Ako exprimovať ľudský defenzín v ľudských obličkách a močových cestách 5

Ďalšie informácie:{0}}

John David Spencer a kol

Abstraktné

Pozadie:Mechanizmy, ktoré udržujú sterilitu v močovom trakte, nie sú úplne pochopené. Nedávne štúdie preukázali dôležitosť antimikrobiálnych peptidov (AMP) pri ochrane močového traktu pred infekciou. Tu charakterizujeme expresiu a význam AMP ľudského alfa-defenzínu 5 (HD5) u ľudí.obličkya močového traktu u normálnych a infikovaných jedincov.

Metodológia/hlavné zistenia:Použitie RNA izolovanej z človekaobličky, močovodu a tkaniva močového mechúra sme vykonali kvantitatívnu PCR v reálnom čase, aby sme ukázali, že DEFA5, gén kódujúci HD5, je konštitutívne exprimovaný v celom močovom trakte. Pri pyelonefritíde sa expresia DEFA5 významne zvýšila vobličky. Použitím imunoblotovej analýzy sa produkcia HD5 zvýšila aj s pyelonefritídou. Imunofarbenie lokalizovalo HD5 do urotelu močového mechúra a močovodu. V obličkách sa HD5 primárne produkoval v distálnom nefrone a zberných tubuloch. Použitím testov immunoblot a ELISA sa HD5 rutinne nezistil vo vzorkách neinfikovaného ľudského moču, čo znamená, že produkcia HD5 v moči sa zvýšila s infekciou močových ciest E. coli.

Závery/Význam:DEFA5 je exprimovaný v močovom trakte u neinfikovaných jedincov. Konkrétne je HD5 exprimovaný v celom uroteli dolných močových ciest a v zberných tubulochobličky. S infekciou sa expresia HD5 zvyšuje vobličkya hladiny sa stanú detekovateľné v moči. Pokiaľ je nám známe, naše zistenia predstavujú prvé, ktoré kvantifikuje expresiu a produkciu HD5 v ľudských obličkách. Okrem toho je to prvá správa, ktorá zistila prítomnosť HD5 vo vzorkách infikovaného moču. Naše výsledky naznačujú, že HD5 môže mať dôležitú úlohu pri udržiavaní sterility močových ciest.

Cistanche UK pre ochorenie obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

Úvod

Močové cesty, okrem uretry, sú zvyčajne sterilné napriek blízkosti s fekálnou flórou. Presné mechanizmy, ktorými si močové cesty udržiavajú svoju sterilitu, nie sú dobre známe. Medzi navrhované mechanizmy prispievajúce k obrane močového traktu patrí prietok moču, zmeny pH a osmolarity moču, pravidelné vyprázdňovanie močového mechúra, chemické obranné zložky uroepitelu a epitelové vylučovanie/príliv efektorových imunitných buniek s bakteriálnou stimuláciou [1]. Okrem toho sa nedávno ukázalo, že antimikrobiálne peptidy (AMP) majú dôležitú úlohu pri udržiavaní sterility močových ciest [2]. AMP, ktoré slúžia ako prírodné antibiotiká produkované takmer všetkými organizmami, sú všadeprítomnou súčasťou vrodeného imunitného systému. AMP sú katiónové molekuly exprimované fagocytárnymi bielymi krvinkami a epitelovými bunkami. U ľudí a iných cicavcov sú defenzíny hlavnou rodinou AMP. Defenzíny majú typicky širokospektrálnu antimikrobiálnu aktivitu proti grampozitívnym a gramnegatívnym baktériám, vírusom, hubám a prvokom [2,3]. Defenzíny sa spočiatku syntetizujú ako preproproteíny a prechádzajú spracovaním na zrelé, biologicky aktívne peptidy [4]. U ľudí sú defenzíny zaradené do jednej z dvoch rodín v závislosti od ich vzoru disulfidového mostíka – alfa-defenzíny alebo beta-defenzíny [5].

V močovom trakte sú beta-defenzíny široko exprimované v uroepiteli. Epitelové bunky lemujúceobličkyHenleho slučka, distálny tubul a zberný kanálik konštitutívne exprimujú ľudský beta-defenzín 1 (hBD1). Hoci hladiny hBD1 v moči nie sú dostatočné na ničenie inváznych baktérií, hBD1 poskytuje rýchlo pôsobiaci antimikrobiálny povlak tubulárnych lúmenov a zabraňuje infekcii inhibíciou prichytenia baktérií na urotel [6]. Nedávne štúdie naznačujú, že redoxný stav hBD1 významne ovplyvňuje antimikrobiálnu účinnosť, takže redukovaný peptid je oveľa účinnejší ako oxidovaná forma s disulfidovou väzbou [7]. Význam tohto na uroteliálnom povrchu nebol stanovený. Ďalší defenzín, ľudský beta-defenzín 2 (hBD2) nie je konštitutívne exprimovaný v zdravom tkanive obličiek; expresia hBD2 je však indukovaná infekciou [8].

Na rozdiel od beta-defenzínov nie je úloha alfa-defenzínov odvodených z epitelu v močovom trakte dobre opísaná. Expresia a funkcia alfa-defenzínov HD5 a HD6 bola väčšinou zaznamenaná v tenkom čreve, kde sú vylučované Panethbunkami do črevných krýpt a prispievajú k rovnováhe črevnej mikrobioty [9]. HD5 bol tiež lokalizovaný v mužskom a ženskom pohlavnom trakte, pričom dôkazy naznačujú, že je indukovateľný a dôležitý pri eradikácii infekcie [10,11,12]. Močový HD5 bol detegovaný u pacientov, ktorí podstúpili rekonštrukciu ilea a diverziu močovej trubice ilea, pričom zdroj produkcie HD5 bol primárne pripísaný ileálnym Panethovým bunkám [13,14]. HD5 má antibakteriálnu aktivitu proti bežným uropatogénnym grampozitívnym baktériám a gramnegatívnym baktériám [15]. HD5 má tiež antimikrobiálnu aktivitu proti uropatogénnym vírusom, ako je adenovírus a BK vírus [16,17,18]. V tejto štúdii poskytujeme počiatočný popis a kvantifikáciu expresie HD5 u človekaobličkya ďalej definovať jeho expresiu v dolných močových cestách počas sterility a infekcie.

Výsledky

DEFA5 mRNA je konštitutívne exprimovaná v ľudskom močovom mechúre, močovode a obličkách

Kvantitatívna PCR v reálnom čase ukazuje, že všetky testované vzorky močového mechúra, močovodu a obličiek bez infekcie konštitutívne exprimovali DEFA5. Expresia DEFA5 bola významne vyššia v dolných močových cestách ako v horných močových cestách (p= 0.014). V močovom mechúre (n=4) bola priemerná expresia DEFA5 4 656 637 transkriptov na 10 ng RNA a v močovode (n=4) bola priemerná expresia DEFA5 4 112 6170 transkriptov na 10 ncRNA (obrázok 1A) . V obličkách (n=6) bola priemerná expresia DEFA5 2,9376274 transkriptov na 10 ng RNA. Expresia DEFA5 sa analyzovala oddelene v obličkovej kôre, dreni a panve. Expresia DEFA5 sa významne nelíšila podľa oblasti obličiek (p= 0.45).

Expresia DEFA5 a expresia peptidu HD5 sa zvyšuje s pyelonefritídou

Kvantitatívna PCR analýza v reálnom čase vykonaná na obličkových tkanivách s pyelonefritídou preukázala významné zvýšenie expresie DEFA5 v porovnaní s neinfikovanými obličkovými tkanivami. Pri pyelonefritíde (n= 6) sa priemerná expresia DEFA5 zvýšila na 7 82961 052 transkriptov na 10 ng RNA (p= 0,019) (obrázok 2A).

Na ďalšie vyhodnotenie tohto zvýšenia expresie s pyelonefritídou sme vykonali imunoblotovú analýzu na rovnakom tkanive obličiek, ktoré sa používa na analýzu PCR v reálnom čase, aby sa vyhodnotilo súbežné zvýšenie produkcie peptidu HD5 (obrázok 2B, stredný panel). Imunoblotová analýza s použitím polyklonálnych antisér HD5 preukázala významne vyššiu produkciu peptidu HD5 v obličkových tkanivách s pyelonefritídou (n=6) v porovnaní s neinfikovanými obličkovými tkanivami (n=6). Neinfikované obličkové tkanivá exprimovali 300625 ng HD5/gram hmotnosti vlhkého tkaniva, zatiaľ čo obličkové tkanivo s pyelonefritídou exprimovalo 600621 ng HD5/gram hmotnosti vlhkého tkaniva (p,0,0001). Bloty sa znovu sondovali pomocou GAPDH, aby slúžili ako kontrola nanášania (obrázok 2B, stredný panel) a vykonalo sa aj strieborné farbenie, aby sa potvrdilo rovnaké zaťaženie proteínom (obrázok 2B, horný panel).

HD5 peptid je produkovaný v ľudských obličkách a močovom trakte

Imunofarbenie sa uskutočnilo na lokalizáciu produkcie HD5 v močovom trakte. Imunohistochémia (IHC) ukázala, že imunoreaktivita HD5 bola prítomná v celom uroteli močovodu a močového mechúra všetkých skúmaných vzoriek (n=4, obrázok 3). IHC tiež ukázala, že HD5 sa produkoval v tubuloch obličkovej kôry a drene všetkých vzorky (n= 6, obrázok 4). Imunofluorescencia (IF) preukázala, že expresia HD5 bola najväčšia v distálnom nefróne a zberných tubuloch (obrázok 5). Interstícium a glomeruly nevykazovali imunoreaktivitu HD5. Imunofarbenie znázornené na obrázkoch 3, 4 a 5 sa uskutočnilo s použitím myšej monoklonálnej anti-HD5 protilátky (8C8), ktorá rozpoznáva HD5 propeptid (Abcam, Cambridge, MA). Výsledky boli podobné pri použití králičej polyklonálnej anti-HD5 protilátky, ktorá rozpoznáva HD5 propeptid a zrelý peptid (údaje nie sú uvedené) – čo naznačuje, že HD5 je uložený ako propeptid.

Pri pyelonefritíde sa imunofarbenie HD5 výrazne zvýšilo. Imunoreaktivita HD5 sa zvýšila v celom proximálnom nefróne, distálnom nefróne a zberných tubuloch (obrázok 4 a obrázok 5). Rovnako ako v neinfikovaných vzorkách, glomeruly a interstitium nevykazovali žiadnu expresiu HD5 s infekciou. Negatívne kontroly nevykazovali žiadnu imunoreaktivitu HD5.

Infikovaný ľudský moč obsahuje merateľné

koncentrácie peptidu HD5

Imunoblotová analýza s použitím králičieho polyklonálneho antiséra, ktoré deteguje prekurzor proHD5 a ďalej spracované formy, identifikovali merateľné hladiny HD5 v 13 z 15 testovaných vzoriek moču infikovaných uropatogénnymi E. coli (obrázok 6A a B). Ak sú prítomné, hladiny HD5, normalizované na kreatinín v moči, sa pohybovali od 299,8 – 669,7630 ng HD5/mg Cr v moči (110,67 ng/ml – 276,67 ng/ml), čo zodpovedá 11,10 – 27,67 nmol/l. Vo vzorkách infikovaného moču (n=15) bol HD5 na alebo pod detekčným limitom (,50 ng). Enzýmová imunoanalýza (ELISA) na rovnakých vzorkách moču s použitím myšacej monoklonálnej protilátky (8C8), ktorá deteguje iba prekurzor proHD5, zistila merateľné hladiny proHD5 v 13 z 15 testovaných infikovaných vzoriek. Koncentrácie proHD5 v moči sa pohybovali od 122,78 – 490,060,03 ng HD5/mg Cr v moči (30,02 ng/ml – 200,5 ng/ml), keď bol prítomný (obrázok 7).

Diskusia

V tejto štúdii poskytujeme počiatočnú charakterizáciu HD5 v ľudských obličkách, močovode a močovom mechúre. Ukázalo sa, že HD5 je dôležitý AMP, ktorý zabraňuje invazívnej infekcii v čreve a je up-regulovaný v genitálnom trakte počas infekcie [11,18,19,20,21]. Ukázalo sa, že AMP odvodené z epitelu, ako je HD5, sú dôležité pri udržiavaní sterility v močovom trakte [8,22,23,24]. Nedostatky v tejto vrodenej slizničnej obrane môžu viesť k akútnej a/alebo chronickej infekcii [25,26].

Naše kvantitatívne výsledky PCR v reálnom čase ukazujú, že DEFA5 sa konštitutívne exprimuje v ľudských obličkách, močovodov a močovom mechúre. Expresia DEFA5 sa zvyšuje z horných močových ciest do dolných močových ciest – po prúdení močového prúdu a zvyšujúcej sa blízkosti k miestu invázie mikrobioty. Pokiaľ je nám známe, toto je prvá štúdia na kvantifikáciu expresie DEFA5 v ľudských obličkách a močovom mechúre. Townes et al nedávno preukázali, že normálny distálny ureter môže exprimovať DEFA5 [14]. Naše výsledky tiež naznačujú, že DEFA5 je konštitutívne exprimovaný distálnym močovodom. Hoci expresia DEFA5 v močovom trakte je takmer 100-krát nižšia ako v gastrointestinálnych tkanivách, bazálna uroepiteliálna expresia DEFA5 je porovnateľná s expresiou predtým opísaných zosilňovačov močových ciest, ako je katelicidín, hBD-1, hBD -2 a ribonukleáza 7[6,8,22,24,27]. Na rozdiel od zrelého gastrointestinálneho traktu, kde sa DEFA5 exprimuje vo vysokých hladinách pri zdravotnom stave aj pri infekcii/zápale, naše kvantitatívne údaje v reálnom čase Údaje z PCR ukazujú, že expresia DEFA5 v obličkách je významne upregulovaná infekciou [27,28,29]. Tento indukovateľný vzor expresie je analogický s expresiou DEFA5 v ženskom reprodukčnom trakte, kde sa expresia DEFA5 zvyšuje so salpingitídou [30]. V močovom trakte Townes et al preukázali trend smerom k väčšej ureterálnej expresii DEFA5 u pacientov s UTI, ktorí podstúpili deriváciu moču z ileálneho konduitu [14].

Naša imunoblotová analýza dopĺňa údaje PCR v reálnom čase tým, že demonštruje, že produkcia peptidu HD5 sa zvyšuje s pyelonefritídou. Tento indukovateľný vzor produkcie HD5 je podobný tomu, ktorý sa pozoruje u niektorých členov rodiny beta-defenzínov. hBD2 vykazuje indukovateľný vzor produkcie s infekciou močového traktu a/alebo chronickou pyelonefritídou [8,31,32]. Ukázalo sa, že produkcia HD5peptidu sa zvyšuje v hornom ženskom pohlavnom trakte a mužskej močovej rúre so zápalom [11,30].

Pomocou imunofarbenia sme demonštrovali, že HD5 sa rovnomerne produkuje v celom uroteli močovodu a močového mechúra. Pretože prevažná väčšina UTI je výsledkom fekálnej flóry, ktorá stúpa do močového mechúra, tieto výsledky naznačujú, že expresia HD5 je prítomná v miestach, kde sa najčastejšie vyskytuje mikrobiálna expozícia [33]. Preto je HD5 ideálne umiestnený, aby zabránil vzostupnej mikrobiálnej infekcii. V obličkách je HD5 primárne produkovaný v distálnom nefrone a zbernom tubule. Tieto zistenia naznačujú, že HD5 sa produkuje na miestach, kde bude umiestnený tak, aby mal optimálnu antimikrobiálnu aktivitu. Predchádzajúce štúdie ukázali, že antimikrobiálne vlastnosti defenzínov závisia od koncentrácie soli – pričom vyššie koncentrácie soli znižujú antimikrobiálnu aktivitu [23,34,35]. Predpokladáme, že nízke koncentrácie soli distálneho nefrónu a zberných tubulov poskytujú priaznivé prostredie pre antimikrobiálnu aktivitu HD5.

Imunoblot a analýza ELISA tiež ukazujú, že HD5 sa vylučuje do moču v nízkych hladinách. Vzhľadom na veľkosť (8,1 kDa a 3,7 kDa) a kladný náboj proHD5 a plne spracovaného HD5 je možné, že niektoré peptidy HD5 v moči pochádzajú, aspoň čiastočne, z plazmatického filtrátu. Napriek tomu existuje len málo dôkazov o tom, že HD5 pretrváva v plazme [27]. Okrem toho, aby sa HD5 objavil v moči, musel by uniknúť účinným mechanizmom absorpcie peptidov v proximálnom tubule [6,36]. Nakoniec boli použité vzorky moču pred vykonaním testov odstredené, čím sa odstránili bunkové zdroje HD5. Pri zistených koncentráciách je nepravdepodobné, že by močový HD5 bol priamo antimikrobiálny proti uropatogénnym mikroorganizmom, keďže plne spracovaný HD5 má minimálnu inhibičnú koncentráciu (MIC) medzi 6–10 mg/ml proti bežným gramnegatívnym uropatogénnym baktériám [15]. Avšak povrchové koncentrácie slizníc budú pravdepodobne vyššie. Okrem toho imunoblotová analýza ukazuje, že koncentrácie HD5 sú významne vyššie v obličkách. Tieto výsledky naznačujú, že HD5 sa podieľa na slizničnej obrane močového traktu. Analogický profil je pozorovaný pri hBD1, kde koncentrácie hBD1 v moči nie sú dostatočné na to, aby vykazovali antimikrobiálnu aktivitu, ale vyššie koncentrácie peptidov sa detegovali v blízkosti renálnych tubulov [6,31].

Pretože IHC demonštruje, že proHD5 je hlavnou formou HD5 v obličkách a pretože zrelý aj proHD5 sa detegujú v moči, predpokladáme, že HD5 sa primárne vylučuje ako prekurzorová molekula a potom podlieha proteolytickému spracovaniu, aby sa vytvorili zrelé formy – podobné gastrointestinálnym a genitourinárne trakty [11,30,37]. V tenkom čreve Panethove bunky produkujú trypsín, ktorý štiepi propeptid HD5, takže plne spracovaný peptid je prevládajúcou formou v lúmene čreva [37]. V mužskej močovej rúre sú kľúčovými spracovateľskými a aktivačnými enzýmami pre HD5 neutrofilné proteázy, na ktorých sa podieľajú

neutrofily regrutované do miesta infekcie [11]. Príspevok epitelového trypsinogénu, urinárneho trypsínu a/alebo neutrofilných proteáz na spracovaní HD5 v močovom trakte počas infekcie je potrebné určiť. Okrem toho je potrebné určiť aj účinky zmien v močovom prostredí na funkciu HD5 (zmeny osmolarity, pH a katiónových koncentrácií).

Na záver, toto je prvá štúdia na identifikáciu a kvantifikáciu expresie a produkcie HD5 v močovom trakte. Naše výsledky naznačujú, že HD5 je AMP odvodený od epitelu, ktorý môže hrať dôležitú úlohu vo vrodenej imunite ľudského uroepitelu, ktorá bráni translokácii inváznych patogénov do obehu. Objasnenie faktorov, ktoré regulujú produkciu HD5, môže poskytnúť nový pohľad na patogenézu UTI u pacientov s rizikom UTI a pacientov s chronickými infekciami.

Metódy

Schválenie štúdie

Informovaný písomný súhlas bol získaný od všetkých pacientov, ktorí sa zúčastnili tejto štúdie. Pre subjekty mladšie ako 18 rokov sa získal písomný súhlas rodičov/zákonných zástupcov. Inštitucionálna hodnotiaca rada NationwideChildren's Hospital (NCH) schválila túto štúdiu spolu s procesom súhlasu a dokumentmi (IRB07-00383).

Vzorky ľudského tkaniva a moču

Neinfikované tkanivo distálneho močovodu a močového mechúra (n= 4) sa získalo od detí podstupujúcich opätovnú implantáciu močovodu z iných dôvodov, ako je rekurentná infekcia. Vzorky neinfikovaných obličiek (n=6) boli získané od pacientov, ktorí podstúpili nefrektómiu pre nádory obličiek. Vzorky tkaniva boli bez makroskopických príznakov ochorenia alebo zápalu. Obličkové tkanivo od pacientov s chronickou pyelonefritídou poskytla Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Dvaja nezávislí patológovia potvrdili histopatologickú diagnózu pyelonefritídy. Vzorky tkaniva boli rýchlo zmrazené alebo konzervované ako neutrálne formalínom fixované rezy zaliate parafínom. Pred uskladnením boli rezy neinfikovaného obličkového tkaniva vyrezané do kôry, drene alebo obličkovej panvičky (n=4).

Neinfikované a infikované vzorky moču boli získané od detí, ktoré sa dostavili na pohotovosť NCH alebo na nefrologickú kliniku. Diagnóza UTI bola stanovená na základe pozitívnej kultivácie moču podľa American Academy of PediatricsGuidelines [39]. Všetky infikované vzorky moču mali.106 CFU/ml E.coli. Hodnoty pH moču sa pohybovali od 5,5 do 8,5 (priemer moču 6,9). Iónové zloženie v moči nebolo merané. Vzorky moču sa centrifugovali, aby sa odstránil močový sediment, a pridal sa koktail inhibítora proteázy (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).