Ako oxid dusnatý syntáza ovplyvňuje obličky?

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Molekulárna štúdia toxicity diazinónu na základe expresie indukovateľnej syntázy oxidu dusnatého (iNOS) v hepatocytoch a obličkovej histopatológii potkanov (Rattus norvegicus)

Abstraktné

Diazinon je organofosfátový insekticíd, ktorý sa široko používa na ničenie škodcov, ale má vyššiu toxicitu ako iné insekticídy. Diazinon, ktorý je náhodne spotrebovaný perorálne, má vplyv na zvýšenie reaktívnych foriem kyslíka (ROS) v tele. Reaktívne formy kyslíka (ROS) budú aktivovať prozápalový cytokín, ktorý bude indukovať indukciuSyntáza oxidu dusnatého(iNOS), v ktorom iNOS (Syntáza oxidu dusnatého) vyrobíOxid dusnatý(NO) ako voľný radikál. Vysoká hladina ROS spôsobí poškodenie buniek. Táto štúdia bola zameraná na určenie toxického účinku diazinónu na iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)expresia v pečeni aobličkyhistopatológia potkanov (Rattus norvegicus). Potkany boli rozdelené do 4 skupín, ktoré pozostávali z negatívnej kontrolnej skupiny a troch experimentálnych skupín, ktorým bol podávaný diazinon 20 mg/kg TH (P1), 40 mg/kg TH (P2) a 60 mg/kg TH (P3). Parametre, ktoré boli pozorované v tomto výskume, sú vyjadrením iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)v pečeni pomocou imunohistochemického farbenia, potom analyzovaného pomocou jednosmernej ANOVA nasledovanej Tukeyho testom (a=0,05) aobličkyhistopatológia, ktorá sa pozorovala pomocou farbenia hematoxylín-eozín a analyzovala sa kvalitatívne opisne. Výsledky ukázali, že perorálne podávanie diazinonu významne zvýšilo iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz (s<0,001)in the="" liver="" and="" caused="" damage="" to="" the="">obličiekkôra, ktorá bola preukázaná infiltráciou zápalových buniek, nekrotická zobličkytubulárne bunky a krvácanie v medzitubulárnom priestore.

Kľúčové slová:Diazinon, organofosfát, iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz,obličkyhistopatológia.

Cistanche zlepšujú funkciu obličiek

1. Úvod

Používanie pesticídov má za následok zvýšenie produkcie, najmä ako prevencia proti škodcom a burine (Kusriani, 2012). Časté používanie pesticídov však môže spôsobiť, že tieto pesticídy budú toxické pre spotrebiteľov vrátane zvierat pri vdýchnutí, orálnom podaní a cez kožu (Ameriana, 2006). Jedným z bežne používaných pesticídov je diazinón. Diazinon je organofosfátový pesticíd, ktorý má mechanizmus s inhibíciou funkcie enzýmu cholínesterázy. Tieto pesticídy majú tiež menší účinok na necieľové organizmy a sú toxickejšie pre stavovce v porovnaní s organochlórovými látkami (Luthfanto, 2014). Normálne budú pesticídy neutralizované v pečeni hepatocytmi prostredníctvom detoxikácie, ale tieto zlúčeniny sú tiež schopné vytvárať voľné radikály v dôsledku poškodenia buniek. Expozícia organofosfátom, ku ktorej dochádza nepretržite, môže vyvolať poškodenie pečene ako orgánu, ktorý hrá úlohu v procese detoxikácie (Ginting, 2014). Organofosfáty, ktoré boli metabolizované v pečeni, majú schopnosť inhibovať enzým AChE. Inhibícia tohto enzýmu priamo vedie k zvýšeniu hladín acetylcholínu v nervovom systéme a nervovosvalovom systéme. Zvýšenie AChE môže spôsobiť, že ióny v bunkách sa stanú nestabilnými a spustí tvorbu reaktívnych druhov kyslíka (ROS) (Uchendu, 2012). Zvýšené ROS spustí produkciu prozápalových cytokínov. Naik a Vishva (2011) uvádzajú, že ROS ovplyvňuje transkripciu prozápalových cytokínov, kde vysoké hladiny ROS budú nasledované vysokými hladinami prozápalových cytokínov, ako aj to, ak je produkcia ROS inhibovaná inhibítormi, ovplyvní zníženie produkcie prozápalových cytokínov, napr. ako IL-6 a TNF. Zvýšená produkcia prozápalových cytokínov bude indukovať iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)a tvoria NO v nadmernom množstve (Aktan, 2004).

Theobličkyje hlavným orgánom, ktorý udržiava rovnováhu extracelulárnej tekutiny (ECF) vykonávaním jej funkcií pri vylučovaní a metabolizme (Curthoys, 2014). Vylučovanie alebo eliminácia metabolizmu xenobiotík vedie kobličky. Theobličkypoškodenie môže znížiť úroveň vylučovania chemikálií bez zvýšenia toxicity toxických látok (Gupta, 2012). Stav oxidačného stresu spustí proces peroxidácie lipidov odoberaním vodíkových iónov z väzby polynenasýtených mastných kyselín (PUFA), čím sa vytvorí stabilnejšia molekula. Proces prerušenia väzby na PUFA môže spôsobiť nekrózu buniek alebo tkanív (Sharma et al..2003).

Táto štúdia bola vykonaná na stanovenie toxického účinku diazinónu proti iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)expresia v pečeni a obličkovej histopatológii potkanov.

Syntáza oxidu dusnatého ovplyvňuje funkciu obličiek

2. Materiály a metódy

2.1. Zvieracie modely a experimentálny dizajn

Dvadsať potkanov (Rattus norvegicus) bolo rozdelených do 4 skupín: negatívna kontrolná skupina (zdravé potkany). Skupinám P1, P2 a P3 sa podával diazinon počas 8 týždňov perorálne pomocou sondy s dávkami 20 mg/kg telesnej hmotnosti, 40 mg/kg telesnej hmotnosti a 60 mg/kg telesnej hmotnosti. Diazónium 600EC sa miešalo s destilovanou vodou, kým neobsahovalo 5 mg diazónia v 1 ml (Baconi et al., 2013).

Potkany sa týždeň pred liečbou aklimatizovali. Všetky podmienky a manipulácia so zvieratami sa uskutočňovali podľa protokolu schváleného Výborom pre etické zúčtovanie Univerzity Brawijaya (č.: 732-KEP-UB).

2.2. Príprava a pozorovanie histopatológie obličiek

Prípravaobličkyhistopatológia pozostáva z nasledujúcich etáp: fixácia, dehydratácia, čistenie, zapustenie, rezanie, nalepenie na sklenené predmety podľa Muntiha (2001). Pozorovania zobličkyhistopatológia sa uskutočňovala pomocou binokulárneho svetelného mikroskopu so zväčšením mikroskopu 100x a následne až 400x. Pozorovanie sa uskutočňovalo na obličkových glomeruloch a obličkových tubuloch.

2.3. Analýza expresie iNOS (syntázy oxidu dusnatého) v pečeni

iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)expresia v pečeni bola analyzovaná imunohistochemickými metódami s použitím anti iNOS (Syntáza oxidu dusnatého) ako primárna protilátka a anti-králičí IgG biotínom značený ako sekundárna protilátka. Meranie iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)expresia na pečeni bola uskutočnená pomocou softvéru Immunoratio. Výsledky percentuálnej plochy expresie iNOS sa analyzovali kvantitatívne pomocou testu jednosmernej analýzy rozptylu (ANOVA) a nasledovali Tukeyho test.

3. Výsledky a diskusie

3.1. Analýza expresie iNOS (Nitric Oxide Synthase) v pečeni

Analyzovať expresiu iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)na pečeňových bunkách bola vykonaná imunohistochemickou metódou. Výraz iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)môže byť znázornený ako hnedý farebný výraz na hepatocytoch, ktorý je možné vidieť na obrázku 1.

Obrázok 1. iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz na pečeni.

(1) Negatívna kontrolná skupina (K-). (2) P1 (indukovaný diazinonom 20 mg/kg telesnej hmotnosti. (3) P2 (indukovaný diazinonom 40 mg/kg telesnej hmotnosti).

(4) P3 (indukovaný diazinonom 60 mg/kg telesnej hmotnosti. Biely kruh znázorňuje plochu iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz.

Imunohistochemický výsledok sa analyzoval kvalitatívne a ukázal, že došlo k zvýšeniu intenzity hnedej farby (obrázok 1). Tento výsledok naznačuje, že došlo k nárastu iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)úrovne expresie v liečenej skupine v porovnaní s kontrolnou skupinou.

Na meranie úrovne iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)expresia na hepatocytoch použitá softvérová imunoreakcia. Výsledky kvantitatívnej analýzy iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)expresiu v pečeni potkanov je možné vidieť v tabuľke 1 a možno konštatovať, že existuje významný rozdiel (p<0.001) between="" the="" treatment="" groups="" compared="" to="" the="" negative="" control="" group="" (k-).="" in="" the="" negative="" control="" group="" that="" was="" the="" group="" without="" diazinon="" organophosphate="" induction,="" the="" average="" percentage="" area="" of=""> (Syntáza oxidu dusnatého)Sexpresia bola 1,340 ±0,092 percenta. V liečebnej skupine 1 (P1), čo bola skupina indukovaná diazinón organofosfátom v dávke 20 mg/kg telesnej hmotnosti, priemerná percentuálna plocha iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)expresia bola 4,184±1,041 percenta. Liečebná skupina 2 (P2) bola skupina indukovaná diazinón organofosfátom v dávke 40 mg/kg telesnej hmotnosti a priemernej iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz bol 7,496±0,997 percent . Liečebná skupina 3 (P3) bola skupina indukovaná diazinón organofosfátom v dávke 60 mg/kg telesnej hmotnosti a priemernej iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz bol 11,604 ± 0.864.

Na negatívnej kontrolnej skupine sa ukázal iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)expresia v nízkej intenzite (1,340 ± 0,092 percent ). McNaughton a kol. (2002) zistili, že iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)bol exprimovaný v normálnych pečeňových acini. Šírenie iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)v normálnej pečeni ukazuje oblasť okolo brány s najsilnejším výrazom a intenzita klesá pozdĺž pečene acini. Podľa Kubesa (2000) iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)môže poskytnúť terapeutické účinky, ak je regulovaný v správnom množstve a na správnom mieste, iNOS má pozitívnu úlohu vrátane hojenia kože a črevnej sliznice, boja proti určitým baktériám, potenciál v regulácii proliferácie a diferenciácie T buniek a reguluje nábor leukocytov .

Liečebná skupina vykazovala významné zvýšenie percentuálnej plochy iNOS (Syntáza oxidu dusnatého) (p<0,001). diazinon="" such="" as="" organophosphate="" in="" general="" will="" be="" metabolized="" which="" mainly="" takes="" place="" in="" the="" liver.="" the="" metabolism="" that="" occurs="" in="" phase="" 1="" metabolism="" is="" an="" oxidation="" process,="" where="" organophosphate="" will="" be="" broken="" down="" into="" oxon-organophosphate="" metabolites="" and="" free="" sulfur="" ions="" with="" the="" help="" of="" cytochrome="" enzymes(cyp)(gupta,="" 2009).="" metabolites="" from="" phase="" 1="" metabolism="" are="" free="" radicals,="" unstable="" substances="" that="" have="" no="" electron="" pairs.="" free="" radicals="" will="" produce="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)such="" as="" superoxide,="" hydroxyl="" radicals,="" and="" hydrogen="" peroxide="" through="" interactions="" with="" other="" molecules.="" free="" radicals="" react="" with="" phospholipids="" from="" the="" plasma="" membrane,="" endoplasmic="" reticulum="" membrane,="" or="" mitochondrial="" membrane="" and="" cause="" cell="" death="" (gupta,="" 2012).="" organophosphate="" pesticides="" can="" also="" cause="" oxidative="" stress(mishra,="" 2013).="" this="" oxidative="" stress="" condition="" is="" caused="" by="" diethyl="" as="" an="" organophosphate="" free="" radical(diazinon)that="" is="" capable="" to="" produce="" large="" amounts="" of="" ros.="" oxidative="" stress="" is="" an="" impaired="" balance="" between="" prooxidants="" and="" antioxidants="" that="" causes="" potential="" damage="" (uchendu="" et="" al.,="">

Zvyšujúce sa ROS spustí produkciu prozápalových cytokínov. Druhy reaktívneho kyslíka ovplyvňujú transkripciu prozápalových cytokínov, kde vysoké hladiny ROS budú nasledované vysokými hladinami prozápalových cytokínov, podobne, ak je produkcia ROS inhibovaná inhibítormi, ovplyvní to aj zníženie produkcie prozápalových cytokínov, ako je IL{{0 }} a TNF (Naik a Vishva, 2012). Dunlop et al. (2014) a Pahan et al. (2000) uviedli, že TNF- a IL-1 hrajú úlohu pri zvyšovaní expresie iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)v tkanivách prostredníctvom aktivácie Nappar Kappa B(NF-kB), v ktorej NF-kB vstupuje do jadra a viaže sa na promótorovú oblasť iNOS (Syntáza oxidu dusnatého). Zvýšená produkcia prozápalových cytokínov bude indukovať iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)a tvoria nadmerné množstvoOxid dusnatý(NO) (Aktan, 2004).

3.2. Analýza histopatológie obličiek

Výsledky tohto výskumu o vplyve toxicity diazinónu naobličkyhistopatologické znaky využívajúce farbenie hematoxylín-eozín (HE) sú znázornené na obrázku 2. Histologický obraz krysej obličkovej kôry v skupine s negatívnou kontrolnou skupinou (K-) vykazoval normálny stav a nezistili sa žiadne abnormality. Dokazuje to objavenie sa renálneho korpusu, proximálnych a distálnych konvulzívnych tubulov s vrstvou kubických epitelových buniek (obrázok 2(1)).

Histopatologický obraz renálnej kôry potkanov v skupine P1 ukázal abnormality, ktoré sa vyznačujú prítomnosťou buniek podstupujúcich karyolýzu a hypertrofiu. Bunky karyolýzy boli charakterizované vymiznutím bunkového jadra, zatiaľ čo epitelové bunky podliehajúce hypertrofii majú vlastnosti zväčšenej veľkosti buniek, takže štruktúra renálnych tubulov sa javí ako nepravidelná. Na tomto obrázku je možné vidieť erytrocyty v intertubulárnom priestore, čo naznačuje prítomnosť krvácania (obrázok 2(2). Histopatologický obrázok v skupine P2 ukazuje abnormality podobné ako v skupine P1. Abnormality, ktoré možno pozorovať v kôre obličiek P2 potkanov zahŕňa objavenie sa buniek podstupujúcich karyolýzu, hypertrofiu buniek a krvácanie.obličkytubuly sa javia ako nepravidelné v porovnaní so skupinou K- (obrázok 2(3)). Histopatologický obraz obličkovej kôry potkanov v skupine P3 vykazoval abnormality, ako je vidieť v histopatologickom obraze obličkovej kôry u potkanov Pl a P2, charakterizované objavením sa hypertrofie buniek, karyolýzy a erytrocytov v intertubulárnom priestore (hemoragia ). Tiež je možné pozorovať prítomnosť infiltrácie zápalových buniek v tkanivách (obrázok 2(4)).

Diazinon organofosfát, ktorý sa podával potkanom perorálne, bude trávený tráviacim traktom, ktorý bude potom absorbovaný črevom, najmä dvanástnikom. Metabolizmus organofosfátov prebieha hlavne v pečeni, ale v menšej miere prebieha metabolizmus aj v dlani a čreve. Organofosfát prejde metabolizmom fázy 1, čo je oxidačný proces, pri ktorom sa organofosfát rozloží na oxón-organofosfátové metabolity a voľné ióny síry pomocou enzýmov cytochrómu (CYP) (Gupta, 2009; Elersek a Metka 2011). Oxón-organofosfátový metabolit potom vstupuje do krvného obehu a ide do pečene na ďalší metabolizmus. V pečeni sa oxón-organofosfátové metabolity hydrolyzujú pomocou enzýmov karboxylesterázy (CE) a paraoxonázy (PON), rozštiepia sa na dialkylfosfát a opustia skupinu. Dialkylfosfatáza bude potom katalyzovaná enzýmami vo fáze 2 metabolizmu, ktoré budú produkovať molekuly, ktoré sú hydrofilné a môžu sa vylučovať močom, pričom opúšťajú skupiny (vo forme dietyl), ktoré môžu vyvolať oxidačný stres v tele. Dietyl je veľmi reaktívna molekula a môže reagovať s hydroxylovými radikálovými skupinami (-OH) za vzniku nových voľných radikálov (Elersek a Metka, 2011). Vysoký počet voľných radikálov v tele nemôže byť neutralizovaný endogénnymi antioxidantmi, čo vedie k nerovnováhe medzi voľnými radikálmi a antioxidantmi, ktorá spôsobuje oxidačné poškodenie (Caramori a Papi, 2004). K tomuto oxidačnému poškodeniu dochádza, pretože dietyl-hydroxyl ako voľný radikál z organofosfátového diazinónu je schopný produkovať veľké množstvo ROS (Uchendu et al., 2012). Zvyšujúce sa ROS potom spôsobia podmienky oxidačného stresu a iniciujú proces peroxidácie lipidov odoberaním vodíkových iónov z polynenasýtených mastných kyselín (PUFA) za vzniku stabilnejších molekúl. Proces štiepenia väzby PUFA môže spôsobiť nekrózu buniek alebo tkanív (Sharma et al., 2003).

Abnormality sa vyskytli vobličkytubulárny epitel v dôsledku priameho kontaktu epitelu s toxickou substanciou diazinónu a vobličkytubulu, v procese tvorby moču dochádza k procesu reabsorpcie a augmentácie (Mescher, 2010). Toxická látka diazinónu, ktorá je stále v cievach, bude v priamom kontakte s endotelom, čo spôsobí narušenie priepustnosti cievnej membrány. Krvácanie v intertubulárnom priestore bolo spôsobené porušením permeability membrán krvných ciev (peritubulárne kapiláry), takže erytrocyty môžu vstúpiť do tkaniva (Djumadi et al., 2008). Poškodenie endotelových buniek spúšťa zápalové reakcie, čo vedie k akumulácii makrofágov a krvných doštičiek mimo a vo vnútri tepien. Výskyt infiltrácie zápalových buniek v poškodenom tkanive naznačuje, že metabolity diazinónu spôsobujú toxicituobličky(Khudair et al., 2017).

Na základe výsledkov histopatologického vzhľadu sa v kôre obličiek v liečenej skupine vyskytli abnormality v porovnaní s K-skupinou. Bolo známe, že skupina P1 s najnižšou dávkou 20 mg/kg telesnej hmotnosti vykazovala poškodenieobličkytubulárnych buniek v porovnaní s K-skupinou.

Cistanche zlepšujú funkciu obličiek

4. Záver

Ukázalo sa, že podávanie diazinonu s najnižšou dávkou 20 mg/kg telesnej hmotnosti má u potkanov toxický účinok, čo naznačuje významné zvýšenie iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz (s<0.001)and showed="" the="" damage="" of="" the="" renal="" cortex="" in="" the="" form="" of="" renal="" tubular="" cell="" necrosis,="" hemorrhage,="" and="" renal="" tubular="" cell="">

5. Referencie

[1] Aktan, F 2004 iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)-Sprostredkovaná produkcia oxidu dusnatého a jej regulácia. Life Sciences, 75:639-653.

[2] Ameriana, M. 2006. Perilaku Petani Sayuran v Menggunakan Pestisida Kimia.J. Hort.18(1):95-106,2008.

[3] Arthur,CGand EHJohn.1997.Fisiologi Kedokteran.EGC.Edisi9.1997.

[4] Aulanni'am, A. Rosdiana a NL Rahmah.2012. Sila sargasových duplikovaných extraktov Bory pri liečbe zápalových črevných extraktov v liečbe chorôb Rattus norvegicus.Journal of Life Sciences 6:144-154.

[5] Caramori, G. a A. Papi. 2004. Antioxidanty pri otrave organofosforovými zlúčeninami. IntJ Pharm Bio Sci,59 (2): 170-173.

[6] Cox, C.2000.Diazinon: Toxicology.Journal of Pesticide Reform/ Summer 20(2).

[7] Curthoys, NP a WM Orson. 2014. Funkcia proximálnych tubulov a odpoveď na acidózu. Americká nefrologická spoločnosť. Clinical Journal of the American Society of Nephrology 9:1627-1638

[8] Djumadi, H., dan H. Sugiyono.2008. Pengaruh Pemberian Insektisida Diazinon a Kurkumin Kunyit (Curcuma domestica) Per-Oral terhadap Perubahan Struktur Histologis Duodenum Mencit (Mus musculus). Denník Penelitian Sains & Teknologi, Vol.9(1):62-83.

[9] Dunlop, K., G.Kiranjot, K. Crystal, I.Julijana, D.Rupinder, D.Jean-Francois, ACKim, J. Amish, PJ McNamara a PJ Robert. 2014. Terapeutická hyperkapnia zabraňuje systolickej dysfunkcii pravej komory u mladých potkanov vyvolanej inhalovaným oxidom dusnatým. Elsevier Inc. Free Radical Biology and Medicine 9: 35-49.

[10] Elersek,T.and F.Metka.2011.Pesticides: The Impacts of Pesticides Exposure.InTech Europe. Rijeka.

[11] Frazier,SK, CSJohn,CHGordon,B.Graham, B.Roger, N.Shinji, N.Akiyoshi, D.Beate a B. Axel.2012. Proliferatívne a neproliferatívne lézie močového systému potkanov a myší. Toxicologic Pathology, 40:14S-86S

[12] Georgievskii, V.1., BNAnnenkov a VTSamokhin. 2013. Materiálová výživa zvierat: Štúdie v poľnohospodárstve a potravinárstve. Butterworths & Co. (Vydavatelia) Ltd.Londýn. 160-161.

[13] Gupta, RC2012.Veterinárna toxikológia Druhé vydanie.Elsevier inc. Waltham. USA.

[14]Hubrecht, R. a J. Kirkwood. 2010. UFAW: Príručka starostlivosti a manažmentu laboratórnych a iných výskumných zvierat. Univerzitná federácia pre dobré životné podmienky zvierat. Spojené kráľovstvo.

[15]Khudair, ZW, ASHanan a KE Manal. 2017. Histopatologické zmeny, ktoré sa vyvolali vo vnútorných orgánoch bieleho potkana po expozícii diazinon.Bas..Vet.Res. 1(2)

[16] Kubes, P.2000. Inducible Nitric Oxide Synthase: Trocha dobra v nás všetkých. http://dx.doi.org/10.1136/gut.47.1.6 [24. júla 2019].

[17] McNaughton, L., P.Lakshmi, AMMaria, K. Norm, M. Irvin, M. Redwan, H. Outayba a WR Marek.2002. Distribúcia syntázy oxidu dusnatého v normálnej a cirhotickej ľudskej pečeni. Proceedings of the National Academy of Science Vol. 99, No.26 17161-17166.

[18] Mescher, AL2010. Základná histológia Junqueiru: Text & Atlas 12 Edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. Spojené štáty americké.

[19] Mishra, BP 2013. Antioxidačný stav a oxidačný stres pri otrave organofosfátovými pesticídmi.IOSR.Journal of Dental and Medical Sciences (IOSR-JDMS)e-ISSN:2279-0853, p-ISSN:2279-0861 .Zväzok 7, vydanie 6 (máj – jún 2013), PP 20-24