Ľudské amniotické mezenchymálne kmeňové bunky zmierňujú AGVHD po Allo-HSCT reguláciou interakcií medzi črevnou mikrobiotou a črevnou imunitou

Abstraktné

Akútna choroba štepu proti hostiteľovi (aGVHD) po alogénnej transplantácii hematopoetických kmeňových buniek predstavuje jednu z najnepríjemnejších výziev. Dysbióza črevnej mikroflóry môže pokračovať s aGVHD a mezenchymálne kmeňové bunky (MSC) majú sľubný terapeutický potenciál pre aGVHD. Či však hAMSC ovplyvňujú črevnú mikrobiotu počas zmierňovania aGVHD, zostáva neznáme. V súlade s tým sme sa snažili definovať účinky a základné mechanizmy MSC odvodených z ľudskej amniotickej membrány (hAMSC), ktoré regulujú črevnú mikrobiotu a črevnú imunitu v aGVHD. Zavedením humanizovaných myších modelov aGVHD a liečby hAMSC sme zistili, že hAMSC významne zlepšili symptómy aGVHD, zvrátili imunitnú nerovnováhu podskupín T buniek a cytokínov a obnovili črevnú bariéru. Okrem toho sa po liečbe hAMSC zlepšila diverzita a zloženie črevnej mikrobioty. Spearmanova korelačná analýza ukázala, že existuje korelácia medzi črevnou mikrobiotou a proteínmi s tesným spojením, imunitnými bunkami a cytokínmi. Náš výskum naznačil, že hAMSC zmiernili aGVHD podporou normalizácie črevnej mikrobioty a reguláciou interakcií medzi črevnou mikrobiotou a črevnou bariérou, imunitou.

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

Kľúčové slová

Akútne ochorenie štep verzus hostiteľ · Amniotické mezenchymálne kmeňové bunky · Črevná mikroflóra · Črevná bariéra · Črevná imunita

Úvod

Primárnou výhodou alogénnej transplantácie hematopoetických kmeňových buniek (allo-HSCT) je silná protinádorová odpoveď v dôsledku účinku štepu proti leukémii (GVL), ktorý sa spúšťa rozpoznaním peptidov vznikajúcich v dôsledku rozdielov v genómových polymorfizmoch medzi pacientom a pacientom. darcu. Akútna choroba štepu proti hostiteľovi (aGVHD) sa však točí okolo rozvoja poškodenia tkaniva príjemcu v dôsledku útoku alo-reaktívnych darcovských T buniek a predstavuje život ohrozujúcu hlavnú komplikáciu pri alloHSCT [1, 2]. Uvádza sa, že črevná mikrobiálna porucha vyvoláva zápalové reakcie a koreluje s ochoreniami spojenými so zápalom [3, 4]. Početné štúdie ukázali, že poruchy v črevnej mikroflóre sú základným faktorom spúšťajúcim aGVHD po allo-HSCT a stávajú sa novým cieľom liečby [5, 6]. Konkrétne dysbióza črevnej mikroflóry pri aGVHD je zvyčajne charakterizovaná stratou diverzity intestinálnych baktérií a rastom oportúnnych patogénov [6]. Pri gastrointestinálnej GVHD narušená slizničná bariéra iniciuje aktiváciu hostiteľských buniek prezentujúcich antigén a darcovských T buniek, ktorá kulminuje v diferenciácii T-buniek podľa paradigiem patogénneho typu-1 a typu{20}} na úkor tolerogénnych regulačných T- vzory buniek [7]. Primárne na základe 16S ribozomálnej RNA (16S rRNA) sekvenovanie naznačilo, že s GVHD bolo spojených viacero druhov črevnej mikroflóry a napríklad klostrídie produkujúce butyrát sú spojené s udržiavaním funkcie epitelovej bariéry a oslabením akútnej GVHD [8 ]. Mezenchymálne kmeňové bunky (MSC) si v poslednom desaťročí získali veľkú pozornosť vďaka ich sebaobnoveniu a viaclíniovému diferenciačnému potenciálu, ako aj imunomodulačným vlastnostiam [9]. Predpokladá sa, že MSC umožňujú poškodeným tkanivám vyvážené zápalové a regeneračné mikroprostredie v prítomnosti silného zápalu a široko sa používajú na liečbu porúch založených na imunite, v ktorých sa najúspešnejšia klinická aplikácia podieľa na liečbe GVHD [10]. Ľudské amniotické mezenchymálne kmeňové bunky (hAMSC) sú perinatálne kmeňové bunky, ktoré majú schopnosť diferenciácie podobnú embryonálnym kmeňovým bunkám a imunomodulačné vlastnosti podobné dospelým kmeňovým bunkám. Zdieľanie fenotypov podobných typickým MSC, hAMSC sa stali sľubným zdrojom kmeňových buniek vďaka ľahkému, neinvazívnemu a bezpečnému získavaniu tkaniva, bohatému výťažku buniek a veľmi nízkym etickým a morálnym sporom v porovnaní s kmeňovými bunkami z iných zdrojov. Ľudské AMSC majú výhody nízkej imunogenicity a žiadnej tumorigenicity, čo z nich robí ideálny bunkový zdroj pre bunkovú terapiu [11, 12]. Experimenty in vitro potvrdili, že hAMSC vykazovali vyššiu proliferačnú kapacitu a väčšiu schopnosť dlhodobého rastu ako MSC získané z kostnej drene [13, 14]. Početné štúdie preukázali, že hAMSC majú potenciál zlepšiť mnohé zápalové ochorenia, vrátane zápalového ochorenia čriev, osteoartritídy a autoimunitného ochorenia [11]. Naša nedávna štúdia ukázala, že hAMSC zlepšili aGVHD reguláciou rovnováhy T efektorových a Treg buniek [15]. Účinok a mechanizmus hAMSC na črevnú mikrobiálnu poruchu pri GVHD však nie sú známe. Tu sa zameriavame na skúmanie potenciálneho vplyvu hAMSC na aGVHD, ako aj na črevný mikroekosystém. Bola by to prvá štúdia, ktorá by odhalila črevnú mikrobiotu a jej koreláciu s črevnou imunitou po liečbe aGVHD hAMSC.

Materiály a metódy

Izolácia, kultúra a identifikácia hAMSC

hAMSC boli extrahované tak, ako bolo opísané vyššie [15]. Bunky tretej pasáže (P3) boli zozbierané z identifikácie fenotypu farbením protilátkami proti CD34 (581, BD Pharmingen, USA), CD45 (HI30, BD Pharmingen, USA), HLA-DR (G46-6, BD Pharmingen , USA), CD11b (ICRF44, BD Pharmingen, USA), CD90 (5E10, BD Pharmingen, USA), CD73 (AD2, BD Pharmingen, USA) a CD105 (SN6, bioscience, USA), a potom analyzované prietokovým cytometrom ( BD FACS Canto II). Bunky sa skontrolovali na ich viaclínovú diferenciáciu pomocou špecifického indukčného média (BGscience, Čína) a zafarbili sa olejovou červenou-O a alizarínovou červenou na adipogenézu a osteogénnu diferenciáciu. Na experimenty sa použili hAMSC v pasážach 3 až 6.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Zbierka ľudských PBMC

Vzorky plazmy boli získané od zdravých dobrovoľníkov s písomným informovaným súhlasom. Ľudské mononukleárne bunky periférnej krvi (PBMC) sa izolovali z periférnej krvi hustotnou centrifugáciou Ficoll-Hypaque (Tianjin Haoyang, Čína), premyli sa PBS, suspendovali sa v pufri na lýzu červenej krvi (Solarbio, Čína) pri 4 stupňoch počas 15 minút. Znova premyte a potom suspendujte v PBS na injekciu do chvostovej žily myšiam NPG.

Myši

Vo veku 8 až 10 týždňov a 25 až 30 g samčekov a samičiek myší NPG boli zakúpené od spoločnosti Beijing Vitalstar Biotechnology Co., Ltd. a chované v podmienkach SPF v 12-hodinovom cykle svetlo-tma s konštantnou teplotou a vlhkosťou. Všetky postupy na zvieratách boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a používanie zvierat Southern Medical University (č. L2019132) v súlade s pokynmi Čínskej národnej rady pre zdravie a lekársky výskum pre experimentovanie na zvieratách.

Zvierací model akútnej GVHD a liečba

Myší model aGVHD bol vytvorený tak, ako už bolo opísané [15]. Na liečbu sa 5 x 105 hAMSC na myš (tu skupina hAMSC) a PBS (tu skupina aGVHD) injikovalo cez chvostovú žilu do každej myši tretí deň po transplantácii. Vo všetkých myšacích modeloch boli myši každé dva dni kontrolované na chorobnosť a zmeny hmotnosti. Každá myš bola skórovaná na patologické znaky vrátane straty hmotnosti, zhrbeného držania tela, naježenej srsti, kožných lézií, zníženej pohyblivosti a hnačky a potom bola hodnotená podľa klinického skórovacieho systému aGVHD upraveného od systému pôvodne opísaného Cookom [16]. V niektorých prípadoch myši v skupine aGVHD trpeli závažnou aGVHD a myši v skupine hAMSC na tretí deň po liečbe boli usmrtené na odber periférnej krvi a cieľových orgánov vrátane pečene, sleziny, pľúc a čriev. Výkaly týchto myší sa odobrali pred usmrtením.

GFP-značené hAMSC a in vivo sledovanie

GFP-značené hAMSC boli založené a identifikované, ako už bolo opísané [15]. Stručne povedané, transfekovali sme gén zeleného fluorescenčného proteínu (GFP) do hAMSC s lentivírusom ako vektorom. 5 x 105 GFP-značených hAMSC suspendovaných v 500 ul PBS sa injikovalo do aGVHD myší cez chvostovú žilu. Po 24 hodinách a 72 hodinách boli myši usmrtené, aby sa odobrali črevá a potom sa vytvorili zmrazené rezy. Na rozlíšenie buniek príjemcu sa použilo kontrastné farbenie DAPI.

Histopatologické hodnotenie

Cieľové orgány aGVHD sa odobrali v čase pitvy a potom sa spracovali na bloky zaliate parafínom, aby sa vytvorili rezy s hrúbkou 5- μm na farbenie hematoxylínom a eozínom (H&E). Histologické skóre bolo hodnotené na základe deštrukcie tkanivovej štruktúry a infiltrácie lymfocytov [17]. Pre imunohistochémiu boli rezy deparafnizované, rehydratované a ošetrené 3% H202 v metanole počas 20 minút, aby sa inaktivovala endogénna peroxidázová aktivita. Potom boli rezy podrobené získaniu antigénu a ošetrené sérovým albumínom počas 1 hodiny. Následne boli rezy inkubované s králičími anti-humánnymi CD45 protilátkami (EP322Y, Abcam, Anglicko) alebo ZO-1 protilátkami ((EPR19945-296, Abcam, Anglicko) počas 1 hodiny pri 37 stupňoch. protilátky boli detegované pomocou sekundárnej protilátky konjugovanej s HRP (Genentech, USA) a vizualizované pomocou DAB. Pozitívna oblasť bola analyzovaná pomocou Image J.

cistanche rastlina zvyšujúca imunitný systém

16S rRNA sekvenovanie fekálnej mikrobioty

Fekálna genómová DNA sa extrahovala z 0,1 g zmrazených vzoriek stolice pomocou súpravy EZNA® stolice DNA Kit (Omega BioTek, Norcross, GA, USA) podľa protokolu výrobcu. Použitím genómovej DNA ako templátu sa na amplifikácia použili špecifické priméry (338F: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′ a 806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) s čiarovými kódmi a PremixTaq (TaKaRa, Čína). hypervariabilné oblasti V3-V4 bakteriálneho génu 16S rRNA. Po amplifikácii a purifikácii bol celý genóm vzorky sekvenovaný na vysokovýkonnej sekvenčnej platforme Illumina Hiseq alebo Miseq od Magigene Technology Co., Ltd. (Guangzhou, Čína), aby sa získali nespracované údaje vo formáte FASTQ. Analýzy sekvenčných údajov sa uskutočňovali hlavne pomocou platformy Magichand.

Prietoková cytometrická analýza

Získali sa cieľové orgány aGVHD a periférna krv myší a pripravili sa do jednobunkovej suspenzie. Bunky boli zafarbené monoklonálnymi protilátkami proti CD3 (UCHT1, Biolegend, USA), CD4 (RPA-T4, Invitrogen, USA), CD8 (RPA-T8, Biolegend, USA), CD25 (BC96, Biolegend, USA) alebo zodpovedajúcim izotypom kontrolný IgG (eBioscience, USA) počas 30 minút pri izbovej teplote v tme. Potom sa bunky spracovali s Lysing Buffer (BD Pharm Lyse™) pri 4 stupňoch v tme počas 15 minút. Intracelulárne farbenie Foxp3 (236A/E7, Invitrogen, USA) sa uskutočnilo podľa odporúčaní výrobcu (Fixation/Permeabilization Solution Kit; eBioscience). Potom sa uskutočnili polychromatické analýzy prietokovou cytometriou na prietokovom cytometri.

Kvantifikácia cytokínov

Hladiny cytokínov v sére a tkanivovom supernatante myší boli stanovené pomocou cytokínovej súpravy Cytometric Bead Array (CBA) Human Thl/Th2/Th17 (BD Pharmingen, USA) podľa pokynov výrobcu. Stručne, 50 μl každej vzorky supernatantu sa inkubovalo s 50 μl zmiešaných guľôčok na zachytávanie ľudského Th1/Th2/Th17 cytokínu a 50 μl ľudského Th1/Th2/Th17 PE detekčného činidla pri izbovej teplote v tme, potom sa suspendovalo. na analýzu prietokovou cytometriou o 3 hodiny neskôr.

Kvantitatívna PCR v reálnom čase

Celková RNA sa extrahovala z tkaniva myšieho hrubého čreva po izolácii pomocou činidla Trizol (TaKaRa, Čína). Celková RNA sa použila ako templát na reverznú transkripciu cDNA. -aktín bol použitý ako interná referencia. Expresia mRNA sa merala pomocou qPCR s použitím nasledujúcich primérov: ZO-1-F, 5'-ACCACCAACCCGAGAAGAC-3' a ZO- 1-R, 5'-CAGGAGTCATGGACGCACA-3 '; occludin-F, 5'-TTGAAAGTCCACCTCCTTACAGA-3' a occludinR, 5'-CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG-3'; -aktín-F, 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3' a -aktín-R, 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'. Na meranie hladín expresie RNA sa použila metóda 2-ct.

Enzymovo viazaný imunosorbentový test (ELISA)

Hladiny D-LA a DAO v plazme sa merali pomocou súprav ELISA (Jingmei, Čína) podľa pokynov výrobcu. Stručne, zozbierané plazmatické supernatanty sa umiestnili do 96-jamkových platní potiahnutých špecifickou protilátkou. Absorbancia sa zaznamenávala pri 450 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Multikan MK3, Thermo Fisher Scientific).

Štatistická analýza

Údaje boli prezentované ako priemer ± SD. Uskutočnil sa a vizualizoval t-test nezávislých vzoriek pomocou GraphPad Prism8.0. Analýza sekvenčných údajov 16S rRNA sa uskutočnila pomocou platformy Magichand (http://cloud.magigenecom/). Korelačná analýza medzi črevnou mikroflórou a imunitou sa uskutočnila pomocou balíkov R (v3.6.3), aby sa zobrazila korelačná matica. P hodnoty<0.05 were considered statistically significant. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, n.s. not signifcant.

Výsledky

Identifikácia hAMSC

hAMSC vykazovali v kultúre mnohouholníkovú alebo fibroblastom podobnú morfológiu (obr. 1A) a boli silne pozitívne na povrchovú expresiu MSC-špecifických markerov CD90, CD105 a CD73, ale negatívne na CD34, CD45, HLA-DR a CD11b (obr. 1C). Čo sa týka viaclíniovej diferenciácie, naše výsledky ukázali, že hAMSC preukázali adipocytickú a osteoblastickú diferenciáciu (obr. 1B).

hAMSC významne zmiernili príznaky aGVHD u myší

Najprv sme hodnotili terapeutický účinok hAMSC na aGVHD. V porovnaní so skupinou aGVHD, hAMSC významne zlepšili aGVHD, o čom svedčí výrazne znížená strata hmotnosti (obr. 2B) a znížené klinické skóre aGVHD (obr. 2C). Okrem toho skupina hAMSC mala významne vyššiu mieru prežitia v porovnaní s myšami aGVHD (obr. 2D). Patologická histologická analýza ukázala, že aGVHD spôsobilo vážne poškodenie tkaniva a infiltráciu leukocytmi. hAMSC, ako bolo preukázané pomocou H&E, zmiernili narušenie tkaniva a infiltráciu exogénnych T buniek v cieľových orgánoch aGVHD (obr. 2E). Výsledky IHC tiež potvrdili, že hAMSC zlepšili abnormálne patologické prejavy (obr. 2F). Tieto výsledky naznačujú, že hAMSC mali potenciál zlepšiť symptómy aGVHD u myší s aGVHD.

hAMSC ovplyvnili imunitu hostiteľa u myší aGVHD

Aby sme pochopili základné imunomodulačné mechanizmy, ktorými hAMSC znižujú aGVHD, merali sme aktiváciu a expanziu T buniek v periférnej krvi a cieľových orgánoch. Test prietokovou cytometriou odhalil, že hAMSC pozoruhodne inhibovali počet CD3+CD4+T a CD3+CD8+T buniek v krvi a cieľových orgánoch (obr. 3A, B). Okrem toho podiel CD4+CD25+Foxp3+Treg v krvi a cieľových orgánoch myší v skupine hAMSC bol významne vyšší ako v skupine aGVHD (obr. 3C) . Ďalej sme skúmali účinok hAMSC na profil cytokínov (obr. 4). Podávanie hAMSC viedlo k zjavnému zníženiu hladín IL-17A, IFN-, TNF, IL-6 a IL{13}} v cieľových orgánoch a krvi v porovnaní s hladinami v skupine aGVHD, okrem hladiny TNF v slezine. Medzitým, okrem hladín IL{14}} v pečeni, myši liečené hAMSC vykazovali podstatne zvýšené hladiny IL-10 a IL-4 v cieľových orgánoch a krvi. Celkovo vzaté, hAMSC hrali ochrannú úlohu v aGVHD zvrátením imunitnej nerovnováhy podskupín T buniek a búrky cytokínov.

Výhody cistanche tubulosa-posilnenie imunitného systému

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

hAMSC zlepšili poškodenie črevnej bariéry u myší aGVHD

Aby sme zistili, či hAMSC môžu opraviť črevnú bariéru v aGVHD, najprv sme pozorovali, či hAMSC môžu migrovať do čriev. Ako je znázornené na obr. 5A, GFP-značené hAMSC boli detegované v črevách po injekcii do hAMSC a mohli sa prihojiť a infiltrovať do čriev. Potom sme navrhli histopatologické hodnotenie tkaniva tenkého čreva. V skupine aGVHD bolo črevo erodované a nekrotické, črevné klky boli zjavne zničené, klky boli zlomené a masívne leukocyty infiltrovali črevnú sliznicu, submukózu a lamina propria. Črevné klky boli pravidelne usporiadané a po liečbe hAMSC nedošlo k žiadnemu zlomeniu črevných klkov alebo oddeleniu epitelu klkov (obr. 5B). Infiltrácia ľudských lymfocytov bola tiež pozorovaná imunohistochémiou v črevách v skupine aGVHD, zatiaľ čo liečba hAMSC mohla znížiť ich infiltráciu (obr. 5C). Na posúdenie ochranného účinku hAMSC na integritu črevnej sliznice sme vykonali imunohistochémiu na zistenie účinku na ZO-1. V skupine liečenej hAMSC bola hladina expresie proteínu s tesným spojením ZO-1 významne zvýšená v porovnaní so skupinou aGVHD (obr. 5D). Skúmali sme tiež hladiny expresie mRNA črevných proteínov tesného spojenia (TJ) a plazmatické hladiny kyseliny D-mliečnej (D-LA) a diaminooxidázy (DAO), aby sme určili funkciu črevnej bariéry a intestinálnu permeabilitu. Pri intravenóznom podávaní by hMASC mohli významne zvýšiť hladiny expresie mRNA ZO-1 a Occludin, kľúčových proteínov TJs (obr. 5E, F), pričom by mohli znižovať hladiny D-LA a DAO (obr. 5G, H). Keď sa teda vyskytla aGVHD, črevná bariéra bola poškodená znížením črevných proteínov s tesným spojením a zvýšením črevnej permeability. Medzitým by hAMCS mohli výrazne zvrátiť narušenie črevnej bariéry.

Obr. 1 Fenotypová a funkčná charakterizácia hAMSC. (A) Reprezentatívne mikrofotografie hAMSC z pasáže 0 do 3 (bez farbenia, 100×). (B) Schopnosť viaclínovej diferenciácie hAM SC. Adipogénna diferenciácia hAMSC (vľavo) sa zafarbila olejovou červenou-O a osteoblastická diferenciácia hAMSC (vpravo) sa zafarbila alizarínovou červenou (farbenie, 100x). (C) Prietoková cytometrická analýza indikujúca hAMSC pozitívne na CD90, CD105 a CD73, zatiaľ čo negatívne na CD34, CD45, CD11b a HLA-DR

Obr. 2 hAMSC zmiernili aGVHD u NPG myší. (A) Schematický diagram znázorňujúci rozvrh podávania hAMSC v modeloch myší aGVHD. (B) Zmeny telesnej hmotnosti v rôznych skupinách (n=10). (C) klinické skóre aGVHD (na základe úbytku hmotnosti, zhrbeného držania tela, skrčenej srsti, kožných lézií, zníženej pohyblivosti a hnačky) v rôznych skupinách (n=10). (D) Prežitie medzi rôznymi skupinami (n=10). (E) Reprezentatívne mikroskopické snímky farbenia H&E (400×) a histologického skóre (na základe deštrukcie štruktúry tkaniva a infltrácie lymfocytov) (n=4). (F) Reprezentatívne mikroskopické snímky imunohistochémie (400×) a podiel oblasti pozitívnej na CD45 (n=4). Hodnoty boli prezentované ako priemer ± SD

Obr. 3 hAMSC inhibovali expanziu donorových T buniek, zatiaľ čo zosilňovali tvorbu alebo expanziu Tregs in vivo. (A) Prietoková cytometrická analýza CD3+CD4+T buniek (n=6), (B) Prietoková cytometrická analýza CD3+CD8+ T bunky (n=6), (C) Analýza prietokovou cytometriou CD4+CD25+Foxp3+Tregs (n=6). Hodnoty boli prezentované ako priemer ± SD

Obr. 4 hAMSC znížili reguláciu prozápalových cytokínov IL-17A, IFN-, TNF, IL-6, IL-2 a zvýšili reguláciu protizápalových cytokínov IL-10 a IL -4 in vivo (n=5). Hodnoty boli prezentované ako priemer ± SD

Zmeny črevnej mikrobioty po liečbe hAMSC u myší aGVHD

Sekvenovanie 16S rRNA sa uskutočnilo v DNA fekálnych baktérií izolovanej z rôznych skupín myší. Indexy diverzity, vrátane indexov OUT, Chao1 a Shannon, vykazovali podobné tendencie a myši liečené hAMSC obsahovali mikroflóru s výrazne vyššou diverzitou v porovnaní s aGVHD skupinou (obr. 6A). Hlavná súradnicová analýza (PCoA) na základe váženej vzdialenosti Unifrac, vzdialenosti Manhattan a metrickej vzdialenosti Bray-Curtis priniesla rozptýlené dátové body na pozemkoch dvoch skupín, napriek tomu, že rozdiel nebol významný (obr. 6B). Následne sme hodnotili krajinu črevnej mikrobioty, aby sme ďalej skúmali potenciálny rozdiel v zložení medzi týmito dvoma skupinami. Celkovo bolo vypočítaných 773 OTU a skupina hAMSC mala vyššie OTU v porovnaní so skupinou aGVHD (obr. 6C). Pokiaľ ide o zloženie baktérií na úrovni kmeňa, Firmicutes a Bacteroidetes boli dva najprevládajúce kmene (obr. 6D). Tiež sme zorganizovali porovnávaciu teplotnú mapu na analýzu črevnej mikroflóry medzi týmito dvoma skupinami (obr. 6E). Rod Odoribacter a Ruminococcus_1 vykazoval relatívne vysoké zastúpenie v skupine hAMSC, čo sú dôležité mikróby na udržanie črevnej homeostázy (obr. 6F, G). Aby sme potvrdili, ktorá baktéria bola zmenená liečbou hAMSC a následne ovplyvnila progresiu ochorenia proti aGVHD, vykonali sme vysokorozmerné porovnania tried pomocou lineárnej diskriminačnej analýzy (LDA) veľkosti účinku (LEfSe), ktorá odhalila výrazné rozdiely v prevahe bakteriálnych spoločenstiev medzi dve skupiny. Ako je znázornené na (obr. 6H, I), Streptococcaceae (čeľaď a rod Streptococcus), Paludibacteraceae, F0058 a Delftia boli kľúčovými typmi baktérií prispievajúcich k dysbióze črevnej mikroflóry v skupine aGVHD. Napriek tomu prospešné baktérie Lachnospiraceae, Roseburia, Ruminococcaceae, Ruminiclostridium, Oscillibacter a Clostridia (trieda a rád Clostridiales) vykazovali relatívne obohatenie v skupine hAMSC, čo môže byť spojené so zmiernením aGVHD sprostredkovaným hAMSC. Spoločne sa rozmanitosť a zloženie črevnej mikrobioty zlepšili po podaní hAMSC a posunuli sa v celkovom trende, ktorý bol pre telo prospešný.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

hAMSC regulovali interakcie medzi črevnou mikrobiotou a črevnou imunitou

Aby sme pochopili potenciálny vzťah medzi črevnou mikrobiotou a črevnou mukóznou bariérou, korelácie medzi TJ a črevnou mikrobiotou na úrovni rodu sa analyzovali Spearmanovou korelačnou analýzou. Ako je znázornené na obr. 7, existuje pozitívny vzťah medzi ZO-1 a prospešnými baktériami Ruminococcaceae_UCG.014, Muribaculum, Ruminococcus_1 a Ruminiclostridium{5}}. Relatívny počet prospešných baktérií Roseburia, Odoribacter, Ruminococcus_1 a Ruminococcaceae_UCG.014 ukázal dramaticky pozitívne korelácie s Occludinom. Ďalej sme vykonali korelačnú analýzu medzi črevnou mikroflórou a črevnou imunitnou bariérou Spearmanovou metódou poradovej korelácie (obr. 7). Pozorovali sme, že nárast Roseburia, Muribaculum a Ruminococcus _1 negatívne koreloval s percentom CD3 +CD4+T buniek. Okrem toho nárast prospešných baktérií, Ruminococcus{13}} a Ruminiclostridium _9, pozitívne koreloval s percentom Tregs, zatiaľ čo negatívne koreloval s IL-17. Množstvo Lactobacillus a Candidatus{16}Arthromitus negatívne korelovalo s IFN-. Medzi množstvom Muribaculum a IL bola negatívna korelácia-2. Zvýšenie počtu Candidatus{19}}Saccharimonas a zníženie počtu Escherichia. Množstvo Shigella pozitívne korelovalo s hladinou IL-10 (obr. 7). Výsledky korelačnej analýzy ukázali, že hAMSC zlepšili zápalové prostredie hostiteľa a regulovali črevnú homeostázu, ktorá môže byť spojená s moduláciou črevnej mikrobioty, a následne zabránili aGVHD.

Obr. 5 hAMSC zlepšili dysfunkciu črevnej bariéry u aGVHD myší. ( A ) HAMSC značené GFP infiltrovali do čriev. (B) Reprezentatívne mikroskopické snímky H&E farbenia čriev (400×) a histologické skóre (na základe deštrukcie tkanivovej štruktúry a infiltrácie lymfocytov) (n=4). (C) Reprezentatívne mikroskopické snímky imunohistochémie (400×) čriev a podiel CD45 pozitívnej oblasti (n=4). (D) Reprezentatívne mikroskopické snímky imunohistochémie (400×) čriev a podiel ZO-1 pozitívnej plochy (n=4). (E) hladiny expresie mRNA ZO-1 a okludínu (n=3). (F) Hladiny D-LA a DAO v plazme (n=4).Hodnoty boli prezentované ako priemer ± SD

Diskusia

Pokročilá mikrobiálna analýza poskytla nový pohľad na komplexné interakcie medzi hostiteľom a črevnou mikroflórou [18]. Črevná mikroflóra by mohla byť zmenená po allo-HSCT a je úzko spojená s aGVHD, čo naznačuje, že črevná mikroflóra môže byť novým cieľom liečby aGVHD [5]. Početné štúdie vrátane našej nedávnej štúdie skúmali a potvrdili terapeutický účinok MSC na aGVHD [15, 19, 20]. Účinok na črevnú mikrobiotu počas tohto obdobia však zostáva nejasný. V tejto štúdii sme skúmali vplyv hAMSC na aGVHD a potenciálne mechanizmy v ňom in vivo. V súlade s predchádzajúcimi štúdiami [15, 21–23] naše výsledky ukázali, že hAMSC majú priaznivý ochranný účinok na aGVHD u myší, čo dokazujú oslabené symptómy aGVHD a predĺžené prežitie. Tiež sme demonštrovali, že hAMSC vykazovali imunosupresívny účinok prostredníctvom zníženia expanzie darcovských T buniek a zároveň zvyšovania tvorby Tregs v aGVHD. Medzitým by hAMSC mohli downregulovať prozápalové cytokíny a upregulovať protizápalové cytokíny in vivo, aby inhibovali zápalové reakcie. Črevná bariéra, hustá štruktúra zložená z monovrstvy črevných epiteliálnych buniek, si zachováva svoju integritu a zabraňuje translokácii luminálnej mikrobioty v zdravom stave [24]. Počas allo-HSCT kondicionačné režimy poškodzujú črevnú bariéru, čo je počiatočný krok vo vývoji aGVHD, pretože umožňuje translokáciu baktérií cez bariéru a vedie k narušeniu črevnej imunitnej homeostázy [24, 25]. Hromadné dôkazy dokazujú, že MSC majú schopnosť reparácie tkaniva, čo bolo dokázané, že opravuje integritu črevnej bariéry u myší s kolitídou [26]. Proteíny s tesným spojením, vrátane ZO-1 a okludínu, majú zásadnú úlohu vo funkcii črevnej bariéry a translokácia črevnej mikroflóry cez narušenú črevnú bariéru vyvoláva zápal [27]. D-LA pochádza z črevných baktérií a DAO sa koncentruje hlavne v črevnej sliznici. Vysoké koncentrácie D-LA a DAO v plazme by teda mohli čiastočne odrážať zmeny intestinálnej permeability a funkcie črevnej bariéry [28]. V súčasnosti sme zistili, že hladiny expresie TJs sa dramaticky zvýšili po podaní hAMSC, zatiaľ čo plazmatické hladiny D-LA a DAO významne klesli, čo naznačuje, že hAMSC by mohli zlepšiť dysfunkciu črevnej bariéry a obnoviť črevnú permeabilitu. Črevo je jedným z orgánov najvážnejšie postihnutých aGVHD a výskum zdôraznil, že baktéria, najmä črevná mikroflóra, hrá ústrednú úlohu v patogenéze a vývoji aGVHD [5, 6]. Ako bolo uvedené v predchádzajúcich štúdiách, strata bakteriálnej diverzity u pacientov s allo HSCT bola spojená so zvýšenou mortalitou na aGVHD [29, 30]. Fekálna dominancia oportúnnymi patogénmi Enterococcus a Proteobacteria bola tiež spojená so zvýšenou GVHD [6, 31]. V posledných desaťročiach sa venovala zvýšená pozornosť korelácii medzi črevnou mikrobiotou a liečbou MSC pri zápalových ochoreniach. Bolo dokázané, že MSC zlepšujú dysbiózu črevnej mikroflóry pri reumatoidnej artritíde, sepse a zápalovom ochorení čriev [32–34]. Aby sme ďalej preskúmali mechanizmus, ktorým hAMSC zlepšujú aGVHD, skúmali sme vplyv hAMSC na črevnú mikrobiotu. V súčasnej štúdii podávanie hAMSC preukázalo značný vplyv na diverzitu mikrobiálnych spoločenstiev v porovnaní so žiadnou transplantáciou, čo naznačuje, že množstvo črevnej mikroflóry by sa po liečbe hAMSC mohlo zmeniť. Neexistoval však žiadny významný rozdiel v meraniach diverzity, pravdepodobne kvôli malej veľkosti vzoriek oboch skupín alebo nedostatočnému liečebnému cyklu hAMSC. Analýza pomocou porovnávacej tepelnej mapy v úrovniach rodu ukázala, že podávanie hAMSC zvýšilo množstvo prospešných baktérií Odoribacter a Ruminococcus{32}} v črevnej flóre, čo boli výrobcovia mastných kyselín s krátkym reťazcom (SCFA) s protizápalovými vlastnosťami [35 36]. Na identifikáciu základných dominantných baktérií sprostredkovaných transplantáciou hAMSC sa medzi týmito dvoma skupinami uskutočnila analýza LEfSe. V porovnaní so skupinou aGVHD liečba hAMSC významne zvýšila početnosť niektorých prospešných mikróbov súvisiacich s protizápalovými účinkami, ako sú Lachnospiraceae, Roseburia, Ruminococcaceae, Ruminiclostridium, Oscillibacter, Clostridia, ktoré boli všetky opísané ako prospešné pre produkciu SCFA metabolitov črevnej mikrobioty [ 37 – 42]. Naše pozorovania preto ukázali, že po podaní hAMSC sa dysbióza črevnej mikrobioty zlepšila, čo sa prejavuje zlepšenou diverzitou a zvýšeným relatívnym množstvom prospešných baktérií.

Obr. 6 Zmeny črevnej mikroflóry u myší aGVHD. (A) porovnanie -rozmanitosti. (B) porovnanie -diverzity. (C) Vennov diagram OTU. (D) Relatívna bakteriálna abundancia na úrovni kmeňa. (E) Teplotná mapa početnosti druhov na úrovni rodu. (F) Relatívne zastúpenie Odoribacter na úrovni rodu. (G) Relatívna abundancia Ruminococcus_1 na úrovni rodu. (H) Kladogram založený na analýze LEfSe. (I) Skóre LDA vypočítané z vlastností odlišne bohatých medzi skupinami aGVHD a hAMSC. (AI) n=3 myší na skupinu. Hodnoty boli prezentované ako priemer ± SD

aGVHD je komplikovaný zápalový proces, ktorý je iniciovaný deštrukciou integrity črevnej bariéry, po ktorej nasleduje translokácia črevnej mikrobioty a jej zložiek. Rozpoznanie molekulárnych vzorov spojených s poškodením a molekulárnych vzorov spojených s patogénom bunkami prezentujúcimi antigén indukuje prozápalovú odpoveď vrátane aktivácie T buniek a cytokínovej búrky, aby sa zhoršilo poškodenie črevnej bariéry a podporil rozvoj aGVHD [24, 43]. Na druhej strane črevná mikroflóra a metabolity odvodené od mikroflóry, ako sú SCFA, hrajú dôležitú úlohu pri udržiavaní integrity črevnej bariéry a črevnej homeostázy, ako aj pri formovaní imunitného systému slizníc a pri vyrovnávaní obrany hostiteľa s mikrobiálnymi zložkami a metabolitmi [24, 44]. . Vzájomná komunikácia medzi hostiteľom a črevnou mikroflórou na črevnej bariére reguluje slizničné a systémové imunitné reakcie a v patologických stavoch môže viesť k GVHD [6, 45, 46]. Naznačuje, že črevná mikroflóra úzko súvisí s expresiou proteínov s tesným spojením [47]. Súčasná štúdia ukázala, že expresia mRNA TJs ZO-1 a Occludin bola negatívne korelovaná s relatívnym množstvom škodlivých baktérií, zatiaľ čo mala pozitívnu koreláciu s prospešnými baktériami, čo naznačuje, že črevná mikroflóra bola dôležitá na udržanie integrity črevná bariéra. Črevná mikroflóra je navyše veľmi dôležitá pri udržiavaní črevnej imunitnej bariéry [47]. Zistili sme, že niektoré prospešné baktérie negatívne korelovali s percentom CD3+CD4+T buniek, ale pozitívne korelovali s percentom Tregs. Tu sme odhalili, že prospešné baktérie, väčšinou výrobcovia SCFA, negatívne korelovali s prozápalovými cytokínmi, ale pozitívne korelovali s protizápalovými cytokínmi, zatiaľ čo škodlivé baktérie sú naopak korelované. Stručne povedané, významný rozdiel v črevnej mikroflóre medzi liečbami naznačoval úplný obraz interakcií medzi črevnou mikrobiotou a črevnou bariérou, imunitou. V našich experimentoch stále existovalo niekoľko obmedzení, ktoré stojí za to prediskutovať. Po prvé, hoci naša štúdia skúmala účinky hAMSC na imunitu, črevnú bariéru a črevnú mikroflóru v aGVHD, základný mechanizmus je stále potrebné overiť v ďalšej štúdii. Po druhé, deplécia črevnej mikroflóry a transplantácia fekálnej mikroflóry sú potrebné na riešenie kauzálnych korelácií medzi črevnou mikrobiotou, črevnou bariérou a imunitou. Po tretie, je potrebný ďalší výskum skúmajúci vplyv hAMSC na SCFA odvodené od mikrobioty a iné metabolity. Na záver náš výskum naznačil, že hAMSC zmiernili aGVHD podporou normalizácie črevnej mikrobioty a reguláciou interakcií medzi črevnou mikrobiotou a črevnou bariérou, imunitou. Naša štúdia je prvou, ktorá systematicky definuje účinky a základné mechanizmy hAMSC regulujúcich črevnú mikrobiotu a črevnú imunitu pri aGVHD.

Obr. 7 Korelačná analýza medzi črevnou mikroflórou a črevnou imunitou. Spearmanova korelačná analýza sa uskutočnila medzi relatívnym množstvom 15 rôznych črevných mikrobiot (na úrovni rodu) a úrovňou expresie mRNA TJ, percentom imunitných buniek, ako aj koncentráciou cytokínov v črevách medzi týmito dvoma skupinami. Hodnoty Spearmana r sa pohybujú od -0,5 (modrá) do 0,5 (červená)

Referencie

1. Schmid, C. (2021). O krok bližšie ku GVL bez GVHD. Krv, 137(19), 2565–2566. https://doi.org/10.1182/blood.2020010132

2. Chang, Y., Zhao, X., & Huang, X. (2018). Stratégie na zvýšenie a zachovanie účinkov proti leukémii bez zhoršenia ochorenia štepu proti hostiteľovi. Frontiers in Immunology, 9, 3041. https:// doi.org/10.3389/fmmu.2018.03041

3. Zhu, W., Winter, MG, Byndloss, MX, Spiga, L., Duerkop, BA, Hughes, ER, Büttner, L., de Lima Romão, E., Behrendt, CL, Lopez, CA, Sifuentes- Dominguez, L., Huf-Hardy, K., Wilson, RP, Gillis, CC, Tükel, Ç., Koh, AY, Burstein, E., Hooper, LV, Bäumler, AJ, & Winter, SE (2018). Presná úprava črevnej mikroflóry zlepšuje kolitídu. Príroda, 553 (7687), 208–211. https://doi.org/10.1038/nature25172

4. Zhao, L., Zhang, F., Ding, X., Wu, G., Lam, YY, Wang, X., Fu, H., Xue, X., Lu, C., Ma, J. , Yu, L., Xu, C., Ren, Z., Xu, Y., Xu, S., Shen, H., Zhu, X., Shi, Y., Shen, Q., … Zhang, C (2018). Črevné baktérie selektívne podporované vlákninou z potravy zmierňujú cukrovku 2. typu. Science (New York, NY), 359(6380), 1151–1156. https://doi.org/10.1126/science.aao5774

5. Shono, Y., & van den Brink, MRM (2018). Poškodenie črevnej mikroflóry pri alogénnej transplantácii hematopoetických kmeňových buniek. Recenzie prírody. Rak, 18(5), 283–295. https://doi.org/10.1038/ nrc.2018.10

6. Stafas, A., Burgos da Silva, M., & van den Brink, MRM (2017). Črevná mikrobiota pri alogénnej transplantácii hematopoetických buniek a reakcii štepu proti hostiteľovi. Krv, 129 (8), 927–933. https://doi.org/10.1182/blood{10}}

7. Wu, K., Yuan, Y., Yu, H., Dai, X., Wang, S., Sun, Z., Wang, F., Fei, H., Lin, Q., Jiang, H & Chen, T. (2020). Črevný mikrobiálny metabolit trimetylamín-N-oxid zhoršuje GVHD indukciou polarizácie makrofágov M1 u myší. Krv, 136 (4), 501–515. https://doi.org/10.1182/blood.2019003990

8. Mathewson, ND, Jenq, R., Mathew, AV, Koenigsknecht, M., Hanash, A., Toubai, T., Oravecz-Wilson, K., Wu, S., Sun, Y., Rossi, C ., Fujiwara, H., Byun, J., Shono, Y., Lindemans, C., Calafore, M., Schmidt, TM, Honda, K., Young, VB, Pennathur, S., … Reddy, P. (2016). Metabolity odvodené z črevného mikrobiómu modulujú poškodenie črevných epiteliálnych buniek a zmierňujú ochorenie štep verzus hostiteľ. Nature Immunology, 17 (5), 505–513. https://doi.org/10.1038/ni.3400

9. Dave, JR, Chandekar, SS, Behera, S., Desai, KU, Salve, PM, Sapkal, NB, Mhaske, ST, Dewle, AM, Pokare, PS, Page, M., Jog, A., Chivte , PA, Srivastava, RK, & Tomar, GB (2022). Ľudské gingiválne mezenchymálne kmeňové bunky si zachovávajú svoje rastové a imunomodulačné charakteristiky nezávisle od veku darcu. Science Advances, 8(25), m6504. https://doi.org/10. 1126/sciadv.abm6504

10. Zhao, K., & Liu, Q. (2016). Klinická aplikácia mezenchymálnych stromálnych buniek pri transplantácii hematopoetických kmeňových buniek. Journal of Hematology & Oncology, 9(1), 46. https://doi.org/ 10.1186/s13045-016-0276-z

11. Liu, Q., Huang, Q., Wu, H., Zuo, G., Gu, H., Deng, K., & Xin, H. (2021). Charakteristika a terapeutický potenciál ľudských kmeňových buniek odvodených z amniónu. International Journal of Molecular Sciences, 22(2), 970. https://doi.org/10.3390/ijms22020970

12. Li, J., Zhou, Z., Wen, J., Jiang, F., & Xia, Y. (2020). Ľudské amniotické mezenchymálne kmeňové bunky podporujú endogénnu regeneráciu kostí. Frontiers in Endocrinology, 11, 543623. https://doi.org/10.3389/fendo.2020.543623

13. Díaz-Prado, S., Muiños-López, E., Hermida-Gómez, T., Cicione, C., Rendal-Vázquez, ME, Fuentes-Boquete, I., de Toro, FJ, Blanco, FJ ( 2011). Ľudská amniová membrána ako alternatívny zdroj kmeňových buniek pre regeneratívnu medicínu. Diferenciácia; Výskum biologickej diverzity, 81 (3), 162–171. https://doi.org/10.1016/j.dif.2011.01.005

14. Hong, J., Gao, Y., Song, J., Zhuo, W., Sun, H., & Ping, B. (2016). Porovnanie biologických charakteristík a imunosupresívnej aktivity medzi ľudskými amniotickými mezenchymálnymi kmeňovými bunkami a mezenchymálnymi kmeňovými bunkami ľudskej kostnej drene. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi, 24(3), 858–864. https:// doi.org/10.7534/j.issn.1009-2137.2016.03.041

15. Gao, Y., Li, W., Bu, X., Xu, Y., Cai, S., Zhong, J., Du, M., Sun, H., Huang, L., He, Y Hu, X., Liu, Q., Jin, H., Wang, Q., & Ping, B. (2021). Ľudské amniotické mezenchymálne kmeňové bunky inhibujú aGVHD reguláciou rovnováhy Treg a T efektorových buniek. Journal of Inflammation Research, 14, 3985–3999. https://doi.org/10.2147/ JIR.S323054

16. Cooke, KR, Kobzik, L., Martin, TR, Brewer, J., Delmonte, JJ, Crawford, JM, & Ferrara, JL (1996). Experimentálny model syndrómu idiopatickej pneumónie po transplantácii kostnej drene: I. Úlohy minoritných H antigénov a endotoxínu. Krv, 88(8), 3230–3239.

17. Yañez, R., Lamana, ML, García-Castro, J., Colmenero, I., Ramírez, M., & Bueren, JA (2006). Mezenchymálne kmeňové bunky odvodené z tukového tkaniva majú in vivo imunosupresívne vlastnosti použiteľné na kontrolu reakcie štepu proti hostiteľovi. Kmeňové bunky (Dayton, Ohio), 24 (11), 2582-2591.

18 Hooper, LV, Littman, DR a Macpherson, AJ (2012). Interakcie medzi mikroflórou a imunitným systémom. Science (New York, NY), 336 (6086), 1268–1273. https://doi.org/10.1126/ science.1223490

19. Kelly, K., & Raško, JEJ (2021). Mezenchymálne stromálne bunky na liečbu reakcie štepu proti hostiteľovi. Frontiers in Immunology, 12, 761616. https://doi.org/10.3389/fmmu.2021.761616

20. Macías-Sánchez, MDM, Morata-Tarifa, C., Cuende, N., Cardesa-Gil, A., Cuesta-Casas, M. Á., Pascual-Cascon, MJ, Pascual, A., Martín-Calvo , C., Jurado, M., Perez-Simón, JA, Espigado, I., Garzón López, S., Carmona Sánchez, G., Mata-Alcázar-Caballero, R., & Sánchez-Pernaute, R. (2022 ). Mezenchymálne stromálne bunky na liečbu akútnej a chronickej choroby štepu proti hostiteľovi rezistentnej na steroidy: Multicentrická skúsenosť so súcitným použitím. Stem Cells Translational Medicine, 11 (4), 343–355. https://doi.org/10.1093/ stcltm/szac003

21. Tago, Y., Kobayashi, C., Ogura, M., Wada, J., Yamaguchi, S., Yamaguchi, T., Hayashi, M., Nakaishi, T., Kubo, H., & Ueda, Y. (2021). Ľudské mezenchymálne kmeňové bunky odvodené z amniónu oslabujú xenogénne ochorenie štep verzus hostiteľ tým, že bránia aktivácii a proliferácii T buniek. Scientifc Reports, 11(1), 2406. https://doi. org/10.1038/s{10}}r

22. Yamahara, K., Harada, K., Ohshima, M., Ishikane, S., Ohnishi, S., Tsuda, H., Otani, K., Taguchi, A., Soma, T., Ogawa, H ., Katsuragi, S., Yoshimatsu, J., Harada-Shiba, M., Kangawa, K., & Ikeda, T. (2014). Porovnanie angiogénnych, cytoprotektívnych a imunosupresívnych vlastností ľudských mezenchymálnych kmeňových buniek odvodených z amniónu a choria. PLoS One, 9(2), e88319. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088319

23. Yamahara, K., Hamada, A., Soma, T., Okamoto, R., Okada, M., Yoshihara, S., Yoshihara, K., Ikegame, K., Tamaki, H., Kaida, K ., Inoue, T., Ohsugi, Y., Nishikawa, H., Hayashi, H., Ito, YM, Iijima, H., Ohnishi, S., Hashimoto, D., Isoe, T., … Fujimori, Y (2019). Bezpečnosť a účinnosť mezenchymálnych kmeňových buniek odvodených z amniónu (AM01) u pacientov s akútnym ochorením štepu proti hostiteľovi refraktérnym na steroidy po alogénnej transplantácii hematopoetických kmeňových buniek: protokol štúdie pre fázu I/II japonskej štúdie. BMJ Open, 9(7), e26403. https://doi.org/10.1136/bmjop sk-2018-026403

24. Lin, D., Hu, B., Li, P., Zhao, Y., Xu, Y., & Wu, D. (2021). Úlohy črevnej mikrobioty a mikrobiálnych metabolitov pri akútnej GVHD. Experimentálna hematológia a onkológia, 10(1), 49. https://doi.org/10.1186/s40164-021-00240-3

25. Ghimire, S., Weber, D., Mavin, E., Wang, XN, Dickinson, AM, & Holler, E. (2017). Patofyziológia GvHD a iných hlavných komplikácií súvisiacich s HSCT. Frontiers in Immunology, 8, 79. https://doi.org/10.3389/fmmu.2017.00079

26. Xu, J., Wang, X., Chen, J., Chen, S., Li, Z., Liu, H., Bai, Y., & Zhi, F. (2020). Mezenchymálne kmeňové bunky odvodené z embryonálnych kmeňových buniek podporujú integritu a regeneráciu epitelu hrubého čreva zvýšením cirkulujúceho IGF-1 u myší s kolitídou. Theranostics, 10(26), 12204– 12222. https://doi.org/10.7150/thno.47683

27. Zhao, Y., Huang, J., Li, T., Zhang, S., Wen, C., & Wang, L. (2022). Berberín zlepšuje aGVHD remodeláciou črevnej mikrobioty, potlačením signalizácie TLR4 a opravou bariéry hrubého čreva na inhibíciu zápalu NLRP3. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 26 (4), 1060–1070. https://doi.org/10. 1111/jcmm.17158

28. Yuan, M., Lin, L., Cao, H., Zheng, W., Wu, L., Zuo, H., Tian, ​​X., & Song, H. (2022). Črevná mikroflóra sa podieľa na ochrannom účinku HO-1/BMMSC na transplantáciu pečene pomocou steatotických pečeňových štepov u potkanov. Frontiers in Microbiology, 13, 905567. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.905567

29. Taur, Y., Jenq, RR, Perales, M., Littmann, ER, Morjaria, S., Ling, L., Nie, D., Gobourne, A., Viale, A., Dahi, PB, Ponce , DM, Barker, JN, Giralt, S., van den Brink, M., & Pamer, EG (2014). Účinky bakteriálnej diverzity črevného traktu na úmrtnosť po alogénnej transplantácii hematopoetických kmeňových buniek. Krv, 124 (7), 1174–1182. https://doi.org/10.1182/ krv-2014-02-554725

30. Jenq, RR, Taur, Y., Devlin, SM, Ponce, DM, Goldberg, JD, Ahr, KF, Littmann, ER, Ling, L., Gobourne, AC, Miller, LC, Docampo, MD, Peled, JU, Arpaia, N., Cross, JR, Peets, TK, Lumish, MA, Shono, Y., Dudakov, JA, Poeck, H., … van den Brink, MRM (2015). Intestinálna blautia je spojená so zníženou úmrtnosťou na reakciu štepu proti hostiteľovi. Biológia transplantácie krvi a drene: Journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation, 21(8), 1373–1383. https://doi.org/10.1016/j.bbmt.2015.04.016

31. Le Bastard, Q., Chevallier, P., & Montassier, E. (2021). Črevný mikrobióm pri alogénnej transplantácii hematopoetických kmeňových buniek a špecifické zmeny spojené s akútnym ochorením štepu proti hostiteľovi. World Journal of Gastroenterology, 27(45), 7792–7800. https://doi.org/10.3748/wjg.v27.i45.7792

32. Li, X., Lu, C., Fan, D., Lu, X., Xia, Y., Zhao, H., Xu, H., Zhu, Y., Li, J., Liu, H & Xiao, C. (2020). Ľudské pupočníkové mezenchymálne kmeňové bunky vykazujú terapeutický potenciál pri reumatoidnej artritíde reguláciou interakcií medzi imunitou a črevnou mikroflórou prostredníctvom arylového uhľovodíkového receptora. Hranice bunkovej a vývojovej biológie, 8, 131. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00131

33. Sun, J., Ding, X., Liu, S., Duan, X., Liang, H., & Sun, T. (2020). Mezenchymálne kmeňové bunky odvodené z tukového tkaniva zmierňujú akútne poškodenie pľúc a zlepšujú črevnú mikroflóru u septických potkanov. Stem Cell Research & Therapy, 11(1), 384. https://doi.org/10.1186/ s13287-020-01902-5

34. Soontararak, S., Chow, L., Johnson, V., Coy, J., Wheat, W., Regan, D., & Dow, S. (2018). Mezenchymálne kmeňové bunky (MSC) odvodené z indukovaných pluripotentných kmeňových buniek (iPSC) ekvivalentné MSC odvodeným z tukového tkaniva pri podpore hojenia čriev a normalizácie mikrobiómov v modeli zápalového ochorenia čriev u myší. Stem Cells Translational Medicine, 7 (6), 456–467. https://doi.org/ 10.1002/sctm.{9}}

35. Li, J., Zou, C., & Liu, Y. (2022). Zmiernenie potravinovej alergie vyvolanej ovalbumínom u myší cieleným podávaním kyanidin-3--O-glukozidu do konečníka a hrubého čreva. Foods (Bazilej, Švajčiarsko), 11(11), 1542. https://doi.org/10.3390/foods11111542

36. Maruyama, S., Matsuoka, T., Hosomi, K., Park, J., Nishimura, M., Murakami, H., Konishi, K., Miyachi, M., Kawashima, H., Mizuguchi, K ., Kobayashi, T., Ooka, T., Yamagata, Z., & Kunisawa, J. (2022). Klasifikácia výskytu dyslipidémie na základe črevných baktérií súvisiacich s príjmom jačmeňa. Frontiers in Nutrition, 9, 812469. https://doi.org/10.3389/fnut.2022.812469

37. Lee, SH, Park, H., Kang, CD, Choi, DH, Park, SC, Park, JM, Nam, S., Chae, GB, Lee, KY, Cho, H., & Lee, SJ ( 2022). Suplementácia vysokými dávkami intramuskulárneho vitamínu D3 ovplyvňuje črevnú mikroflóru pacientov s infekciou Clostridioides difcile. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 12, 904987. https://doi.org/10.3389/fcimb.2022.904987

38. Meyer, RK, Lane, AI, Weninger, SN, Martinez, TM, Kangath, A., Laubitz, D., & Duca, FA (2022). Oligofruktóza obnovuje postprandiálne hladiny mastných kyselín s krátkym reťazcom počas kŕmenia s vysokým obsahom tukov. Obezita (Silver Spring, Md.), 30(7), 1442–1452. https://doi.org/ 10.1002/oby.23456

39. Sang, J, Zhuang, D, Zhang, T, Wu, Q, Yu, J, Zhang, Z (2022) Konvergentné a divergentné vekové vzorce diverzity črevnej mikrobioty u ľudí a primátov (okrem človeka). M-Systems: e151221. https:// doi.org/10.1128/msystems.{6}}

40. Ge, X., He, X., Liu, J., Zeng, F., Chen, L., Xu, W., Shao, R., Huang, Y., Farag, MA, Capanoglu, E. , El-Seedi, HR, Zhao, C., & Liu, B. (2022). Zlepšenie diabetu 2. typu novou koordináciou 6, 8-guanidyl luteolín chinón-chróm prostredníctvom biochemických mechanizmov a interakcie črevnej mikroflóry. Journal of Advanced Research, S2090–1232(22), 121–129. https://doi.org/ 10.1016/j.jare.2022.06.003

41. Ding, Q., Cao, F., Lai, S., Zhuge, H., Chang, K., Valencak, TG, Liu, J., Li, S., & Ren, D. (2022). Lactobacillus plantarum ZY08 zmierňuje chronickú alkoholom indukovanú steatózu pečene a poškodenie pečene u myší prostredníctvom obnovenia homeostázy čriev. Food Research International (Ottawa, Ont.), 157, 111259. https://doi.org/10. 1016/j.foodres.2022.111259

42. Rees, NP, Shaheen, W., Quince, C., Tselepis, C., Horniblow, RD, Sharma, N., Beggs, AD, Iqbal, TH, & Quraishi, MN (2022). Systematický prehľad prediktívnych biomarkerov darcu a príjemcu odpovede na transplantáciu fekálnej mikrobioty u pacientov s ulceróznou kolitídou. EBioMedicine, 81, 104088. https:// doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104088

43. Li, A., Abraham, C., Wang, Y., & Zhang, Y. (2020). Nové poznatky o základnej biológii akútnej choroby štep verzus hostiteľ. Haematologica, 105(11), 2540–2549. https://doi.org/10.3324/haematol. 2019.{12}}. Kayama, H., Okumura, R., & Takeda, K. (2020). Interakcia medzi mikrobiotou, epitelom a imunitnými bunkami v čreve. Annual Review of Immunology, 38, 23–48. https://doi.org/ 10.1146/Annu rev-immunol-070119-115104

45. Schluter, J., Peled, JU, Taylor, BP, Markey, KA, Smith, M., Taur, Y., Niehus, R., Stafas, A., Dai, A., Fontana, E., Amoretti , LA, Wright, RJ, Morjaria, S., Fenelus, M., Pessin, MS, Chao, NJ, Lew, M., Bohannon, L., Bush, A., ... Xavier, JB (2020). Črevná mikroflóra je spojená s dynamikou imunitných buniek u ľudí. Príroda, 588 (7837), 303–307. https://doi.org/10.1038/ s41586-020-2971-8

46. ​​Yang, J, Yang, H, Li, Y (2022) Trojité interakcie medzi črevnou mikrobiotou, mykobiotou a imunitou hostiteľa. Kritické prehľady v potravinárstve a výžive: 1–21. https://doi.org/10.1080/10408 398.2022.2094888

47. An, J., Liu, Y., Wang, Y., Fan, R., Hu, X., Zhang, F., Yang, J., & Chen, J. (2022). Úloha črevnej slizničnej bariéry pri autoimunitnom ochorení: Potenciálny cieľ. Frontiers in Immunology, 13, 871713. https://doi.org/10.3389/fmmu.2022.871713