysacharidyv melanogenéze na inhibíciu produkcie melanínu.37,38 V tejto štúdii však CDP podporovala melanogenézu v

melanocyty a tento účinok sa ďalej potvrdil po porovnaní s -MSH. CDP je tiež druhpolysacharidextrahované z bylín, máme podozrenie, že opačný účinok CDP môže súvisieť so štrukturálnymi rozdielmi medzi CDP a inýmipolysacharidy. Polysacharidy vznikajú polymerizáciou monosacharidov, ale sú variabilné v type monosacharidov, zložení monosacharidov, glykozidickej väzbe, štruktúre bočného reťazca a molekulovej hmotnosti39,40; predpokladá sa, že tieto faktory určujú ich biologické funkcie.41 Existujúce štúdie navrhli štruktúru CDP a naznačili, že štruktúra CDP následne ovplyvňuje jej funkciu.42 Na úplné pochopenie CDP a potvrdenie našej hypotézy je teda potrebný ďalší dôkaz.

Melanogenéza je dôležitým ochranným mechanizmom rezistencie

poškodenie ultrafialovým žiarením a udržiavanie telesnej homeostázy43; zároveň

melanocyty sú ľahko vystavené nepriaznivému prostrediu, ako je preťaženie ROS.11 Je známe, že ROS sa podieľajú na podporemelanogenéza, jedným z mechanizmov je aktivácia MAPK.44 Štúdie však tiež odhalili, že tento účinok existuje len v rámci určitej úrovne ROS, zatiaľ čo preťaženie ROS výrazne zhoršuje melanogenézu.45 Vzťah medzi ROS, MAPK a melanogenézou je za rôznych podmienok premenlivý, teda rovnováha medzi pro- a antioxidačnými systémami je samozrejme dôležitá. Pri depigmentačných ochoreniach, ako je vitiligo, nevyvážený antioxidačný systém a nekontrolovateľné preťaženie ROS poškodí melanocyty a zníži životaschopnosť buniek.11,46 V tejto štúdii sme použili rôzne koncentrácie H2O2 na simuláciu preťaženia ROS v bunkách a HEM vykazovali horšiu toleranciu voči H2O2 ako bunky B16F10. Keď boli melanocyty podrobené liečbe H2O2, ich životaschopnosť a miera apoptózy sa zhoršila, ale

Predúprava CDP by mohla čiastočne zvrátiť trend. V rovnakom čase bola vyčistená ROS. Ako bolo uvedené, aktivácia antioxidačnej dráhy NRF2/ARE je hlavnou metódou zachytávania ROS v kožných bunkách.14 V našich experimentoch boli hladiny proteínov NRF2 a HO-1 v melanocytoch upregulované po liečbe H2O2 bez CDP; to znamená, že H2O2-indukovaloxidačný stresmôže aktivovať dráhu NRF2/HO-1, ale nestačí na udržanie redoxnej rovnováhy a na ochranu bunky pred poškodením. Predbežná úprava CDP však zlepšila antioxidačnú dráhu NRF2/HO{3}} a obnovila rovnováhu. Navrhujeme teda, že CDP môže chrániť melanocyty pred poškodením oxidačným stresom prostredníctvom aktivácie antioxidačnej dráhy NRF2/HO{5}} a zachytávania ROS.

Zistili sme, že samotná liečba CDP nemá žiadny vplyv na ROS alebo NRF2/HO-1 v melanocytoch. Tento výsledok naznačuje, že CDP môže ovplyvniť redoxnú rovnováhu pri oxidačnom strese, ale nie normálne podmienky. Navyše, antioxidačná dráha NRF2/HO-1 je údajne regulovaná signálnymi dráhami PI3K, NF-κB a MAPK.47,48 V našej štúdii bol CDP schopný aktivovať signálnu dráhu MAPK. Je možné, že CDP môže aktivovať dráhu NRF2/HO-1 prostredníctvom upregulujúcich MAPK. Ako uviedol Slominski, melanocyty sú senzory stresu zapojené do regulačnej siete a ich funkcie sa môžu rýchlo meniť v reakcii na prostredie.49 Navrhujeme, že úloha CDP je ovplyvnená stavom melanocytov, môže podporovať melanogenézu bez ovplyvnenia antioxidantu. systému za normálnych podmienok, ale obnovte redoxnú rovnováhu podoxidačný strespodmienky. Preto môže byť funkcia a prežitie melanocytov zachovaná dvoma rôznymi spôsobmi pomocou CDP. CDP pomáha melanocytom udržiavať homeostázu, ktorá je tiež dôležitou funkciou melanogenézy.50,51

Na záver, CDP môže podporovaťmelanogenézamelanocytov

prostredníctvom aktivácie signálnej dráhy MAPK. CDP môže zlepšiť prežitie melanocytov prostredníctvom aktivácie antioxidačnej dráhy NRF2/HO{1}} a vychytávania intracelulárnych ROS v podmienkach oxidačného stresu. Naše zistenia sú zmysluplné, pretože dokazujú, že CDP môže podporovať obojemelanogenézaa chrániť melanocyty predoxidačný stresporanenie, ktoré je pravdepodobne zodpovedné za dysfunkciu a stratu melanocytov. Zistenia tejto štúdie naznačujú, že CDP by mohol byť novým liekom v liečbe depigmentačných ochorení.

POĎAKOVANIE

Túto prácu podporila Národná nadácia pre prírodné vedy Číny (č. 81703101), Projekty nových talentov Xiangya Tretej nemocnice Xiangya Central South University (č. JY201623 a č. 20170301), Nadácia prírodných vied v provincii Hunan ( č. 2018JJ3788 a č. 2018JJ3793) a Projekt zdravotníckej komisie Hunan (č. C2019173). Dr. Yibo Hu vykonal hlavnú časť štúdie a napísal rukopis; Profesor Jing Chen a Qinghai Zeng navrhli štúdiu a riadili písanie rukopisu; Profesor Jinhua Huang, Lihua Huang a Hong Xiang poskytli technickú podporu a analyzovali údaje; Dr. Yixiao Li, Ling Jiang, Yujie Ouyang, Yumeng Li, Lun Yang a Xiaojiao Zhao prispeli k časti experimentov.

KONFLIKT ZÁUJMOV

Autori potvrdzujú, že neexistujú žiadne konflikty záujmov.

VYHLÁSENIE O DOSTUPNOSTI ÚDAJOV

Údaje, ktoré podporujú zistenia tejto štúdie, sú k dispozícii od príslušného autora na odôvodnenú žiadosť.

LITERATÚRA

1. Bleuel R, Eberlein B. Terapeutický manažment vitiliga. J Dtsch Dermatol Ges. 2018; 16:1309-1313.

2. Taieb A, Meurant JM. Mali by sme pri liečbe vitiliga uprednostňovať psychologické intervencie? J Eur Acad Dermatol Venereol. 2018; 32:2053-2054.

3. Picardo M, Dell'Anna ML, Ezzedine K, a kol. Vitiligo. Nat Rev Dis Primers. 2015;1:15011.

4. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. Pigmentácia melanínu v koži cicavcov a jej hormonálna regulácia. Physiol Rev. 2004;84:1155-1228.

5. Slominski A, Zmijewski MA, Pawelek J. L-tyrozín a L-dihydroxyfenylalanín ako hormónom podobné regulátory funkcií melanocytov. Pigment Cell Melanoma Res. 2012; 25:14-27.

6. Spritz RA. Zdieľané genetické vzťahy, ktoré sú základom generalizovaného vitiliga a autoimunitného ochorenia štítnej žľazy. Štítna žľaza. 2010; 20:745-754.

7. Lin X, Tang LY, Fu WW, Kang KF. Detské vitiligo v Číne: klinické profily a imunologické nálezy v 620 prípadoch. Am J Clin Dermatol. 2011;12:277-281.

8. Boehncke WH, Brembilla NC. Autoreaktívne T-lymfocyty pri zápalových kožných ochoreniach. Front Immunol. 2019;10:1198.

9. Iannella G, Greco A, Didona D, a kol. Vitiligo: Patogenéza, klinické varianty a liečebné prístupy. Autoimmun Rev. 2016;15:335-343.

10. Forrester SJ, Kikuchi DS, Hernandes MS, a kol. Reaktívne formy kyslíka v metabolickej a zápalovej signalizácii. Circ Res. 2018;122:877-902.

11. Denat L, Kadekaro AL, Marrot L, et al. Melanocyty ako podnecovatelia a obete oxidačného stresu. J Invest Dermatol. 2014;134:1512-1518.

12. Qiu L, Song Z, Setaluri V. Oxidačný stres a vitiligo: Nrf2-SÚ

signalizačné spojenie. J Invest Dermatol. 2014;134:2074-2076.

13. Hayes JD, Dinková-Kostová AT. Regulačná sieť Nrf2 poskytuje rozhranie medzi redoxným a intermediárnym metabolizmom. Trends Biochem Sci. 2014;39:199-218.

14. Marrot L, Jones C, Perez P, Meunier JR. Význam Nrf2

dráha v reakcii (foto)-oxidačného stresu v melanocytoch a keratinocytoch ľudskej epidermy. Pigment Cell Melanoma Res. 2008; 21:79-88.

15. van Geel N, Speeckaert R, Mollet I, a kol. In vivo model indukcie a terapie vitiliga: dvojito zaslepená, randomizovaná klinická štúdia. Pigment Cell Melanoma Res. 2012; 25:57-65.

16. Nicolaidou E, Antoniou C, Stratigos A, Katsambas AD. Úzkopásmová ultrafialová B fototerapia a 308-nm excimerový laser pri liečbe vitiliga: prehľad. J Am Acad Dermatol. 2009; 60:470-477.

17. Novak Z, Bonis B, Baltas E, et al. Xenónchloridový ultrafialový B laser

je účinnejší pri liečbe psoriázy a pri indukcii apoptózy T buniek ako úzkopásmové ultrafialové B. J Photochem Photobiol B Biol. 2002;67:32-38.

18. Xu P, Su S, Tan C, a kol. Účinky vodných extraktov Eclipse herba, prípravku Polygoni multiflora radix a prípravku Rehmanniae radix na melanogenézu a migráciu ľudských melanocytov. J Ethnopharmacol. 2017;195:89-95.

19. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, "Desertginseng": recenzia. Am J Chin Med. 2012; 40:1123-1141.

20. Guo Y, Cao L, Zhao Q, a kol. Predbežná charakteristika, antioxidačná a hepatoprotektívna aktivitapolysacharidodCistanche deserticola. Int J Biol Macromol. 2016; 93:678-685.

21. Cai RL, Yang MH, Shi Y, a kol. Protiúnavová aktivita extraktu bohatého na fenyletanoidy zCistanche deserticola. Phytother Res. 2010; 24:313-315.

22. Zhang H, Xiang Z, Duan X a kol. Protinádorové a protizápalové účinky oligosacharidov zCistanche deserticolaextrakt pri poranení miechy. Int J Biol Macromol. 2019;124:360-367.

23. Liu Y, Wang H, Yang M, a kol.Cistanche deserticola polysacharidychrániť bunky PC12 pred poškodením vyvolaným OGD/RP. Biomed Pharmacother. 2018; 99:671-680.

24. Song D, Cao Z, Liu Z, a kol.Cistanche deserticola polysacharidoslabuje osteoklastogenézu a kostnú resorpciu prostredníctvom inhibície signalizácie RANKL a produkcie reaktívnych foriem kyslíka. J Cell Physiol. 2018; 233:9674-9684.

25. Fu C, Chen J, Lu J a kol. Downregulácia TUG1 podporuje melanogenézu a melanogenézu indukovanú UVB žiarením. Exp Dermatol. 2019; 28:730-733.

26. Johannessen CM, Johnson LA, Piccioni F, a kol. Program melanocytovej línie poskytuje rezistenciu voči inhibícii MAP kinázovej dráhy. Príroda. 2013;504:138-142.

27. Vachtenheim J, Borovansky J. "Fyziológia transkripcie" tvorby pigmentu v melanocytoch: ústredná úloha MITF. Exp Dermatol. 2010; 19:617-627.

28. Yu N, Zhang S, Zuo F a kol. Kultivované ľudské melanocyty vyjadrujú funkčné toll-like receptory 2–4, 7 a 9. J Dermatol Sci. 2009;56:113-120.

29. Ahn JH, Park TJ, Jin SH, Kang HY. Ľudské melanocyty exprimujú funkčný Toll-like receptor 4. Exp Dermatol. 2008; 17:412-417.

30. Reed SG, Carter D., Casper C a kol. Koreluje aktivity adjuvantov rodiny GLA. Semin Immunol. 2018; 39:22-29.

31. Guo MZ, Meng M, Feng CC, a kol. Novelapolysacharidzískaný z Craterellus cornucopioides zvyšuje imunomodulačnú aktivitu v modeloch imunosupresívnych myší prostredníctvom regulácie dráhy TLR4-NF-kappaB. Funkcia jedla. 2019;10(8):4792-4801.

32. Wei W, Xiao HT, Bao WR a kol. TLR-4 môže sprostredkovať signálne cesty AstragaluspolysacharidRAP indukoval expresiu cytokínov RAW264.7 buniek. J Ethnopharmacol. 2016;179:243-252.

33. Chen H, Yang D, Han F, a kol. Bakteriálny efektor T6SS EvpP bráni aktivácii zápalu NLRP3 inhibíciou dráhy MAPK-Jnk závislej od Ca(2 plus ). Bunkový hostiteľský mikrób. 2017; 21:47-58.

34. Levy M, Shapiro H, Thaiss CA, Elinav E. NLRP6: mnohostranný imunitný senzor in-Nate. Trends Immunol. 2017; 38:248-260.

35. Chen YS, Chen QZ, Wang ZJ, Hua C. Protizápalové a hepatoprotektívne účinky Ganoderma lucidumpolysacharidyproti poškodeniu pečene vyvolanému tetrachlórmetánom u myší Kunming. Farmakológia. 2019;103:143-150.

36. Tian Z, Liu Y, Yang B a kol. Astragaluspolysacharidzmierňuje myšaciu kolitídu prostredníctvom inhibície zápalu NLRP3. Planta Med. 2017; 83:70-77.

37. Jiang L, Huang J, Lu J a kol. Ganoderma lucidumpolysacharidznižuje melanogenézu inhibíciou parakrinných účinkov keratinocytov a fibroblastov prostredníctvom IL{0}}/STAT3/FGF2 dráhy. J Cell Physiol. 2019;234:22799-22808.

38. Cai ZN, Li W, Mehmood S, a kol. ÚčinokpolysacharidFMP-1 z Morchella esculenta o melanogenéze v bunkách B16F10 a zebričkách. Funkcia jedla. 2018; 9:5007-5015.

39. Zhang C, Li Z, Zhang CY a kol. Molekulové charakteristiky a bioaktivitypolysacharidyz lucerny (Medicago sativa L.). Živiny. 2019;11:1181.

40. Coconi Linares N, Di Falco M, Benoit-Gelber I, a kol. Prítomnosť stopových zložiek významne rozširuje molekulárnu odpoveď Aspergillus niger na guarovú gumu. Nová biotechnológia. 2019; 51:57-66.

41. Ma H, Zhang K, Jiang Q, a kol. Charakterizácia rastlinypolysacharidyz Dendrobium officinale viacerými chromatografickými a hmotnostnými spektrometrickými technikami. J Chromatogr A. 2018;1547:29-36.

42. Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. Štrukturálna charakterizácia a imunologická aktivita dvoch extrahovateľných studenou vodoupolysacharidyodCistanche deserticolaYC Ma. Carbohydr Res. 2007;342:1343-1349.

43. Slominski AT, Zmijewski MA, Plonka PM, et al. Ako sa UV svetlo dotýka mozgu a endokrinného systému cez kožu a prečo. Endokrinológia. 2018;159:1992-2007.

44. Schalke S. Nové údaje o poruchách hyperpigmentácie. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2017;31 (dodatok 5):18-21.

45. Glassman SJ. Vitiligo, reaktívne formy kyslíka a T-bunky. Clin Sci. 2011;120:99-120.

46. ​​Ristow M. Odhaľovanie pravdy o antioxidantoch: mitohorméza vysvetľuje zdravotné prínosy vyvolané ROS. Nat Med. 2014; 20:709-711.

47. Balogun E, Hoque M, Gong P a kol. Kurkumín aktivuje gén hem oxygenázy-1 prostredníctvom regulácie Nrf2 a prvku reagujúceho na antioxidanty. Biochem J. 2003;371:887-895.

48. Paine A, Eiz-Vesper B, Blasczyk R, Immenschuh S. Signalizácia

hemoxygenáza-1 a jej protizápalový terapeutický potenciál.

Biochem Pharmacol. 2010; 80:1895-1903.

49. Slominski A, Paus R, Schadendorf D. Melanocyty ako "senzorické" a regulačné bunky v epidermis. J Theor Biol. 1993; 164:103-120.

50. Slominski RM, Zmijewski MA, Slominski AT. Úloha melanínového pigmentu pri melanóme. Exp Dermatol. 2015; 24:258-259.

51. Slominski A, Kim TK, Brozyna AA, a kol. Úloha melanogenézy pri regulácii správania melanómu: melanogenéza vedie k stimulácii expresie HIF-1alfa a sprievodných dráh závislých od HIF. Arch Biochem Biophys. 2014;563:79-93.