Príčina polycystických obličiek
Mar 10, 2022
pre viac informácií:{0}}
Nadmerná expresia PKD1 spôsobuje polycystické ochorenie obličiek
Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté a Marie Trude
Základné patogenetické mechanizmyautozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek(ADPKD) je potrebné ešte objasniť. Aj keď existujú dôkazy, že Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)génová haploinsuficiencia a strata heterozygotnosti môže spôsobiť tvorbu cýst u myší, paradoxne vysoké hladiny Pkd1(polycystická choroba obličiek 1) expresia ADPKD bola zistená v obličkách (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek) pacientov. Ak chcete zistiť, či Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)zvýšenie funkcie môže byť patogenetický proces, bakteriálny umelý chromozóm Pkd1 (Pkd{1}}BAC) bol modifikovaný homológnou rekombináciou, aby sa zameral výlučne na trvalú expresiu Pkd1 prednostne na obličky dospelých. Vytvorilo sa niekoľko transgénnych línií, ktoré špecificky nadmerne exprimovali Pkdl transgén v obličkách 2- 15-násobne vyšší ako endogénne hladiny Pkd1. U všetkých transgénnych myší sa reprodukovateľne vyvinuli tubulárne a glomerulárne náklady a renálna insuficiencia a zomreli na zlyhanie obličiek. Tento model demonštruje, že nadmerná expresia samotného Pkd1 divokého typu je dostatočná na spustenie cystogenézy pripomínajúcej ľudskú ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek). Naše výsledky tiež odhalili nápadne zvýšenú renálnu expresiu c-myc u myší zo všetkých transgénnych línií, čo naznačuje, že c-myc je kritický in vivo downstream efektor Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)molekulárne Dathwavs, Táto štúdia priniesla nielen neoceniteľné a prvé PKD(polycystické ochorenie obličiek)model na vyhodnotenie molekulárnej patogenézy a terapií, ale tiež poskytuje dôkaz, že zisk funkcie by mohol byť patogenetickým mechanizmom pri ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek).
Kliknite na Cistanche pre ochorenie obličiek
Autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek(ADPKD) je jednou z najčastejších genetických chorôb u ľudí. Je charakterizovaná progresívnym vývojom viacerých obličkových cýst postihujúcich všetky segmenty nefrónu. Medzi ďalšie prejavy patrí tvorba cýst v pečeni a pankrease ako aj intrakraniálne aneuryzmy a kardiovaskulárne defekty. ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek)typicky vedie k renálnej insuficiencii s progresiou do konečného štádia renálneho ochorenia do neskorého stredného veku.
Približne 85 percent ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek)prípady sú spojené s mutáciami v PKD1(polycystická choroba obličiek 1)gén. Tento PKD1(polycystická choroba obličiek 1)gén je veľký, má veľkosť 54 kb a pozostáva zo 46 exónov. Generuje 14.2-kb transkript a kóduje 4., 302-aminokyselinový proteín nazývaný polycystín-1(4, 9-11). Expresia ľudského PKD1 a polycystínu{11}} bola analyzovaná v normálnych a ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek)obličky. Počas vývoja obličiek sa polycystín{0}} ľahko deteguje v glomerulárnych a tubulárnych epiteliálnych bunkách (prehľad v odkaze 37 a odkazoch v ňom uvedených). U normálnych dospelých sme my a iní ukázali, že PKD1(polycystická choroba obličiek 1)RNA a proteín sú exprimované na stredných až nízkych hladinách v zberných a distálnych tubuloch, zatiaľ čo hladiny sa zvýšili (~2--násobne) v ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek)obličky (22, 39). Je zaujímavé, že pretrvávajúca alebo zvýšená expresia polycystínu-1 bola detegovaná vo väčšine renálnych epitelových cýst, hoci farbenie chýbalo u významnej menšiny cýst(29). Okrem obličiek PKD1(polycystická choroba obličiek 1)expresia je normálne rozšírená v iných dospelých tkanivách, vrátane typov epitelových a neepitelových buniek (6, 14, 18, 29, 30, 39).
Viac ako 200 rôznych PKD1(polycystická choroba obličiek 1)boli opísané mutácie, z ktorých väčšina sú delécie-inzercie, frameshift alebo nezmyselné mutácie. Predpokladá sa, že výsledkom budú skrátené formy proteínu v súlade s inaktiváciou jednej alely.
Významný podiel však tvoria mutácie typu missense alebo in-frame, ktoré sa nachádzajú v celom géne a sú často jedinečné pre konkrétnu rodinu (33, 34). Ako už názov napovedá, ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek)je dominantná a prenášaná mutovaná PKD1(polycystická choroba obličiek 1)alela je dostatočná na vznik ochorenia. Avšak fokálna povaha renálnych cýst pri ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek)naznačuje, že mutačný mechanizmus pre PKD1(polycystická choroba obličiek 1)môže to byť dvojitý zásah alebo strata heterozygotnosti. Podpora pre tento mechanizmus bola získaná detekciou PKD1(polycystická choroba obličiek 1)klonálne somatické mutácie v bunkách z významnej časti cýst(3, 21, 32). Mechanizmus straty heterozygotnosti by mohol zodpovedať za veľmi rozdielny fenotyp bežne pozorovaný v jednotlivých rodinách.
Štúdie na myši Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)gén môže poskytnúť cenné informácie o funkcii (funkciách) PKD1 kvôli úzkej podobnosti medzi ľudským a myšacím génom a génovým produktom. Pri normálnom vývoji je myšací Pkd1 exprimovaný vo vysokých hladinách od štádia moruly a je detegovaný vo všetkých derivátoch buniek neurálnej lišty. vrátane mozgu dospelých, oblúka aorty, chrupavky a mezenchymálnej kondenzácie (16, 17). Bolo hlásené, že homozygotné mutantné myši zacielené na deléciu Pkd1 umierajú in utero a vyvíjajú sa cysty obličiek a pankreasu (2, 19, 24-26, 40). Tieto predchádzajúce pokusy o generovanie myších modelov bohužiaľ neposkytli postnatálne životaschopné zvieratá. Výskyt obličkových cýst u týchto homozygotných myší s mutantom Pkd1 by však bol v súlade s hypotézou o dvojzásahovom mutačnom mechanizme u ľudí, ktorý zahŕňa zárodočnú mutáciu a somatickú inaktiváciu normálnej alely. Avšak myši heterozygotné pre Pkd1 cielenú deléciu tiež vykazovali PKD s občasnými cystami pečene a pankreasu napriek neskorému nástupu v dospelosti, čo podporuje mechanizmus haploinsuficiencie alebo redukcie dávky génu. Okrem toho strata heterozygotnosti alebo haploinsuficiencie nemusí byť jediným mechanizmom pre ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek)patogenézy. V skutočnosti sú tieto mechanizmy v rozpore s pretrvávajúcou alebo zvýšenou expresiou PKD1(polycystická choroba obličiek 1)pozorované u väčšiny ľudských obličkových cýst, pokiaľ sa nevytvoria nefunkčné proteíny. Toto zistenie trvalej alebo zvýšenej expresie PKD1 vyvoláva otázku, či môže byť operantné zvýšenie funkcie alebo nadmerná expresia. Aby sme preskúmali patogenetický mechanizmus zosilnenia funkcie Pkd1, izolovali sme a charakterizovali sme myší bakteriálny umelý chromozóm Pkd1 (Pkd1-BAC), ktorý bol následne modifikovaný homológnou rekombináciou v Escherichia coli na cieľovú expresiu Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)konkrétne na obličky. Uvádzame produkciu troch transgénnych línií, ktoré exprimovali Pkd1 transgén na rôznych úrovniach. Všetky myši reprodukovateľne vykazovali množstvo podobností s ľudskou ADPKD a konzistentne sa u nich vyvinul skorý nástup s rýchlou progresiou renálnych morfologických a funkčných zmien a zomreli na zlyhanie obličiek v strednom veku. Okrem toho súčasná štúdia opisuje mechanizmus in vivo, ktorým môže Pkd1 sprostredkovať tento fenotyp PKD. Tieto myši predstavujú prvý model PKD produkovaný jedinou renálnou nadmernou expresiou ortologického PKD1(polycystická choroba obličiek 1)gén.
MATERIÁLY A METÓDY
Izolácia klonov BAC obsahujúcich Pkdl(polycystická choroba obličiek 1)lokus. Klony Pkd1-BAC z bakteriálneho hostiteľského kmeňa E. coli DH10B (RecA; RecBC) sa izolovali z knižnice pBelo11BAC myši 129Sv (Research Genetics). Skríning BAC super poolov sa uskutočnil pomocou PCR s nasledujúcimi primérmi: 5 oblastí, 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3 (dopredný Pkd1 exón 1) a 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC{10}} (reverzný Pkdl exón 1); a 3 oblasti, 5-TCG GCCCTAGCGTCTGCAGCC-3 (dopredný Pkd1 exón 39) a 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3 (reverzný Pkd1 exón 40). Jeden pozitívny klon pre obe amplifikácie sa identifikoval a analyzoval štandardnou gélovou elektroforézou a gélovou elektroforézou s pulzným poľom (PFGE), po ktorej nasledoval Southern blot. Na analýzu Southern blot bolo navrhnutých sedem myších sond Pkd1: genómový exón 1 (516 bp; nukleotidy [nt] 1 až 516; prírastkové číslo NCBI U70209), genómový exón 2-3 (220 bp), genómový exón {{ 31}} (8 479 bp), cDNA exón 15-20 (1 724 bp; nt 6455 až 8179), cDNA exón 25-34 (1 315 bp; nt 9415 až 10730), cDNA exón 36-45 ( 1655 bp; nt 10963 až 12618) a genómový exón 45-46 (1640 bp) (16). Bolo tiež sekvenovaných niekoľko oblastí vrátane inzertných končatín BAC tohto myšacieho Pkd1-BAC a potvrdilo sa, že sú ortologické k ľudskému génu PKD1 a priľahlým oblastiam.
VÝSLEDKY
Výroba SBPkdl(polycystická choroba obličiek 1) rAc-BAC homológnou rekombináciou. Na určenie, či samotný zisk funkcie Pkd1 je dostatočný na vytvorenie ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek)fenotyp, najprv sme izolovali genómový klon obsahujúci celý gén Pkdl v knižnici BAC vektora 129/Sv. Táto knižnica sa skrínovala pomocou PCR s dvoma sadami primérov pre gén Pkdl, ktorý preklenul exón 1 na 5' konci a exóny 39 až 40 smerom k 3' koncu (obr. 1). Identifikoval sa pozitívny klon BAC pre gén Pkdl, ktorý zahŕňal celé susedné telo génu Tsc2. Inzert Pkd1 bol podrobne charakterizovaný, aby sa zabezpečilo, že genómová štruktúra sa zhoduje so štruktúrou endogénneho Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)gén myšieho kmeňa 129/Sv, z ktorého bol inzert odvodený, a z inbredného kmeňa C57BL/6J. Genomické mapy lokusu Pkdl v BAC a v týchto inbredných kmeňoch analýzou Southern blot, so štyrmi štiepeniami reštrikčnými enzýmami a siedmimi sondami pokrývajúcimi celý gén Pkdl, sa zdali identické bez dôkazov o preskupeniach (obr. 1). Tento BAC obsahoval ~121-kb insert vrátane-37 kb upstream a -39 kb downstream sekvencie Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)génu, ako sa stanoví elektroforézou a sekvenovaním.
Tento klon Pkd{0}}BAC bol modifikovaný dvoma po sebe nasledujúcimi udalosťami homologickej rekombinácie v E. coli. Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)gén bol označený v exóne 10 substitúciou nukleotidu (G za A), aby sa vytvorilo nové miesto EcoRI v polohe 2355 na mape cDNA. Táto tichá bodová mutácia bola vytvorená na rozlíšenie Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)génu a transkriptu BAC z endogénneho pôvodu. Okrem toho sme nahradili 5'regulačné prvky Pkd1-BACgénu využitím predtým identifikovaných „SB“ obličkových epitelových špecifických prvkov z SBM (spojeného s c-Myc) alebo SBF spojeného s c- fos)konštrukt-trans-gén na obmedzenie expresie na obličky (36, 38) (obr. 2a).
Tento nový SBPkd1TAc-BAC bol štiepený Notl, jedinečným miestom umiestneným bezprostredne pred prvkami SB a Clal v tele génu Tsc2, čím sa skrátili regulačné prvky Tsc2 a 5' polovica tela génu, aby sa zabezpečila absencia exogénnej expresie Tsc2. vo všetkých tkanivách a na odstránenie prokaryotických sekvencií BACvector (obr. 1 a 2). Tento 70-kb linearizovaný fragment Notl-Clal bol izolovaný, purifikovaný a kvantifikovaný na mikroinjekciu oocytov (36).
Produkcia a analýza SBPkdlrAc transgénnych myší. Štyria transgénni zakladatelia nesúci niekoľko kópií transgénu SBPkd1rAc konzistentne vyvinuli PKD(polycystické ochorenie obličiek). Zo štyroch základných myší SBPkdlrAc určených Southern analýzou sa vytvorili tri transgénne línie SBPkdlrAG s dvoma až deviatimi kópiami transgénu (obr. 2b). Charakterizácia integrity transgénu v týchto líniách bola monitorovaná 5', internými a 3' sondami, ako je znázornené na reprezentatívnych príkladoch na obr. 2b. Transgénne línie odhalili pomocou 5'"SB" sondy pás s veľkosťou 10,9 kb konzistentný s transgénom SBPkd1rAc, ktorý bol integrovaný do orientácie od hlavy k chvostu, a pomocou 3'sondy odhalili pás s veľkosťou 7,{14}} kb (obr. 2b). Okrem toho interná sonda detekovala 9,{17}}kb endogénny pás Pkd1, ako aj 6,{20}}kb a 2,2{22}}kb pásy transgénu vďaka inzerčnému miestu EcoRI v exóne 10 (obr. 2b). Tieto myši obsahovali úplné kópie transgénu na základe analýzy genómovej prekrývajúcej sa štruktúry.
Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)zisk funkcie u dospelých transgénnych myší SBPkdlrAc. Expresia transgénu SBPkdlrAG a génu Pkd1 sa skúmala v rôznych orgánoch. Kvantifikácia hladín transkriptov z transgénu a/alebo endogénneho génu sa uskutočnila analýzou Northern blot (obr. 3a). Ako sa očakávalo, transgénové a endogénne génové transkripty mali podobnú dĺžku (14,2 kb). Na základe kontrolnej expresie GAPDH mali obličky zo všetkých myších línií SBPkd1TAG konzistentne zvýšenú expresiu transkriptu v porovnaní s normálnymi hladinami Pkdl v dospelých obličkách (n=3) podobného veku. Renálny transgén a endogénna expresia pre rôzne transgénne línie vykazovali rozsah 2- až 15-násobok nad kontrolnými renálnymi endogénnymi hladinami Pkd1 (obr. 3a). Najmä transgénna línia 39 (n {{11} })ukázal vyšší Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)úrovne ako riadky 3 (n=3) a 41 (n =4). Okrem toho hladiny expresie Pkd1 merané analýzou Northern blot korelovali s hladinami získanými pomocou PCR v reálnom čase s použitím primérov v exónoch 1 a 2 (obr. 3b).
Kvantifikácia hladín expresie transgénu sa špecificky uskutočňovala pomocou PCR v reálnom čase a semikvantitatívnej RT-PCR v troch transgénnych líniách v dospelom veku pomocou primérov v 5'netranslatovanej oblasti (B, -globínový promótor) a v exóne 2 Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)(Obr. 3b). Expresia SBPkdlrAc u transgénnych myší sa porovnávala s génovým produktom ribozomálneho proteínu S16 ako vnútorným štandardom. Podmienky použité na semikvantitatívnu RT-PCR amplifikáciu boli v lineárnom rozsahu. Expresia transgénu pomocou PCR v reálnom čase a semikvantitatívnej RT-PCR konzistentne a špecificky vykazovala najvyššiu expresiu v obličkách zo všetkých transgénnych línií v porovnaní s inými orgánmi (obr. 3b a c). Hladiny renálnej expresie pre individuálnu vzorku boli reprodukovateľné akoukoľvek z použitých detekčných techník. Najvyššie úrovne Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)renálna expresia transgénu sa merala pre línie 39 a 41. Aby sa monitorovalo, či sa zvýšil Pkdl(polycystická choroba obličiek 1)expresia bola výsledkom transgénu alebo endogénneho génu, rovnaká skupina myší z troch transgénnych línií sa porovnávala na renálnu expresiu Pkd1 transgénu a na renálnu celkovú (transgénnu a endogénnu) expresiu Pkd1 pomocou PCR v reálnom čase. Je zaujímavé, že riadky 39 a 41 vo vzťahu k riadku 3 ukázali, že zvýšená renálna expresia Pkdl transgénu bola podobná alebo vyššia ako celková renálna expresia Pkd1, čo poukazuje na transgén ako špecificky zodpovedný za túto indukovanú expresiu. V rôznych orgánoch (vrátane srdca, pľúc, mozgu, pečene, pankreasu a sleziny) vykazoval transgén SBPkd1rAg veľmi slabú expresiu, ktorá bola občas detekovaná v slezine a pľúcach, s malou až nedetegovateľnou expresiou v iných orgánoch (obr. 3b). Kvantifikácia pomocou PCR v reálnom čase preukázala 10- až 1,{13}}krát nižšiu úroveň expresie transgénu v extrarenálnych tkanivách v porovnaní s expresiou obličiek (obr. 3c). "SB" regulačné elementy transgénu SBPkdlrA poskytujú preferenčnú renálnu expresiu; táto konkrétna distribúcia orgánov bola tiež určená pri použití v transgénoch spojených s c-myc (SBM) a c-fos (SBF) (36, 38).
C-myc, downstream efektor Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)signálne dráhy u myší SBPkdlrAc. Aby sme získali prehľad o intracelulárnom patogenetickom mechanizme transgénnych myší SBPkdlrAg, ďalej sme sa snažili monitorovať hladinu renálnej expresie c-myc na základe nášho predchádzajúceho pozorovania deregulácie c-myc v ľudskom ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek)obličky(22). Analýza obličiek bola vykonaná zo všetkých troch transgénnych línií 3(n =4), 39(n =7) a 41 (n=4), ako aj kontrol (n=4). Ako je znázornené na obr. 3d, existuje podstatná expresia endogénneho c-myc indukovaného u myší SBPkd1TAG v porovnaní s kontrolnými myšami podobného veku. Je zaujímavé, že úroveň expresie c-myc v niektorých obličkách SBPkd{12}}c. najmä línia 39, dosiahli hladiny porovnateľné s hladinami pozorovanými v modeli transgénnej myši PKD SBM produkovanej renálnou expresiou c-myc.
Renálne anomálie u myší SBPkd1raG podobné PKD(polycystické ochorenie obličiek). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>6 pre každú líniu) sa vyvinuli mnohopočetné tubulárne (T) a glomerulárne cysty (G) (obr. 4d, f a g). Cysty boli pozorované v tubuloch z kortikálnej a medulárnej oblasti, ako aj v zberných tubuloch z papily (obr. 4d a e). Transgénne myši vykazovali tubulárnu epiteliálnu hyperpláziu (šípka) zahŕňajúcu cystické aj necystické tubuly a častú hypertrofiu (obr. 4g a h), ale závažnosť sa medzi jednotlivými myšami líšila. Často sa pozorovala intersticiálna fibróza (F), perivaskulárne lymfoidné infiltráty a proteínové odliatky (P) (obr. 4d a e).
Presnejšie definovať miesto lokalizácie zvýšeného Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)expresiu v obličkách sme uskutočnili in situ hybridizáciu s použitím predtým použitej exónovej 36-45 sondy (16). Hybridizačný signál bol lokalizovaný špecificky do epitelových buniek lemujúcich cysty a hyperplastické tubuly, ako aj glomerulárne cysty. Okrem toho bol pozorovaný určitý signál nad epitelom necystických alebo mierne rozšírených tubulov, pravdepodobne identifikujúcich tubuly predurčené na budúce cystické zmeny (obr. 4i a j).
Renálna histologická analýza sa uskutočnila aj na transgénnych myšiach pri narodení (n =8), 10. deň po narodení (P10) (n =3), P20 (n =5), P35 (n { {7}}) a P45(n=3) v porovnaní s negatívnymi súrodencami rovnakej vekovej skupiny (n 2 až 4). Je zaujímavé, že všetky novorodené transgénne myši vykazovali tubulárnu a glomerulárnu dilatáciu v porovnaní s kontrolnými negatívnymi súrodencami (obr. 4k a 1), čo naznačuje, že renálne anomálie sa začali in utero, ako bolo pozorované u myší SBM a ADPKD. (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek)pacientov. Tubulárna a glomerulárna dilatácia sa zväčšovala čo do veľkosti a počtu s postupujúcim vekom. Podľa P35 vykazovali transgénne myši závažnejšiu hyperpláziu a dôkaz glomerulosklerózy. Zmenené renálne fyziologické funkcie u myší SBPkd1TAG. Renálne fyziologické funkcie všetkých transgénnych myší vykazovali vlastnosti podobné PKD(polycystické ochorenie obličiek), zatiaľ čo u netransgénnych súrodencov sa toto ochorenie nikdy nerozvinulo. V priebehu niekoľkých mesiacov po narodení sa u postihnutých zvierat rozvinula chronická renálna insuficiencia. U týchto zvierat sa monitorovali funkčné parametre obličiek meraním hladín v sére a moči, dusíka močoviny v krvi (BUN) a kreatinínu, osmolality moču, proteínov v moči a vylučovania iónov (tabuľka 1). Všetky myši z troch línií v porovnaní s kontrolami vykazovali koncentračné defekty, bežný nález pri ADPKD, a následne vykazovali znížené koncentrácie BUN, kreatinínu, proteínu a železa v moči. Transgénni zakladatelia a potomkovia SBPkd1TAG (n 6) z každej línie sa kvalitatívne monitorovali na proteinúriu vo vzorkách moču pomocou SDS-PAGE (obr. 5). Myši staršie ako 2 mesiace vykazovali neselektívnu proteinúriu, ktorá progredovala s vekom. Okrem toho sa zvýšili hladiny sérového BUN a sérového kreatinínu, čo odhalilo renálnu insuficienciu (tabuľka 2). Pretože chronická renálna insuficiencia bežne vedie k zmenám hematologických parametrov, tieto sa skúmali na SBPkd1TAG transgénnych myšiach vo veku 3 až 14 mesiacov (tabuľka 2). Tieto transgénne myši boli anemické, o čom svedčí výrazne znížený počet červených krviniek, pričom hemoglobín a hematokrit dosahovali polovicu normálnych hladín. Ostatné parametre červených krviniek, ako je percento retikulocytov, neboli ovplyvnené, ako sa očakávalo, keď boli vyvolané poruchou obličiek. Tieto zvieratá pravidelne umierali na zlyhanie obličiek vo veku 5.9 2.8 mesiacov (n 42) pre transgénnu líniu 39 a neskôr vo veku 14.6 3.1 mesiacov (n 20) a 11 .7 6.5 mesiaca (n 7) pre riadky 3 a 41, v uvedenom poradí.
Obr. 1. Schematické znázornenie a podrobná analýza reštrikčnej mapy myšieho Pkd1-BAC.
Vzory štiepenia genómovej DNA Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)-BAC sa porovnávali s Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)lokus v 129Sv a C57Bl/6J inbredných kmeňoch myší. Bolo vyrobených sedem sond zahŕňajúcich väčšinu myšacieho génu Pkd1:
(a) exón 1, (b) exón 2-3, (c) exón 7-15, (d) exón 15-20, (e) exón 25-34, (f ) exón 36-45 a (g) exón 45-46, označené a až g na genómovom Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)reprezentácie a cez jednotlivé bloty.
Analýza Southern blot po reštrikčných štiepeniach (BamHI, EcoRI, HindIII a KpnI) genómovej DNA z Pkd{0}}BAC a myšieho Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)lokusy vykazovali identické vzory so všetkými siedmimi sondami. M, HindIII marker; 129, 129/Sv; C57, C57Bl/6J.
DISKUSIA
V tomto dokumente uvádzame izoláciu a charakterizáciu myšieho Pkd1-BAC. Tento Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)gén bol označený a regulačné elementy boli nahradené tak, aby sa expresia zacielila špecificky na obličky dvoma po sebe nasledujúcimi homologickými rekombináciami. Transgénne myši produkované týmto novým génom SBPkd1TAG vykazovali 2- až 15--násobné zvýšenie expresie Pkd1 a reprodukovateľne sa u nich vyvinuli skoré renálne morfologické zmeny typické pre PKD. Renálna insuficiencia je zjavná v strednom veku a myši umierajú predčasne na zlyhanie obličiek. Naše výsledky tiež naznačujú, že mechanizmus nadmernej expresie Pkd1 zodpovedný za tento fenotyp je sprostredkovaný signalizačnou aktiváciou c-myc in vivo. Táto štúdia ukazuje, že zvýšenie funkcie myšieho Pkd1 v obličkách je dostatočné na vytvorenie renálneho fenotypu PKD. Pretože myší gén Pkd1 nie je duplikovaný ako u ľudí (27), priamo sme identifikovali a izolovali klon BAC, ktorý obsahoval celý gén Pkd1. Kompletná charakterizácia 129/Sv myšacieho Pkd1-BAC, nepriame porovnanie s dvoma ďalšími inbrednými myšacími kmeňmi, potvrdilo integritu lokusu Pkd1. Inzert Pkd1-BAC obsahoval 37 až 39 kb upstream a downstream sekvencií od génu Pkd1. Naša analýza ukázala, že gén Pkd1 v tomto BAC bol bona fide myší lokus divokého typu, ktorý by mohol slúžiť na ďalšie štúdie. Hoci existujú silné dôkazy, že tvorba cysty pri ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek)môže byť výsledkom straty heterozygotnosti po somatickej inaktivácii normálnej PKD1(polycystická choroba obličiek 1)alely (3, 21, 32), existujú aj sugestívne dôkazy pre trvalú alebo dokonca zvýšenú expresiu polycystínu-1 v cystickom tubulárnom epiteli (22, 29). Posledné pozorovanie vyvoláva otázku, či nadmerná expresia Pkd1 per se je dostatočnou blízkou príčinou cystogenézy. U transgénnych myší nesúcich ľudský PKD1(polycystická choroba obličiek 1), TSC2, RAB 26, NTHL1 a SLC9A3R2 génov, len u menšiny myší sa vyvinuli cysty a žiadna z nich nemala detekovateľnú expresiu transgénu v dospelosti napriek 30 kópiám transgénu (31). U týchto transgénnych myší bolo ťažké stanoviť jasnú úlohu nadmernej expresie Pkd1 v cystogenéze. Náš model sa líši, pretože do transgénnych myší bolo integrovaných dve až deväť kópií samotného Pkd1 divokého typu, bez priľahlých génov. Pretože gén Pkd1 má základné funkcie v rôznych orgánoch alebo tkanivách, ako je opísané u mnohých myší s abláciou génu Pkd1, systémová nadmerná expresia Pkd1 by mohla viesť k ďalším mätúcim účinkom. V dôsledku toho sme sa zaoberali úlohou získania funkcie Pkd1 pomocou prístupu, ktorý sa zameriava na Pkd1 špecificky na obličky. Homológnou rekombináciou sme najprv nahradili Pkd1 upstream regulačnú oblasť s "SB" renálnymi obmedzenými regulačnými prvkami, čím sme zabránili zníženej génovej expresii normálne pozorovanej pre Pkd1 v dospelosti, ako aj potenciálnej sekundárnej regulácii slučky spätnej väzby (36, 38). Po druhé, označili sme myší transgén Pkd1 (Pkd1TAG) tichou bodovou mutáciou v exóne 10, ale nevložili sme epitopovú značku, aby sme zabezpečili, že sa vytvorí plne funkčný proteín „divokého typu“ so zachovanou štruktúrou a integritou. Z tohto modifikovaného BAC sa fragment SBPkd1TAG vyčistil od génu Tsc2 a vektora BAC, aby sa zabránilo interferencii génu Tsc2, ktorý môže tiež indukovať cystický fenotyp (8, 20, 28), ako aj aby sa zabránilo inhibičnému účinku prokaryotické sekvencie (5).
Štyri rôzne zakladajúce transgénne myši SBPkd1TAG a tri nezávislé línie boli vytvorené so špecifickým renálnym Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)- vylepšený výraz. Zvlášť pozoruhodná je úplná penetrácia fenotypu u týchto transgénnych myší. Zakladateľ a myšacie línie SBPkd1TAG zdieľali niekoľko fyziopatologických znakov spoločných s ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek). Tieto zahŕňajú vývoj cýst v kôre, dreni a glomerulách spolu s epiteliálnou hyperpláziou, intersticiálnou fibrózou a fokálnym intersticiálnym zápalom.
Pretože PKD(polycystické ochorenie obličiek)fenotyp bol konzistentne pozorovaný u všetkých rôznych transgénnych zakladateľských myší a integrácia transgénu do myšacieho genómu je náhodný jav, fenotyp nemôže vyplývať z účinku chromozomálnej polohy, ale iba zo zvýšenej expresie Pkd1. Ukázalo sa, že expresia Pkd1 transgénu vo všetkých líniách je obmedzená na obličky, ako bolo predtým pozorované pre iné transgény regulované prvkami "SB" (36, 38). Okrem toho bola táto zvýšená expresia Pkd1 spôsobená transgénom a nie nepriamou endogénnou aktiváciou Pkd1. Naše výsledky teda poskytujú jasný dôkaz, že zisk funkcie funkčného Pkd1 divokého typu môže produkovať viaceré obličkové cysty. Dôležité je, že tieto myši SBPkd1TAG tvoria prvý myšací model vytvorený jedinou nadmernou expresiou myšacieho ortológu ľudského génu PKD1.
Myši SBPkd1TAG demonštrujú, že Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)nadmerná expresia je primárnym patogenetickým mechanizmom cystogenézy obličiek. Dôležité je, že najvyššie hladiny expresie transgénu v obličkách zrejme korelujú s progresiou a závažnosťou fenotypu. Zistili sme tiež, že nadmerná expresia Pkd1 pri vývoji fenotypu SBPkd1TAG pravdepodobne signalizuje aktiváciu c-myc in vivo. Je možné, že táto aktivácia by mohla byť dokonca priama cez polycystín-1 C-terminálny chvost, ktorý prechádza proteolytickým štiepením a jadrovou translokáciou (7). Pretože sa ukázalo, že zvýšená renálna expresia c-myc u dospelých myší indukuje PKD, bolo by vysoko konzistentné podporovať c-myc ako hlavný downstream efektor signálnych dráh Pkd1. Tento výsledok tiež koreloval s našimi predchádzajúcimi zisteniami zvýšenej expresie c-myc v obličkách všetkých ľudských ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek)analyzované (22). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že c-myc je hlavným mediátorom Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)cystogenéza. Naše výsledky z modelu zosilnenia funkcie Pkd1 spolu s myšou haploinsuficienciou Pkd1 a stratou funkcie naznačujú, že akákoľvek dysregulácia Pkd1 by mohla viesť k cystogenéze (2, 19, 23–26, 31, 40).
Ťažké Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)nerovnováha u myší vyvolaná Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)ablácia alebo transgénna nadmerná expresia spôsobili skorý nástup a rýchlu progresiu renálnych cýst a ovplyvnili vysoký podiel tubulov. Naopak, miernejšia nerovnováha Pkd1, ako je haploinsuficiencia, viedla k pomalšej progresii PKD s viac fokálnymi cystami. Zjavný paradoxný vývoj podobného fenotypu prostredníctvom opačnej polycystínovej-1 dysregulácie možno vysvetliť spoločným výsledkom, konkrétne nerovnováhou relatívnej koncentrácie proteínov, ktorá by mohla zmeniť tvorbu alebo funkciu aktívneho polycystínového multiproteínového komplexu. Celkovo naše výsledky a výsledky iných výskumníkov tvrdia, že mechanizmus tvorby cysty v ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek)pravdepodobne vzniká z troch patogenetických mechanizmov: zisk funkcie, strata funkcie a účinky dávkovania génov. Nové myši SBPkd1TAG predstavujú výkonný model cystogenézy obličiek, ktorý môže poskytnúť hlavné poznatky o patofyziológii PKD(polycystické ochorenie obličiek), Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)signálnych transdukčných dráh a interagujúcich partnerov. Štúdium tohto modelu môže tiež viesť k vývoju nových terapeutických stratégií na obnovenie normálnej proteínovej rovnováhy v multimérnom komplexe Pkd1.
LITERATÚRA
1. Blouin, MJ, H.Beauchemin, A.Wright, MEDe Paepe, M.Sorette, A.-M. Bleau.B. Nakamoto. C.-N, Ou, G. Stamatovannopoulos a M. Trudel 2000. Genetická korekcia kosáčikovitej anémie: pohľady pomocou modelov transgénnych myší. Nat. Med. 6:{5}}.
2. Boulter, C., S. Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle a R. Sandford. 2001. Kardiovaskulárne, kostrové a obličkové defekty u myší s cieleným narušením Pkd1(polycystická choroba obličiek 1)gen.Proc. Natl. Akad. Sci. USA 98:{1}}.
3. Brasier, JL a EPHenske. 1997. Stratapolycystické ochorenie obličiek(PKD1) oblasť chromozómu 16p13 v obličkových cystových bunkách podporuje model straty funkcie pre patogenézu cysty. J. Clin. Investig.99:194-199.
4. Burn, TC, TD Connors, WRDackowski, LRPetry, TJVan Raay, JM Millholland, M. Venet, G.Miller, RM Hakim, GMLandes, KW Klinger, F. Qian, LF Onuchic, T.Watnick, GG Germino a NA Doggett. 1995. Analýza genómovej sekvencie preautozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek(PKD1) gén predpovedá prítomnosť repetície bohatej na leucín. Hum. Mol. Genet.4:575-582.
5. Chada, K, J.Magram, K. Raphael, G.Radice, E.Lacy a F.Costantini.1985. Špecifická expresia cudzieho -globínového génu v erytroidných bunkách transgénnych myší. Nature 314:377-380.
6. Chauvet, V, F. Qian, N. Boute, Y. Cai, B.Phakdeekitacharoen, LF Onuchic, T.Attie-Bitach, L.Guicharnaud, O.Devuyst, GG Germino a M.-C. Gubler.2002. Expresia PKD1(polycystická choroba obličiek 1)a PKD2(polycystické ochorenie obličiek 2)transkriptov a proteínov v ľudskom embryu a počas normálneho vývoja obličiek. Am. J. Pathol 160:973-983.
7.Chauvet, V., X. Tian, H.Husson, DHGrimm, T.Wang, T.Hiesberger, P. Igarashi, AM Bennett, O. Ibraghimov-Beskrovnava, S. Somlo a MJ Caplan.2004. Mechanické stimuly indukujú štiepenie a jadrovú translokáciu polycystín-1 C-konca. J. Clin. Vyšetrovať. 114:1433-1443.
8. Cheadle, JPMP Reeve, JR Sampson a DJ Kwiatkowski.2000. Molekulárne genetické pokroky pri tuberóznej skleróze. Hum. Genet.107:97-114. 9. Konzorcium, EPKD1993. Identifikácia a charakterizácia génu tuberóznej sklerózy na chromozóme 16. Bunka 75:1305-1315.
10. Konzorcium, EPKD1994. Gén polycystickej choroby obličiek 1 kóduje 14 kb transkript a leží v duplikovanej oblasti na chromozóme 16. Bunka 77:881-894.
11. Konzorcium, IPKD1995. Polycystická choroba obličiek: úplná štruktúra PKD1(polycystická choroba obličiek 1)gén a jeho proteín. Bunka 81:289-298.
12. Couillard, M., R. Guillaume, N. Tanji, V. DAgati a M. Trudel.2002. c-myc-indukovaná apoptóza pri polycystickej chorobe obličiek je nezávislá od interakcie FasL Fas. Cancer Res. 62:{5}}.
13. De Paepe, ME a M. Trudel.1994. Transgénna myš SAD: model ľudskej kosáčikovej glomerulopatie. Kidney Int. 46:{3}}.
14. Geng, L., Y. Segal, B. Peissel, N. Deng, Y. Pei, F. Carone, HGRennke, AM Glücksmann-Kuis, MC Schneider, M. Ericsson, STREeders a J.Zhou. 1996. Identifikácia a lokalizácia polycystínu, PKD1(polycystická choroba obličiek 1)génový produkt. J. Clin. Vyšetrovať. 98:{1}}.
15. Gong, S., XWYang, C. Li a N. Heintz. 2002. Vysoko účinná modifikácia bakteriálnych umelých chromozómov (BAC) pomocou nových kyvadlových vektorov obsahujúcich počiatok replikácie R6Ky. Genome Res. 12; 1992-1998.
