Ako transformujúci rastový faktor B1 (TGF 1) ovplyvňuje fibrózu obličiek

pre viac informácií:{0}}

Inhibícia signalizácie transformujúceho rastového faktora b1 v rezidentných intersticiálnych bunkách zoslabuje expresiu profibrotického génu a zachováva produkciu erytropoetínu počas experimentálnej fibrózy obličiek u myší

Michaela AA Fuchs, Katharina AE Broeker & a kol.

Fibróza obličiekje charakterizovaný vývojom myofibroblastov pochádzajúcich z rezidentných obličiek a imigrujúcich buniek. Tvorba myofibroblastov a produkcia extracelulárnej matrice počas poškodenia obličiek sú spúšťané rôznymi cytokínmi. Medzi týmito,transformujúci rastový faktor B1(TGF 1) sa považuje za centrálny spúšťač prefibróza obličiek. Zistili sme vysoko upregulovanú expresiu TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)a mRNA TGF receptora 2(TGF-R2) v obličkových intersticiálnych bunkách v experimentefibróza. Tu sme skúmali príspevok TGF 1 (transformujúci rastový faktor B1) signalizácia v intersticiálnych bunkách obličiek na orgánovú fibrózu pomocou modelov adenínom indukovanej nefropatie a jednostrannej ureterálnej oklúzie u myší. Na tento účel bola signalizácia TGFB1 prerušená indukovateľnou deléciou génu TGF-R2 v intersticiálnych bunkách exprimujúcich fibroblastový marker receptora rastového faktora odvodeného od krvných doštičiek-B. Expresia profibrotických génov bola oslabená až na 50 percent v obličkách bez TGF-R2 v bunkách pozitívnych na receptor rastového faktora-B odvodený od krvných doštičiek. Okrem toho delécia TGF-R2 zabránila poklesu produkcie erytropoetínu v obličkách podviazaných močovodom. Je pozoruhodné, že expresia x-aktínu hladkého svalstva spojená s fibrózou ako myofibroblastového markera a depozity extracelulárnych kolagénov neboli zmenené u myší s cielenou deléciou TGF-R2. Naše zistenia teda naznačujú zosilňujúci účinok TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)signalizácia v rezidentných intersticiálnych bunkách, ktoré prispievajú k expresii profibrotických génov a zníženiu produkcie erytropoetínu, ale nie k rozvoju myofibroblastov počasfibróza obličiek.

Kliknutím zobrazíte cistanche prášok zdravotné prínosy pri ochorení obličiek

Vývoj a progresiafibróza obličiekje charakteristickým znakom chronického ochorenia obličiek. Bežne sa považuje za výsledok zvýšenej produkcie a ukladania proteínov extracelulárnej matrice (ECM), ako sú kolagény, fibronektín alebo tenascíny. Prebiehafibróza obličiekvedie k progresívnemu poklesu glomerulárnej a tubulárnej funkcie a tiež obmedzuje endokrinné funkcie obličiek, čo vedie k nedostatočnej produkcii erytropoetínu (EPO), čo vedie k anémii.

Medzi cytokíny a signálne faktory, ktoré sa podieľajú na ochorení obličiek afibrózaprogresia,transformujúci rastový faktor 1(TGF 1) bol skúmaný v rôznych modeloch.6.0-1 TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)sa viaže na TGF receptor 2 (TGF-R2). Vytvorenie heteromérneho komplexu s TGF receptorom 1 je nevyhnutné pre intracelulárnu aktiváciu SMAD signálnej kaskády. i.1-18 V poškodených obličkách zvýšená expresia TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)mRNA v rôznych typoch obličkových buniek.1517,19-2lDôležitá úloha TGF 1 vobličkyfibrózabolo tiež načrtnuté zo zistení, že podávanie exogénneho TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)môže vyvolaťfibróza obličieka ten TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)protilátky môžu utlmiť experimentálne indukovanéfibróza,10.22-24Navyše, genetická delécia Smad2 alebo 3, vnútrobunkových efektorov pre TGF-R2, preukázala pozitívne účinky na vývojfibróza.1,1

Expresia TGF-R2 bola hlásená v mnohých typoch buniek, čo obmedzuje presnú informatívnu hodnotu zistení získaných pri všeobecnej interferencii globálneho TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)signalizácia. To môže vysvetliť aj niektoré kontroverzné správy z posledných rokov.1.1.2 TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)bolo tiež hlásené, že propagujeobličky fibrózazvýšením infiltrácie makrofágov, ktoré sa môžu transdiferencovať na myofibroblasty.

Avšak ústredná úloha TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)vobličkyfibrózabol nedávno napadnutý zistením, žeobličkyfibrózasa neznižuje blokovaním TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)signalizácia v bunkách aktívne produkujúcich matricové proteíny. Je dobre známe, že zvýšená produkcia matricových proteínov pochádza hlavne z myofibroblastov, ktoré sa môžu transdiferencovať od niekoľkých typov buniek vrátane fibroblastov, monocytov, pericytov a tubulárnych a endotelových buniek.6,10,2-32 Relatívny príspevok tieto typy buniek na populáciu myofibroblastov sa môžu líšiť v závislosti od experimentálneho modelu. Rastúci konsenzus však je, že rezidentné fibroblasty, pericyty a bunky odvodené z kostnej drene sú hlavnými prekurzormi myofibroblastov v obličkách a prispievajú kobličkyfibrózav podobnom pomere..102933-35 Rezidentné fibroblasty a pericyty exprimujú receptor rastového faktora odvodeného od krvných doštičiek (PDGFR- ) a sú jedným z najviac,31,36. Nedávna štúdia tiež početné typy buniek v obličkách. potvrdili bunky PDGFR-f ako hlavné prekurzory myofibroblastov v ľudských obličkách. Tieto PDGFR-f bunky tiež zahŕňajú všetky obličkové bunky schopné produkovať EpO,-9

Obličky fibrózaje spojená so zníženou schopnosťou obličiek produkovať EPO.-,3,0 Hoci dôvody na to neboli jasne vyriešené, predpokladá sa, že transformácia intersticiálnych buniek PDGFR-plus na myofibroblasty prebieha ruka v ruke so stratou ich schopnosti produkovať EPO. Vzhľadom na hlavnú úlohu intersticiálnych PDGFR-B buniek ako natívnych producentov EPO a ako prekurzorov myofibroblastov sme mali záujem definovať úlohu TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)signalizácie v tejto bunkovej populácii.

Na tento účel sme vytvorili myšací model s tamoxifénom indukovateľnou deléciou TGF-R2 v PDGFR-plus bunkách (PDGFR-CeERT7 plus TGF-R2/, ďalej označované ako TGF-R2ko myši). Po delécii TGF(transformujúci rastový faktor)-R2 v PDGFR-plus bunkách u dospelých myší, zvieratá boli študované v 2 experimentálnych modelochobličkyfibróza: jednostranná ureterálna oklúzia (UUO) a adenínom indukovaná nefropatia (AN). Nefropatia vyvolaná adenínom je model chronického poškodenia so silnými paralelami s patológiami vyvolanými ľudskými kryštálmi, zatiaľ čo UUO je model akútneho poškodenia mechanického stresu.2933,42- Použitie vysoko špecifickej hybridizačnej metódy RNAscope in situ umožnilo kolokalizáciu cieľové a markerové mRNA až po jednobunkové rozlíšenie. V týchto patologických modeloch sa skúmali účinky delécie TGFB-R2 v PDGFR-fbunkách na expresiu d-aktínu hladkého svalstva (a-SMA) ako markera tvorby myofibroblastov. Ďalej sme skúmali expresiu profibrotického génu a ukladanie ECM. Schopnosť obličiek produkovať EPO v stave experimentuobličky fibrózabol hodnotený meraním plazmatických hladín EPO a počtu a lokalizácie buniek exprimujúcich EPO mRNA v poškodených obličkách.

METÓDY

Zvieratá

TGF-R2lo myši boli vytvorené krížením myší PDGFR-cexr2 (expresia tamoxifénom indukovateľnej Cre rekombinázy pod kontrolou PDGFR- promótora; JAX zásoba č. 029684) a myši s TGF označeným loxP6- Alely R2 (IAX zásob #012603) na zmiešanom pozadí C57BJ/6 a 129S1/SvmJ." Na sledovanie línie dvojitý fluorescenčný reportér skonštruoval mT/mG(B6129(G)-Gt(ROSA)26Sorm4AcCTB-dromute.IGFLm JAX zásoba #007676) sa vyšľachtila do myší TGF-R2ko. Genotypizácia sa uskutočnila s použitím primérov uvedených v tabuľke 1. Ako kontrolné zvieratá sa použili súrodenci negatívni na Cre. Zvieratá boli chované na štandardnom krmive pre hlodavce (0,6 % NaCl; Ssniff) s voľným prístup k vode z vodovodu Všetky pokusy na zvieratách sa uskutočňovali podľa Príručky pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat publikovanej americkým Národným inštitútom zdravia a schválenej miestnou etickou komisiou.

Liečba tamoxifénom

Rekombinácia Cre bola vyvolaná podávaním stravy obsahujúcej 400 mg citrátu tamoxifénu na kilogram (A115T00404, Sniff) počas 4 týždňov, po ktorých nasledovalo 3-týždňové obdobie so štandardnou potravou. Excízia floxovaného génu TGF-R2 bola potvrdená polymerázovou reťazovou reakciou,

Nefropatia vyvolaná adenínom

Indukované adenínomfibrózabol generovaný u dospelých myší. Po liečbe tamoxifénom a nasledujúcom období odpočinku sa samcom myší podávala strava obsahujúca adenín (0,2 percenta) nepretržite počas 3 týždňov. Experimenty sa uskutočnili presne po 3 týždňoch (3-týždeň adenínu).

In situ hybridizácia cez RNAscope

Lokalizácia expresie mRNA bola študovaná pomocou súpravy RNAscope Multiplex Fluorescent v2 kit (Advanced Cell Diagnostics ACD) podľa pokynov výrobcu. Obličky boli perfúzne fixované 10 percentným neutrálnym pufrovaným formalínovým roztokom, dehydratované v sérii etanolu a zaliate do parafínu. Hybridizačné signály boli detegované na 5-μm tkanivových sedimentoch pomocou TSA Plus fluorofórov Cy3 a Cy5 (PerkinElmer). Rezy boli pripevnené pomocou ProLong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a prezerané mikroskopom Axio Observer Z1 (Zeiss). Pozitívne a negatívne kontroly boli bežne priložené. Sondy RNAsape sú uvedené v tabuľke 2

Tabuľka 1|Primérové ​​sekvencie používané na genotypizáciu myší

VÝSLEDKY

TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)a TGF(transformujúci rastový faktor)Expresia -R2 v intersticiálnych bunkách je zvýšená počas experimentálneho ochorenia obličiek

Lokalizácia expresie mRNA TGFB1 a TGFB-R2 v obličkách za základných podmienok a počas experimentufibrózasa uskutočnila pomocou RNAscope in situ hybridizácie. Za základných podmienok bola expresia mRNA TGFB-R2 detegovaná v tubulointersticiálnych PDGFR-B bunkách vo všetkých zónach obličiek a v glomerulárnych mezangiálnych bunkách (obrázok 1 vľavo). TGF-R2 bol tiež detegovaný v proximálnych tubuloch; expresia v iných tubulárnych segmentoch bola nižšia (doplnkové obrázky S1 a S2).

Tabuľka 2|Sondy RNAscope používané na hybridizáciu in situ

TGFb1(transformujúci rastový faktor B1)mRNA bola lokalizovaná v intersticiálnych PDGFR-bþ bunkách vo všetkých obličkových zónach a v glomerulárnych mezangiálnych bunkách (obrázok 1). Tubuly sa javili negatívne na TGFb1 mRNA. To implikuje bunky PDGFR-plus ako hlavné expresné miesto pre TGF1(transformujúci rastový faktor B1)v obličkách za bazálnych podmienok.

Tabuľka 3|Primérové ​​sekvencie používané na kvantitatívnu polymerázovú reťazovú reakciu

Po 3 týždňoch na adenínovej diéte (AN) alebo 5-dni UUO, obličkový TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)a hladiny expresie mRNA TGF-R2 boli silne zvýšené u kontrolných myší (obrázok 2).

Zvýšená expresia TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)a TGF-R2 po AN alebo UUO bol lokalizovaný pomocou RNAscope. Prostredníctvom kolokalizácie markerov špecifických pre bunkový typ sme mohli identifikovať typy obličkových buniek vykazujúce upreguláciu TGF-R2 počas poškodenia obličiek (obrázok 3; doplnkové obrázky S2 a S3). V AN bola expresia mRNA TGF-R2 silne zvýšená v intersticiálnom PDGFR- plus bunky vo fibrotických oblastiach (obrázok 3a). Poškodené tubuly so zvýšenou expresiou TGF-R2 sa objavili so splošteným epitelom a boli obklopené bunkami PDGFR-plus so silným TGF-R2 a TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)signály mRNA (obrázok 3a a c, šípky; doplnkový obrázok S2). Tubuly so zvýšenými signálmi TGF-R2 vykazovali de novo TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)Expresia mRNA (obrázok 3c; doplnkový obrázok S3).

V obličkách UUO boli zvýšené signály pre mRNA TGF-R2 detegované v intersticiálnych bunkách zostávajúcej vonkajšej drene (obrázok 3b) a kôry (doplnkový obrázok S2). Tieto bunky PDGFR-plus tiež vykazovali zvýšené signály pre TGF1(transformujúci rastový faktor B1)(Obrázok 3d).

V súhrne tieto zistenia naznačujú silnú aktiváciu TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)signalizácia medzi intersticiálnymi PDGFR-plus bunkami a poškodenými tubulmi počas experimentálneho poškodenia obličiek.

Obrázok 1|Bazálna expresia mRNA (vľavo) transformujúceho rastového faktora b receptora 2 (TGFb-R2) a (vpravo) transformujúceho rastového faktora b1 (TGFb1) na obličkových rezoch myší divokého typu.

Indukovateľná delécia TGF-R2 v bunkách PDGFR-plus zoslabuje expresiu profibrotického génu počas experimentálneho ochorenia obličiek

Analyzovať význam TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)signalizáciu funkcie buniek PDGFR-plus sme skúmali dospelé myši TGF-R2ko. Bazálna expresia TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)bol nezmenený po delécii TGF-R2 v intersticiálnych bunkách obličiek (obrázok 2). Expresia TGF-R2 mRNA bola významne znížená u knockoutovaných zvierat (obrázok 2). Zvyšková expresia bola spôsobená tubulárnou expresiou TGF-R2 (obrázok 1). Morfológia obličiek sa u myší TGF-R2ko nelíšila až 8 týždňov po delécii TGF-R2.

Pozorované zvýšenie expresie TGF-R2 počas AN a UUO bolo významne znížené v obličkách TGF-R2ko v porovnaní s kontrolnými obličkami (obrázok 2). TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)expresia bola výrazne znížená až po AN.

Histologická štúdia fosforylovaného SMAD3 ukázala zníženú translokáciu transkripčného faktora do jadra a-SMAþ intersticiálnych buniek u zvierat TGFb-R2ko, čo naznačuje narušenú signalizáciu TGFb1 po úspešnej delécii TGFb-R2 sprostredkovanej Cre (obrázok 4).

Obrázok 2|Transformácia hojnosti mRNA rastového faktora b1 (TGFb1) a TGFb receptora 2 (TGFb-R2) v kontrolných obličkách a obličkách s tamoxifénom indukovateľnou deléciou TGFb-R2 v bunkách pozitívnych na receptor rastového faktora odvodeného od krvných doštičiek b (TGFb-R2ko) pod bazálom a patologických stavov.

Indukovateľná delécia TGFb-R2 v bunkách PDGFR-bD zmierňuje expresiu profibrotického génu počas experimentálneho ochorenia obličiek

Počasfibrózaprodukcia komponentov matrice sa zvyšuje, čo vedie k rozsiahlemu ukladaniu ECM a tvorbe jaziev. Na posúdenie možnej úlohy TGF 1(transformujúci rastový faktor B1)signalizáciu v rezidentných PDGFR-Bf bunkách na produkciu matrice sme porovnali génovú expresiu fibrotických markerov medzi kontrolnými a TGF-R2ko myšami.

Podávanie adenínu a UUO viedli k -25-násobnému zvýšeniu Collal mRNA v kontrolných obličkách. Zatiaľ čo v obličkách TGF-R2ko sa zvýšenie mRNA obojku znížilo o -50 percent v porovnaní s kontrolami (obrázok 5). Podávanie adenínu a UUO tiež viedli k výraznému zvýšeniu mRNA kolagénu 3al a fibronektínu. Zvýšenia oboch mRNA boli tiež významne oslabené v obličkách TGF-R2ko.

KLIKNITE SEM PRE PART Ⅱ

LITERATÚRA

1. Schimdf C. Duffield JS.Mechanisms offibróza: roke pericytu. Curr Opin Nephrol Hoertens.2011:20297-305.

2. Neelisetty S, Aford C. Reynalds K, a kol. Renálnafibrózasa neznižuje blokovaním signalizácie transformujúceho rastového faktora v intersticiálnych bunkách produkujúcich matricu. Kidney Int. 201588:503-514.

3. Bülow RD, Boor P.Extracelulárna matrica vfibróza obličiek: viac ako len lešenie. J Histochem Cytochem. 2019; 67643-661.

4. Humphreys BD. Mechanizmy renálnej fibrózy. Annu Rey PhysioL201880: 309-326.

5. Maxwell PH, Ferguson DJP, Nicholls LG a kol. Intersticiálna odpoveď na bunky podobné fibroblastom pri poškodení obličiek vykazuje fenotypové zmeny a má znížený potenciál na expresiu génu erytropoetínu. Kidney Int. 1997; 52.715-724.

6. Souma T, Yamazaki S, MoriguchiT, et al. Plasticita obličkových buniek produkujúcich erytropoetín riadifibróza. J Am Soc Nephrol, 2013;24:1599-1616.

7. Babit 儿L, Lin HY. Mechanizmy anémie pri CKD. JAm Soc Nephrol. 2012:23:1631-1634.

8. Eschbach JW, Adamson JW. Anémia konečného štádia renálneho ochorenia (ESRD). Kidney Int. 1985; 28:1-5.

9. Broeker KAE, Fuchs MAA, Schrank J a kol. Rôzne subpopulácie obličkových intersticiálnych buniek produkujú erytropoetín a faktory podporujúce okysličenie tkaniva v reakcii na hypoxiu in Vivo. 2020; 98:918-931.

10. Falke LL, Gholizadeh S, Goldschmedinq R et al Rôzne počiatky myofibroblastov – dôsledky prefibróza obličiek. Nat Rey Nephrol. 2015; 11:233-244.

Poznámka: Vyššie uvedené nie je úplný zoznam referencií