Neštrukturálny proteín vírusu Zika 4B interaguje s DHCR7 na uľahčenie vírusovej infekcie

ABSTRAKT

Vírus Zika (ZIKV) vyvíja neštrukturálne proteíny, aby sa vyhli imunitnej odpovedi a zabezpečili účinnú replikáciu v hostiteľských bunkách. Nedávno sa zistilo, že metabolický enzým cholesterolu 7-dehydrocholesterol reduktáza (DHCR7) ovplyvňuje vrodené imunitné reakcie pri infekcii ZIKV. Avšak životne dôležitý neštrukturálny proteín a mechanizmy zapojené do DHCR7-sprostredkovaného vírusového úniku nie sú dobre objasnené. V tejto štúdii sme demonštrovali, že infekcia ZIKV uľahčila expresiu DHCR7. Je pozoruhodné, že upregulovaný DHCR7 zase uľahčil infekciu ZIKV a blokovanie DHCR7 potlačilo infekciu ZIKV. Mechanicky ZIKV neštrukturálny proteín 4B (NS4B) interagoval s DHCR7, aby vyvolal expresiu DHCR7. Okrem toho DHCR7 inhiboval fosforyláciu kinázy viažucej TANK 1 (TBK1) a interferónového regulačného faktora 3 (IRF3), čo viedlo k zníženiu produkcie génov stimulovaných interferónom-beta (IFN-) a interferónom stimulovaných génov (ISG). Preto navrhujeme, aby sa ZIKV NS4B viazal na DHCR7, aby potlačil aktiváciu TBK1 a IRF3, čo zase inhibuje IFN- a ISG, čím sa uľahčuje únik ZIKV. Táto štúdia rozširuje poznatky o tom, ako vírusové neštrukturálne proteíny antagonizujú vrodenú imunitu, aby uľahčili vírusovú infekciu prostredníctvom cholesterolových metabolických enzýmov a medziproduktov.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

1. Úvod

Ako flavivírus prenášaný komármi bol vírus Zika (ZIKV) pôvodne identifikovaný z makaka rhesus v Ugande v roku 1947. Epidémia ZIKV, ktorá prepukla po celom svete, sa stala kumulatívnou globálnou hrozbou pre zdravie v dôsledku explozívnej expanzie cez cesty komárov a cestovanie po celom svete. asymptomatické transportéry a sexuálny prenos. Väčšina infekcií ZIKV v minulých epidémiách bola asymptomatická alebo mierna (Wang et al., 2016), avšak v niekoľkých posledných epidémiách viedla infekcia ZIKV k ničivým ochoreniam, vrátane neurologických následkov počas tehotenstva (mikrocefália a úmrtie plodu) a neurologických porúch. (Guillain-Barreov syndróm) u dospelých (Cao-Lormeau a kol., 2016; Pierson a Diamond, 2020; Rasmussen a kol., 2016). Vrodený imunitný systém je prvou a kritickou líniou imunitnej obrany hostiteľa proti vírusovej infekcii. Po infekcii ZIKV bola vírusová RNA rozpoznaná intracelulárnym génom I indukovateľným kyselinou retinovou (RIG-I) (Chazal a kol., 2018; Hertzog a kol., 2018; Kato a kol., 2006), ktorý inicioval downstream vrodenú imunitu odozvy, vrátane aktivácie TANK väzbovej kinázy 1 (TBK1), fosforylácie interferónového regulačného faktora 3 (IRF3) a následne vedúcej k produkcii interferónov typu I (IFN-I) (Fitzgerald a kol., 2003; Grant a kol., 2016; Xia et al., 2018) a expresiu desiatok interferónom stimulovaných génov (ISG) s rôznymi antivírusovými účinkami (Savidis et al., 2016; Schneider et al., 2014). Imunitný systém hostiteľa produkuje IFN a ISG na obmedzenie vírusovej infekcie, avšak samotný ZIKV vyvinul rôzne únikové mechanizmy na zabezpečenie úspešného prežitia a replikácie v hostiteľskej bunke, ako je napríklad kódovanie špecifických neštrukturálnych (NS) proteínov. Genómová RNA ZIKV generuje sedem neštrukturálnych proteínov vrátane NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B a NS5 (Berthoux, 2020). ZIKV NS1 získava hostiteľskú deubikvitinázu USP8 na stabilizáciu kaspázy-1 a zoslabuje signalizáciu IFN typu I v prospech infekcie ZIKV (Zheng et al., 2018). Uvádza sa, že mutant NS1 sa viaže na TBK1 a znižuje fosforyláciu TBK1, čo vedie k zníženej produkcii IFN- (Xia et al., 2018). ZIKV NS3 sa viaže na proteíny ľudského skeletu (14-3-3ε a 14-3-3η) a sekvestruje ich (Riedl et al., 2019), zatiaľ čo NS4A interaguje s MAVS a oslabuje RIG-I- a MDA{{50} }sprostredkované vrodené imunitné odpovede (Ma et al., 2018). Najmä ZIKV NS5 viaže a degraduje signálny prevodník a aktivátor transkripcie 2 (STAT2), aby zoslabil signalizáciu IFN typu I (Grant a kol., 2016; Kumar a kol., 2016). Okrem toho sa tiež preukázalo, že NS5 interaguje s RIG-I a potláča K63--viazanú polyubikvitináciu RIG-I, čím potláča produkciu IFN- (Li et al., 2020). Okrem toho sa tiež preukázalo, že ZIKV NS2A, NS2B, NS4A a NS4B prekonávajú produkciu IFN- zacielením na diskrétne prvky v dráhe RIG-I (Xia et al., 2018). Na dosiahnutie účinnej replikácie v cicavčích bunkách sa ZIKV spolieha aj na metabolické zložky lipidov hostiteľskej bunky, aby vytvorili obal a kompletnú zostavu vírusových častíc (Chen a kol., 2020; Leier a kol., 2020). Cholesterol je jednou z lipidových zložiek bunkových membrán a podieľa sa na viacerých biologických funkciách (Ikonen, 2008). Bunková homeostáza cholesterolu je úzko modulovaná syntézou cholesterolu, vrátane absorpcie z lipoproteínových častíc a uvoľňovania do extracelulárnych akceptorov. Prakticky všetky bunky cicavcov sú závislé od metabolizmu cholesterolu (Luo et al., 2020). Hromadné dôkazy naznačujú, že metabolizmus cholesterolu sa podieľa na vrodenej imunitnej odpovedi proti vírusovej infekcii (Blanc a kol., 2013; Petersen a kol., 2014; York a kol., 2015). Po vírusovej infekcii sa syntéza cholesterolu výrazne zmenila a bola sprevádzaná zvýšenou expresiou IFN-I a ISG v makrofágoch (Li a kol., 2017; Liu a kol., 2008; York a kol., 2015). Ako kľúčový enzým v metabolizme cholesterolu cholesterol-25-hydroxyláza (CH25H) premieňa cholesterol na 25-hydroxycholesterol (25HC), ktorý bol identifikovaný ako biologický produkt, ktorý prispieva k prirodzenej imunitnej odpovedi proti veľkej väčšine vírusov vrátane vírusu ľudskej imunodeficiencie 1 (HIV-1), vírusu vezikulárnej stomatitídy (VSV), vírusu herpes simplex 1 (HSV-1), vírusu Ebola (EBOV), ZIKV, myšacieho gama herpesvírusu ( MHV68), vírus horúčky Rift Valley (RVFV) a vírus ruskej jarno-letnej encefalitídy (RSSEV) (Blanc a kol., 2013; Li a kol., 2017; Liu a kol., 2013). Súčasné štúdie sú obmedzené na skúmanie toho, ako by metabolické produkty cholesterolu (napr. 25HC) mohli manipulovať s prenosom signálu a podieľať sa na vrodenej imunite. Doteraz nie sú enzýmy alebo medziprodukty pred biosyntézou cholesterolu stále dobre objasnené. Ako životne dôležitý metabolický enzým cholesterolu by 7-dehydrocholesterol reduktáza (DHCR7) mohla vymazať dvojitú väzbu C (7–8) v kruhu B sterolov a katalyzovať cholesterol z 7-dehydrocholesterolu ({{100} }DHC) (Luu a kol., 2015). 7-DHC je tiež predchodcom vitamínu D a mutácie DHCR7 sú spojené s vyšším vitamínom D, čo naznačuje, že DHCR7 má komplikované biologické účinky na premenu cholesterolu a vitamínu D (Kuan a kol., 2013; Prabhu a kol. , 2016a). Dobre prezentovaná štúdia ukázala, že ticho DHCR7 by mohlo aktivovať dráhu PI3K-AKT3, čo vedie k fosforylácii IRF3 Ser385 a podporuje produkciu IFN- na inhibíciu viacnásobnej vírusovej infekcie in vitro a in vivo (Xiao et al., 2020). Pochopenie metabolizmu cholesterolu sprostredkovaného DHCR{116}} v imunitnom úniku sprostredkovanom proteínom ZIKV NS je však nedostatočne definované. Tu objasňujeme odlišný mechanizmus, ktorý sa ZIKV NS4B zameriava na DHCR7, kľúčový enzým v syntéze cholesterolu, aby sa zmiernila reakcia IFN-I a uľahčila sa infekcia ZIKV. Zistili sme, že infekcia ZIKV zvýšila expresiu DHCR7. Je zaujímavé, že vylepšená DHCR7 podporuje infekciu ZIKV, zatiaľ čo znižovanie alebo zacielenie DHCR7 pomocou inhibítorov môže potlačiť infekciu ZIKV. Okrem toho ZIKV NS4B mohol viazať DHCR7, a tak indukovať expresiu DHCR7, čo inhibovalo aktiváciu TBK1 a IRF3 a viedlo k zníženiu produkcie IFN- a ISG. Preto navrhujeme, aby väzba ZIKV NS4B na DHCR7 znížila aktiváciu IRF3, čo zase inhibuje IFN- a ISG, aby sa uľahčil únik ZIKV. Táto štúdia rozširuje nové poznatky o tom, ako neštrukturálny proteín ZIKV ruší vrodenú imunitu, aby uľahčil vírusovú infekciu prostredníctvom interakcie s metabolickými enzýmami cholesterolu.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Materiály a metódy

2.1. Bunkové línie

Bunky U251 boli zakúpené od China Center for Type Culture Collection (CCCTC) (Wuhan, Čína). Bunky obličiek Cercopithecus aethiops (Vero), bunky ľudskej embryonálnej obličky (HEK 293T) a bunky ľudského adenokarcinómu pľúc (A549) boli zakúpené od American Tissue Culture Collection (ATCC). Bunky sa udržiavali v Dulbeccovom modifikovanom Eagle médiu (DMEM) (Gibco) doplnenom 10 % fetálnym hovädzím sérom (FBS) (Gibco), penicilínom (100 U/ml) a streptomycín sulfátom (100 ug/ml) pri 37 °C a 5 % CO2. Bunky Aedes albopictus (C6/36) sa kultivovali v minimálnom esenciálnom médiu (MEM) doplnenom 10 % FBS, penicilínom (100 U/ml) a streptomycínsulfátom (100 ug/ml) pri 28 °C s 5 % C02.

2.2. Amplifikácia, titrácia a infekcia ZIKV

Izolát ZIKV z16006 (prírastkové číslo GenBank, KU955589.1) sa kultivoval v bunkách C6/36 a ZIKV sa rozdelil na alikvóty v zmrazovacích fľaštičkách a skladoval sa pri 80 °C. Titre ZIKV sa merali plakovým testom. Bunky boli infikované ZIKV pri indikovanej multiplicite infekcie (MOI) počas 2 hodín, potom nasledovalo premytie fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS) a potom kultivované, zozbierané a skúmané.

2.3. Plazmidy a činidlá

Expresný plazmid pcDNA3.1(þ)-3 Flag sa použil na klonovanie jednotlivých génov ZIKV zo zodpovedajúcich fragmentov cDNA ZIKV. Aby sa skonštruoval pGEX6p-1-NS4B, ZIKV NS4B sa subklonoval do vektora pGEX6p-1 pomocou ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech, Nanjing, Čína). cDNA kódujúce ľudský DHCR7, RIG-I, TBK1 a IRF3 klonované do vektora pCAGGS-HA alebo vektora pcDNA3.1 (þ)-3 Flag sa skonštruovali štandardnou metódou molekulárneho klonovania. Missense mutácia G410S DHCR7 bola skonštruovaná pomocou miestne cielenej mutagenézy. Monoklonálny králičí anti-ZIKV obal (GTX133314) bol zakúpený od GeneTex (Irvine, CA, USA). Králičia polyklonálna anti-DHCR7 (A8049), králičia monoklonálna anti-ISG15 (A2416), králičia monoklonálna anti-TBK1 (A3458), králičia monoklonálna anti-P-TBK1 na Ser172 (AP1026), králičia polyklonálna anti-IRF3 (A11118), anti -králičí IgG (ac005) a anti-myší IgG (ac011) boli zakúpené od ABClonal Technology (Wuhan, Čína). Antimyšie FITC a anti-králičie Cy3 sekundárne protilátky boli zakúpené od Abbkine (Wuhan, Čína). Králičia monoklonálna anti-P-IRF3 na Ser396 (29047S) a králičia monoklonálna anti-ISG56 (14769S) boli zakúpené od Cell Signaling Technology (CST, Boston, MA, USA). Myšia monoklonálna anti-Flag (F3165), králičia monoklonálna anti-HA (H6908) a myšacia monoklonálna anti-GAPDH (G9295) boli zakúpené od Sigma (St Louis, MO, USA). Myšia monoklonálna antiFlavivírusová skupina antigén-protilátka (MAB10216) bola zakúpená od Millipore (Mass, USA). Lipofectamine 2000 (11668-027) a Trizol (15596018) boli zakúpené od Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA). Poly(I:C) bol zakúpený od InvivoGen (San Diego, CA, USA).

2.4. Plakový test

Supernatant obsahujúci ZIKV sa zriedil bezsérovým DMEM a infikovali sa Vero bunky na 12-jamkovej platni počas 2 hodín, potom sa dvakrát premyli 1 ml PBS. DMEM obsahujúce 2 % FBS a 2 % agarózy s nízkou teplotou topenia sa dobre premiešali v objemovom pomere 1:1 a do každej jamky sa pridal 1 ml zmesi. Infikované bunky sa kultivovali pri 37 °C s 5 % CO2 počas 5 až 7 dní. Bunky boli fixované 4% paraformaldehydom počas 1 hodiny a farbené 0,5% kryštálovou violeťou počas 30 minút. 12-jamková platňa sa premyla vodou a vypočítali sa plaky.

2.5. Produkcia a infekcia lentivírusu

Cieľové sekvencie shRNA pre ľudský DHCR7 boli nasledovné: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. Vektor pLKO.1 nesúci zmiešanú shRNA pre negatívnu kontrolu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) alebo špecifickú cieľovú sekvenciu sa transfekoval do buniek HEK293T spolu s psPAX2 a pMD2.G s Lipofectamine 2{{19} }00. Vírusové častice obsahujúce supernatanty sa zozbierali 36 hodín po transfekcii a potom sa centrifugovali pri 210 g počas 10 minút. Fáza supernatantu bez buniek sa prefiltrovala cez 0,45 um filter, aby sa odstránili zvyšky buniek. Bunky U251 boli infikované lentivírusovými časticami v prítomnosti 8 ug/ml polybrénu. Po 48 hodinách kultivácie boli bunky U251 selektované puromycínom (2 ug/ml, Sigma). Účinnosť knock-down sh-DHCR7 bola stanovená pomocou RT-PCR a analýzy Western blot.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

2.6. Western blot

Bunky sa lyžovali RIPA pufrom doplneným o inhibítory proteázy a inhibítory fosfatázy na ľade počas 1 hodiny, potom sa centrifugovali pri 4 °C, 13,000 g počas 1{{10}} min, aby sa bunky zozbierali lyzát. Koncentrácia proteínu v bunkovom lyzáte sa merala proteínovým testom s kyselinou bicinchonínovou (BCA). Proteín bol separovaný pomocou SDS-PAGE a potom prenesený na polyvinyldifluoridovú (PVDF) membránu. PVDF membrána bola blokovaná imunoblotovacím blokovacím pufrom TBST (10 mmol/l Tris-HCI, pH 7,4, 0,15 mol/l NaCl a 0,05 % Tween-20) obsahujúcim 5 % BSA počas 1 hodiny. Po premytí TBST bola membrána inkubovaná s primárnymi protilátkami a druhými protilátkami a následne detegovaná pomocou chemiluminiscenčného zobrazovacieho systému (Bio-Rad).

2.7. Test celkového cholesterolu

Celkový cholesterol v bunkách sa detegoval pomocou súpravy na stanovenie celkového cholesterolu Tissue od spoločnosti Applygen Technologies Inc. (Peking, Čína). Štandard cholesterolu 5 mmol/l sa podrobil sériovému riedeniu bezvodým etanolom, aby sa nakreslila štandardná krivka, a množstvá celkového cholesterolu v bunkách sa vypočítali podľa štandardných kriviek. Experiment sa uskutočnil podľa postupu poskytnutého výrobcom.

2.8. Koimunoprecipitačné testy

Bunky HEK293T boli transfekované uvedenými plazmidmi. Bunky boli zozbierané a lyzované s RIPA lyzačným pufrom doplneným o inhibítory proteázy. Po centrifugácii pri 18,000 g počas 15 minút pri 4 °C boli bunkové lyzáty zozbierané a imunoprecipitované pomocou Flag-Trap ProteinG Sepharose (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) počas 4 hodín pri 4 °C. Naviazané proteíny boli eluované 2 nanášacím pufrom a analyzované imunoblotovaním.

2.9. PCR v reálnom čase

Celková RNA sa extrahovala z buniek pomocou činidla TRIzol (Invitrogen Life Technologies) a cDNA sa vyrobila pomocou súpravy M-MLV reverznej transkriptázy (Promega, Madison, WI, USA). RT-PCR sa uskutočnila pomocou súprav SYBR RT-PCR (DBI Bio-science) na Roche LC480. Glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH) mRNA sa stanovila ako endogénna referencia na normalizáciu mRNA a hladiny génovej expresie sa vypočítali pomocou metódy 2 ΔACT. Sekvencie RT-PCR primérov sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1. 2.10. Konfokálna mikroskopia

Bunky U251 boli transfekované plazmidom a kultivované počas 3 0 hodín, potom boli trikrát premyté PBS. Bunky boli fixované 4% paraformaldehydom počas 15 minút a permeované PBS obsahujúcim 0,1% TritonX-100 počas 5 minút. Po premytí PBS sa bunky uzavreli s PBS obsahujúcim 5 % BSA počas 30 minút. Bunky boli trikrát premyté PBS a inkubované s anti-HA, anti-FLAG a anti-flavivírusom, potom inkubované s anti-myšacím FITC a anti-králičím Cy3 sekundárnymi protilátkami. Bunky boli zafarbené 40,6-diamidino-2-fenylindol dihydrochloridom (DAPI) a uskutočnené pomocou konfokálneho mikroskopu Olympus.

2.11. GST pull-down testy

Plazmid pGEX6p-1-NS4B bol transfekovaný do Escherichia coli (E. coli) kmeňa BL21. GST a GST-NS4B boli indukované IPTG s konečnou koncentráciou 0,5 mmol/l a kultúry boli pestované ďalších 6–8 hodín pri 37 °C. A potom GST proteín a GST- Proteín NS4B bol purifikovaný z baktérií E. coli. Proteín GST alebo GST-NS4B bol inkubovaný s guľôčkami glutatión-Sepharose (Novagen) a trikrát premytý PBS. GST a GST-NS4B proteín sa inkubovali s eukaryotickým fúznym proteínom HA-DHCR7, ktorý pochádza z plazmidov kódujúcich HA-DHCR7-exprimované bunkové lyzáty HEK293T počas 4 hodín pri 4 °C. Precipitáty sa päťkrát premyli a povarili v 2 SDS nanášací pufor a detegovaný Western blotom s anti-GST a anti-HA protilátkami.

2.12. HA-DHCR7 miestne riadená mutagenéza

Boli syntetizované vhodné páry mutagénnych primérov (doplnková tabuľka S1) a použité na vytvorenie mutovaného konštruktu pomocou PCR. HA-DHCR7 sa použil ako templát pre PrimeSTAR® HS Premix (Takara). Po PCR sa plazmid divokého typu zostávajúci v produkte PCR selektívne štiepil pomocou DpnI (New England Biolabs). Rozštiepený produkt PCR sa transfekoval do kmeňa E. coli DH5. Požadovaný mutant bol potvrdený Sangerovou sekvenčnou analýzou.

cistanche rastlina zvyšujúca imunitný systém

2.13. Štatistická analýza

Všetky experimenty sa opakovali aspoň trikrát s podobnými výsledkami. Údaje sú vyjadrené ako priemerná štandardná odchýlka (SD). Význam variability bol stanovený Studentovým dvojstranným nepárovým t-testom pre dvojskupinovú alebo jednosmernú ANOVA s Dunnettovým testom viacnásobného porovnania alebo dvojcestnou ANOVA so Sidakovým viacnásobným porovnávacím testom pre viacnásobné skupinové porovnania pomocou softvéru GraphPad Prism (verzia 8.{6}}.1). Hodnota P < 0.{{10}}5 bola považovaná za štatisticky významnú a P > 0.05 bola označená ako štatisticky nevýznamná. Pre všetky údaje bola významnosť prezentovaná ako *P < 0,05, **P < 0,01 a ***P < 0,001.

3. Výsledky

3.1. Infekcia ZIKV indukuje expresiu DHCR7

Hromadné dôkazy ukázali, že metabolizmus cholesterolu ovplyvňuje vrodené imunitné reakcie hostiteľa proti infekcii flavivírusom, ako je ZIKV a vírus dengue (DENV) (Leier et al., 2020; Randall, 2018). DHCR7 kóduje enzým, ktorý transformuje 7-DHC na cholesterol, čo je posledný krok v biosyntéze cholesterolu (Moebius et al., 1998). Najprv sme detegovali expresiu DHCR7 po infekcii ZIKV. Ľudský astrocyt U251 bol infikovaný ZIKV, ktorý v závislosti od dávky zvýšil expresiu DHCR7 na mRNA aj proteíne (obr. 1A-C). Na potvrdenie tohto javu sme ďalej skúmali expresiu DHCR7 v bunkách Vero a zistili sme, že infekcia ZIKV v podstate vyvolala expresiu DHCR7 (obr. 1D-F), čo bolo v súlade s výsledkami v bunkách U251.

cistanche benefity-posilňujú imunitný systém

3.2. Zacielenie na DHCR7 vyvoláva kritickú aktivitu proti ZIKV

Na vyhodnotenie účinkov DHCR7 proti infekcii ZIKV sa bunky U251 a A549 transfekovali plazmidom kódujúcim HA-DHCR7 a potom sa infikovali ZIKV (MOI ¼ 1). Výsledky ukázali, že nadmerná expresia DHCR7 významne zvýšila expresiu mRNA ZIKV (obr. 2A a B). Pozoruhodné je, že s akumuláciou proteínu DHCR7 sa zvýšila aj expresia štruktúrneho proteínu E ZIKV (obr. 2C a D). Okrem toho sme ďalej vykonali plakový test s použitím supernatantu z obr. 2C a zistili sme, že nadmerná expresia DHCR7 významne zvýšila plakotvorné jednotky v porovnaní s kontrolnou skupinou (obr. 2E a F). Uvádza sa, že missense mutácia G410S DHCR7 ruší aktivitu enzýmu (Fitzky a kol., 1998; Shim a kol., 2004; Witsch-Baumgartner a kol., 2000). Na ďalšie určenie účinkov DHCR7 na infekciu ZIKV sme ďalej skonštruovali neaktívny mutant DHCR7 (G410S). V porovnaní s divokým typom DHCR7 mohol mutant G410S významne inhibovať infekciu ZIKV (obr. 2G). Na potvrdenie pozorovania sme tiež vykonali test konfokálnej mikroskopie. Ako je znázornené na obr. 2H, nadmerná expresia DHCR7 zvýšila infekciu ZIKV. Aby sme určili, či je endogénna enzýmová aktivita DHCR7 kritická pre infekciu ZIKV, navrhli sme dve krátke vlásenkové RNA (shDHCR7-1 a sh-DHCR7-2) špecificky zacielené na DHCR7 a vytvorili sme bunku U251 umlčanú DHCR7- línie so systémom shRNA (obr. 3A). Nakoniec sme vybrali sh-DHCR7-1 pre jeho vyššiu účinnosť tlmenia. V porovnaní s kontrolnou shRNA transdukovanou bunkovou líniou tieto knockdown bunky DHCR7 vykazovali nižšiu náchylnosť na infekciu ZIKV (obr. 3B a C). Ďalej sme použili selektívny inhibítor DHCR7 AY9944, ktorý zabraňuje konverzii 7-DHC na cholesterol (Xu et al., 2011), o ktorom sa preukázalo, že inhibuje enzymatickú aktivitu DHCR7 (Horlick, 1966; Moebius et al., 1998). V porovnaní s kontrolou podávanie AY9944 v závislosti od dávky inhibovalo infekciu ZIKV v bunkách U251 (obr. 3D-F). Plakový test sa tiež uskutočnil v bunkách Vero, aby sa ďalej vyhodnotili účinky DHCR7 a ukázalo sa, že AY9944 môže významne potlačiť infekciu ZIKV (obr. 3G a H). Pozoruhodné je, že konfokálna mikroskopia ukázala, že proteín ZIKV E bol podstatne znížený v prítomnosti AY9944 (obr. 31). Tieto zistenia ukázali, že zacielenie na DHCR7 by mohlo inhibovať infekciu ZIKV.

Obr. 1. Infekcia ZIKV indukuje expresiu DHCR7. Bunky A–F U251 a Vero boli infikované ZIKV (MOI ¼ 0, 1 a 2) počas 24 hodín a hladiny intracelulárnej RNA ZIKV (A, D) a DHCR7 (B, E) boli stanovené pomocou RT-PCR s GAPDH ako internou kontrolou. Relatívne hladiny proteínov obalov DHCR7 a ZIKV sa detegovali pomocou Western blotu (C, F). Údaje sú z najmenej troch nezávislých experimentov (priemer SD) alebo reprezentatívnych údajov (C, F). Štatistická významnosť sa vypočítala s použitím jednosmernej ANOVA s Dunnettovým mnohonásobným porovnávacím testom (A, B, D, E). **P < 0.01, ***P < 0,001. SD, štandardná odchýlka.

3.3. DHCR7 inhibuje aktiváciu TBK1 a IRF3, aby sa znížila produkcia IFN- a ISG

Keďže DHCR7 je životne dôležitý enzým na premenu 7-DHC na cholesterol (Moebius et al., 1998) a infekcia ZIKV by mohla zvýšiť expresiu DHCR7, zmerali sme hladinu cholesterolu pri infekcii ZIKV. Zistili sme, že infekcia ZIKV má malý vplyv na syntézu cholesterolu v bunkách U251 a Vero (obr. 4A a B), hoci DHCR7 bola zvýšená (obr. 1A–D). Vzhľadom na zvýšenú DHCR7 po infekcii ZIKV a kľúčové úlohy IFN pri konfrontácii s infekciou ZIKV sme ďalej určili účinok DHCR7 na signálnu dráhu IFN-I. Kontrolné bunky a bunky U251 umlčujúce DHCR{11}} boli infikované ZIKV alebo transfekované poly(I:C) a skúmala sa expresia IFN-. V porovnaní s kontrolnou skupinou infekcia ZIKV alebo liečba poly(I:C) výrazne zvýšila expresiu IFN- v bunkách U251 umlčujúcich DHCR7- (obr. 4C a D). ISG sú efektormi pôsobenia interferónu a hrajú hlavnú úlohu vo vrodenej imunitnej obrane proti infekcii ZIKV. Tiež sme demonštrovali blokovanie DHCR7 by mohlo významne posilniť expresiu ISG15 a ISG56 na úrovni mRNA a proteínov (obr. 4E-J). V súlade s tým by liečba inhibítorom DHCR7 AY9944 mohla indukovať expresiu IFN-, ISG15 a ISG56 (obr. 4K, L). Dôležité je, že inaktívny mutant G410S by mohol čiastočne zvrátiť inhibičné účinky DHCR7 na expresiu IFN- a ISG (obr. 4M, N). Aktivácia TBK1 a IRF3 je nevyhnutná pre indukciu IFNs-ISG, preto sme ďalej skúmali účinok DHCR7 na expresiu a aktiváciu TBK1 a IRF3. Preukázali sme, že DHCR7 nielen v závislosti od dávky inhibuje hladinu proteínu, ale potláča aj hladinu fosforylácie TBK1 a IRF3 (obr. 5A-C). Okrem toho inaktívny mutant G410S neúplne zvrátil inhibičné účinky DHCR7 na fosforyláciu IRF3 a TBK1 (obr. 5D). V rozpore so zisteniami nadmernej expresie DHCR7 by liečba AY9944 mohla indukovať aktiváciu IRF3 a TBK1 v bunke U251 (obr. 5E).

3.4. ZIKV NS4B interaguje s DHCR7 a inhibuje fosforyláciu TBK1 a IRF3

Pribúdajúce dôkazy odhalili, že ZIKV vyvinul špecifické NS proteíny na uľahčenie účinnej replikácie v hostiteľských bunkách priamym obchádzaním vrodenej a adaptívnej imunity hostiteľa prostredníctvom množstva diskrétnych mechanizmov. Vykonali sme ko-IP test na skríning jednotlivého proteínu ZIKV NS, ktorý by mohol interagovať s DHCR7. Bunky HEK293T boli kotransfekované s pCMV-DHCR7-HA a plazmidom exprimujúcim individuálny NS proteín fúzovaný s Flag-tag. Ako je znázornené na obr. 6A, DHCR7 sa viaže iba na NS4B, ale nedokáže interagovať s inými NS proteínmi. Ďalej sa uskutočnili recipročné ko-IP testy a ukázali, že proteín NS4B interagoval s DHCR7 v bunkách HEK293T (obr. 6B a C). Na potvrdenie interakcie NS4B a DHCR7 sme ďalej vykonali konfokálny mikroskop a zistili sme, že proteín NS4B a proteín DHCR7 boli kolokalizované v cytoplazme (obr. 6D). GST pull-down test ďalej demonštroval interakciu NS4B a DHCR7 (obr. 6E). Navyše prechodná transfekcia NS4B v bunkách U251 by mohla dramaticky indukovať expresiu DHCR7 (obr. 6F). Dôležité je, že NS4B mohol v závislosti od dávky blokovať fosforyláciu TBK1 aj IRF3, čo pozitívne korelovalo so zvýšenou aktiváciou TBK1 a IRF3 v reakcii na DHCR7 (obr. 6G a H). Avšak nadmerná expresia NS4B v bunkách HEK293T významne znížila hladinu proteínu TBK1, ale mala malý vplyv na proteín IRF3 (obr. 6G a H). Na ďalšie potvrdenie týchto pozorovaní bol NS4B transfekovaný do DHCR7 knockdown buniek U251 a vykazoval inhibičné účinky na endogénny proteín a hladiny fosforylácie TBK1 a IRF3 (obr. 61). Celkovo tieto výsledky ukázali, že ZIKV NS4B interagoval s DHCR7 a zvýšil expresiu DHCR7, aby blokoval aktiváciu TBK1 a IRF3 a potom uľahčil infekciu ZIKV.

Obr. 2. Nadmerná expresia DHCR7 podporuje replikáciu ZIKV. Bunky A–D U251 a A549 boli transfekované HA-vektorom alebo HA-DHCR7 v uvedených koncentráciách počas 12 hodín a potom infikované ZIKV počas ďalších 36 hodín. Hladiny ZIKV RNA sa detegovali pomocou RT-PCR s GAPDH ako internou kontrolou (A, B) a hladiny proteínov obalu ZIKV, HA-DHCR7 a GAPDH sa detegovali pomocou Western blotu (C, D). Bunky E, F Vero boli infikované supernatantom obsahujúcim ZIKV z obr. 2C počas 48 hodín, aby sa stanovili kópie ZIKV testom plakov. Bunky G U251 sa transfekovali HA-vektorom, HA-DHCR7 alebo HA-DHCR7 (G410S) počas 12 hodín a infikovali sa ZIKV počas 36 hodín a hladiny proteínov v obale ZIKV, HA-DHCR7 a GAPDH sa detegovali Western blotom. Bunky H U251 boli transfekované HA-vektorom alebo HA-DHCR7 (1 ug) počas 12 hodín infikovaných ZIKV počas 36 hodín a následne inkubované s myšími anti-flavivírusovými a králičími anti-HA protilátkami, po farbení s FITC-konjugovanou antimyšou a Cy3-konjugované anti-králičie sekundárne protilátky. Jadrá boli zafarbené DAPI. Obrázky boli vizualizované konfokálnou mikroskopiou. Mierka ¼ 10}0 μm. Údaje sú z najmenej troch nezávislých experimentov (priemer SD) alebo reprezentatívnych údajov (C, D, E, G, H). Štatistická významnosť sa vypočítala pomocou Studentovho dvojstranného nepárového t-testu (F) alebo jednosmernej ANOVA s Dunnettovým viacnásobným porovnávacím testom (A, B). *P < 0,05, ***P < 0,001. SD, štandardná odchýlka.

4. Diskusia

IFN typu I a ich downstream ISG konfrontujú veľkú sériu patogénov a hrajú kľúčovú úlohu v imunitnej obrane hostiteľa proti ZIKV (Lazear et al., 2016). Aby sa vyhol dohľadu sprostredkovanému IFN a dosiahol dostatočnú replikáciu, ZIKV vyvíja NS proteíny zacielené na rôzne body signálnej dráhy IFN, aby unikli z bunkového vrodeného imunitného systému (Lee et al., 2021). Montážne štúdie ukázali, že ZIKV NS1, NS3, NS4A a NS5 inhibujú odlišné moduly dráhy RIG-I/IFN-I a uľahčujú vírusovú infekciu pomocou nezávislých a rôznych mechanizmov (Grant a kol., 2016; Kumar a kol., 2016 ; Ma a kol., 2018; Riedl a kol., 2019; Xia a kol., 2018; Zheng a kol., 2018). Špecifický mechanizmus ZIKV NS4B pôsobiaci proti imunitnej reštrikcii je však nedostatočne definovaný. ZIKV NS4B je extrémne hydrofóbny proteín pozostávajúci z 251 aminokyselín a nachádza sa v membráne endoplazmatického retikula s N-koncom (Zou et al., 2014). Inhibícia NS4B signálnej dráhy IFN-I bola identifikovaná v rôznych flavivírusoch (Ding a kol., 2013; Munoz-Jordan a kol., 2003, 2005; Shan a kol., 2021; Yi a kol., 2016; Zhang a kol. al., 2021). Nedávna štúdia uviedla, že kmeň ZIKV INMI1 izolovaný v Brazílii využíva NS4B na antagonizáciu downstream signálnej dráhy IFN-I rozdrvením fosforylácie STAT1 a následným prerušením jadrového transportu STAT1 (Fanunza et al., 2021). V tejto štúdii sme našli odlišný mechanizmus, v ktorom ZIKV NS4B zrušil produkciu IFN- potlačením fosforylácie TBK1 a IRF3, čo je protismerná zložka signálnej dráhy IFN-I. Najmä substitúcia aminokyselín (G18R) bola objavená v ZIKV NS4B, čo prispelo k zníženiu produkcie IFN- a oslabenej expresii ISG, a následne uľahčilo vírusovú infekciu u myší, čo naznačuje význam NS4B ako determinantu patogenézy (Gorman et al. ., 2018). Nové dôkazy naznačujú kritický význam metabolizmu cholesterolu podieľajúceho sa na vrodenej imunitnej odpovedi (Akula a kol., 2016; Dang a kol., 2017; Reboldi a kol., 2014; York a kol., 2015). Hoci bolo zdokumentované, že niekoľko medziproduktov v metabolizme cholesterolu má široké antivírusové účinky (Blanc a kol., 2013; Li a kol., 2017; Liu a kol., 2013; Xiao a kol., 2020), naša štúdia ilustrovala nový mechanizmus že cholesterolový metabolický enzým DHCR7 sa podieľal na infekcii ZIKV oslabením aktivácie TBK1 a IRF3, aby sa uľahčila vírusová infekcia. Ako kľúčový enzým podieľajúci sa na metabolizme desmosterolu a cholesterolu predstavuje DHCR7 premenu konverzie 7-DHC na vitamín D v kožných bunkách vystavených UVB (Prabhu et al., 2016b). Okrem toho je DHCR7 umiestnený nielen na bráne Blochovej dráhy, ale aj na konci Kandutsch-Russellovej dráhy (Prabhu et al., 2016a, 2016b), ktorá hrá dôležitú úlohu pri kontrole syntézy cholesterolu. Presluchy DHCR7 a jeho interakcia s inými enzýmami v niekoľkých dráhach môže posilniť viaceré funkcie v rôznych typoch buniek alebo orgánoch. Predchádzajúca štúdia odhalila, že blokovanie DHCR7 by mohlo znížiť desmosterol, bezprostredný prekurzor biosyntézy cholesterolu, a tým poskytnúť dostatočnú ochranu pred infekciou HCV (Luu a kol., 2015; Rodgers a kol., 2012). Dôležité je, že Xiao a kol. ukázali, že infekcia VSV znižuje expresiu DHCR7, čo vedie k zníženiu cholesterolu, ale k oveľa väčšej 7-akumulácii DHC v makrofágoch a pečeni (Xiao et al., 2020). Makrofágy ošetrené 7-DHC vyvolali zvýšenú antivírusovú odpoveď; zatiaľ čo pridanie cholesterolu vykazovalo slabú ochranu. Inhibítory DHCR7 a podávanie 7-DHC môžu byť užitočnými prístupmi v boji proti vírusovým infekciám, ako sú HIN1, HSV a VSV. V tejto štúdii sme zistili, že inhibítor DHCR7 AY9944 môže potlačiť infekciu ZIKV. Naša štúdia však odhalila, že infekcia ZIKV indukovala expresiu DHCR7, ale mala malý vplyv na biosyntézu cholesterolu v gliových bunkách. Neskúmali sme úroveň 7-expresie DHC po infekcii ZIKV, napriek tomu stojí za to ďalej skúmať, či 7-DHC a AY9944 majú synergickú terapeutickú účinnosť pri liečbe pacientov, ktorí boli infikovaní ZIKV infekcia v mozgu. Nadmerná expresia DHCR7 podporovala infekciu ZIKV, zatiaľ čo liečba selektívnym inhibítorom DHCR7 (AY9944) silne zvýšila produkciu IFN- proti infekcii ZIKV. Aktivácia TBK1 a IRF3 je životne dôležitá pre aktiváciu signalizácie IFN-I. Predchádzajúce skúmanie ukázalo, že umlčanie DHCR7 alebo liečba 7-DHC aktivovala dráhu PI3K-AKT3 na fosforyláciu IRF3, ale nie TBK1 v makrofágoch (Xiao et al., 2020). Naše zistenia však ukázali, že DHCR7 v závislosti od dávky znižoval expresiu IRF3 a TBK1, ako aj fosforyláciu IRF3 a TBK1. Tieto výskumy naznačujú, že DHCR7 môže prispieť k infekcii ZIKV v mechanizme v mozgu nezávislom od metabolizmu cholesterolu. Bolo dobre objasnené, že ZIKV využívala NS proteíny na priamu interakciu s rôznymi zložkami dráhy RIG-I / IFN-I, aby sa vyhla imunitnej odpovedi a uľahčila replikáciu vírusu. Predtým sme uviedli interakciu ZIKV NS5 s RIG-I na zmiernenie produkcie IFN- (Li et al., 2020). Iní preukázali, že ZIKV NS1 a NS2B zacielené na TBK1, NS3 zacielené na RIG-I a MDA5 na zníženie produkcie IFN-I a ISG (Lee et al., 2021; Riedl et al., 2019). Funkcia proteínov ZIKV NS zameraných na metabolizmus cholesterolu však zostáva do značnej miery nepolapiteľná. V tejto štúdii sme tiež ilustrovali neohlásenú interakciu medzi cholesterolovým metabolickým enzýmom DHCR7 a proteínmi ZIKV NS. Ukázali sme, že DHCR7 sa špecificky viaže na NS4B, nie na iné NS proteíny. Poskytli sme kritický dôkaz, že ZIKV NS4B interagoval s DHCR7 a v podstate indukoval jeho expresiu, čo bolo v súlade s výsledkami v bunkách U251 po infekcii ZIKV. Dôležité je, že okrem priameho preukázania zapojenia DHCR7 a ZIKV NS4B sme tiež zistili, že ZIKV NS4B zvýšil expresiu DHCR7, aby inhiboval fosforyláciu TBK1 a IRF3 a uľahčil infekciu ZIKV. V súlade s našimi výsledkami nedávna štúdia odhalila, že nedostatok DHCR7 by mohol aktivovať signalizáciu IRF3 a IFN na inhibíciu VSV a iných vírusov v makrofágoch.

Obr. 3. Knockdown DHCR7 znižuje infekciu ZIKV v bunkách U251. Bunky U251 boli transdukované lentivírusovými časticami obsahujúcimi shRNA proti DHCR7 (shDHCR7-1 a sh-DHCR7-2) alebo necieľovej sekvencii (sh-NTC), po čom nasledovala puromycínová selekcia počas 14 dní. Účinnosť knockdownu bola stanovená pomocou RT-PCR. B, C Bunky U251 na umlčanie DHCR7- (sh-DHCR7) a sh-NTC U251 boli simulovane infikované alebo infikované ZIKV (MOI ¼ 1) počas 36 hodín. Hladina intracelulárnej ZIKV RNA sa detegovala pomocou RT-PCR s GAPDH ako internou kontrolou (B) a hladiny proteínov obalu ZIKV, DHCR7 a GAPDH sa detegovali pomocou Western blotu (C). Bunky D, E U251 boli ošetrené inhibítorom DHCR7 AY9944 v uvedenej koncentrácii počas 2 hodín, potom boli infikované ZIKV (MOI ¼ 1) počas 48 hodín. Bunky sa podrobili RT-PCR na detekciu ZIKV RNA (D). Hladiny proteínov obalu ZIKV, DHCR7 a GAPDH sa detegovali pomocou Western blotu (E). Bunky F U251 boli ošetrené inhibítorom DHCR7 AY9944 v uvedenej koncentrácii počas 36 hodín a DHCR7 a GAPDH sa detegovali pomocou Western blotu. Bunky G, H Vero boli infikované supernatantom obsahujúcim ZIKV z obr. 3E počas 48 hodín, aby sa stanovili kópie ZIKV testom plakov. I bunky U251 boli ošetrené AY9944 v uvedenej koncentrácii počas 2 hodín, potom boli infikované ZIKV pri MOI ¼ 1 počas 36 hodín. Obrázky boli vizualizované konfokálnou mikroskopiou. Mierka ¼ 10}0 μm. Údaje pochádzajú z najmenej troch nezávislých experimentov (priemer SD) alebo reprezentatívnych údajov (C, E, F, G a I). Štatistická významnosť sa vypočíta pomocou jednosmernej ANOVA s Dunnettovým viacnásobným porovnávacím testom (A, D, H) alebo dvojcestnej ANOVA so Sidakovým viacnásobným porovnávacím testom (B). ***P < 0,001. SD, štandardná odchýlka.

Obr. 4. DHCR7 inhibuje produkciu IFN- a ISG. Bunky A, B U251 a Vero boli infikované ZIKV (MOI ¼ 0, 0,5 a 1) počas 24 hodín a bunkový cholesterol sa meral pomocou súpravy na stanovenie celkového cholesterolu v tkanivách. C–H DHCR7- umlčujúce bunky U251 (sh-DHCR7) a sh-NTC U251 boli infikované ZIKV (MOI ¼ 1) alebo ošetrené Poly(I: C) (1 ug/ml) počas 6 hodín. Celková bunková RNA bola extrahovaná a podrobená RT-PCR na expresiu mRNA s GAPDH ako internou kontrolou. Relatívne expresie IFN- a ISG boli normalizované na expresiu vzoriek sh-NTC vo falošnej skupine a násobné zmeny sa ukázali ako neprimerané. IFN- (C, D), ISG15 (E, F) a ISG56 (G, H). Bunky I, J DHCR7-umlčanie U251 (sh-DHCR7) a sh-NTC U251 boli infikované ZIKV (MOI ¼ 1) alebo transfekované Poly(I:C) (1 ug/ml) počas 24 hodín, a hladiny proteínov ISG15, ISG56 a GAPDH sa detegovali pomocou Western blotu. Bunky K U251 sa ošetrili indikovanou dávkou AY9944 počas 2 hodín, potom sa infikovali ZIKV (MOI ¼ 1) počas 6 hodín. Hladina IFN-RNA bola detegovaná pomocou RT-PCR s GAPDH ako internou kontrolou. Bunky L U251 boli ošetrené indikovanou dávkou AY9944 počas 2 hodín a potom infikované ZIKV (MOI ¼ 1) počas 24 hodín. Hladiny proteínov ISG15, ISG56 a GAPDH sa detegovali pomocou Western blotu. Bunky M U251 boli transfekované HA-vektorom, HA-DHCR7 alebo HA-DHCR7 (G410S) počas 24 hodín a infikované ZIKV (MOI ¼ 1) počas 6 hodín. Hladiny IFN-RNA sa detegovali pomocou RT-PCR s GAPDH ako internou kontrolou. Bunky N U251 boli transfekované HA-vektorom, HA-DHCR7 alebo HA-DHCR7 (G410S) počas 24 hodín a potom infikované ZIKV (MOI ¼ 1) počas 24 hodín. Hladiny proteínov ISG15, ISG56 a GAPDH sa detegovali pomocou Western blotu. Údaje sú z najmenej troch nezávislých experimentov (priemer SD) alebo reprezentatívnych údajov (I, J, L, N). Štatistická významnosť sa vypočíta pomocou jednosmernej ANOVA s Dunnettovým viacnásobným porovnávacím testom (A, B, K, M) alebo dvojcestnej ANOVA so Sidakovým mnohonásobným porovnávacím testom (C–H). ns, P > 0,05, *** P < 0,001. SD, štandardná odchýlka.

Obr. 5. DHCR7 inhibuje aktiváciu TBK1 a IRF3. A, B Bunky HEK293T boli kotransfekované s TBK1-kódujúcim plazmidom spolu s DHCR7-exprimujúcim plazmidom alebo prázdnym vektorom (A). Bunky HEK293T boli kotransfekované plazmidom kódujúcim IRF{10}}, plazmidom kódujúcim RIG-I, spolu s plazmidom exprimujúcim DHCR{12}} alebo prázdnym vektorom (B). Bunky sa zozbierali 24 hodín po transfekcii a podrobili sa Western blotu s uvedenými protilátkami [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-PIRF3 (S396), anti-HA a anti-GAPDH ]. Bunky C U251 boli transfekované uvedenou dávkou plazmidu exprimujúceho DHCR7 alebo prázdnym vektorom počas 24 hodín. Bunky sa potom infikovali ZIKV (MOI ¼ 1) zozbierané 6 hodín po infekcii a podrobili sa Western blotu s uvedenými protilátkami [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3( S396), anti-HA a anti-GAPDH]. Bunky D U251 boli transfekované HA-vektorom, HA-DHCR7 alebo HA-DHCR7 (G410S) počas 24 hodín. Bunky sa potom infikovali ZIKV (MOI ¼ 1) zozbierané 6 hodín po infekcii a podrobili sa Western blotu s uvedenými protilátkami [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-PIRF3 (S396) anti-HA a anti-GAPDH]. Bunky E U251 boli ošetrené uvedenou dávkou AY9944 počas 2 hodín a infikované ZIKV (MOI ¼ 1) počas 6 hodín, potom boli podrobené Western blotu s uvedenými protilátkami [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti -IRF3, anti-P-IRF3(S396) a anti-GAPDH]. Údaje pochádzajú z najmenej troch nezávislých experimentov a sú uvedené ako reprezentatívne údaje (A–E).

Obr. 6. ZIKV NS4B interaguje s DHCR7 a inhibuje fosforyláciu TBK1 a IRF3. Bunky HEK293T boli kotransfekované plazmidmi kódujúcimi HA-DHCR7 a plazmidmi kódujúcimi neštrukturálne proteíny ZIKV (FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B a FLAG-NS5) alebo prázdnym kontrolným plazmidom pre 3 0 h. Bunkové lyzáty boli imunoprecipitované s anti-Flag protilátkami a potom analyzované imunoblotovaním s uvedenými protilátkami. Bunky B, CH HEK293T boli kotransfekované plazmidmi kódujúcimi HA-DHCR7, plazmidmi kódujúcimi FLAG-NS4B alebo prázdnym kontrolným plazmidom počas 30 hodín. Bunkové lyzáty boli imunoprecipitované s anti-HA protilátkou (B) alebo anti-FLAG protilátkou (C) a potom analyzované imunoblotovaním s uvedenými protilátkami. Bunky D U251 boli transfekované plazmidom FLAG-NS4B spolu s plazmidom kódujúcim HA-DHCR7. Lokalizácia FLAG-NS4B (zelená), HA-DHCR7 (červená), jadrový marker DAPI (modrá) a zlúčenie sa analyzovali konfokálnou mikroskopiou. Mierka ¼ 10 μm. E Bunkové lyzáty z HEK293T buniek transfekovaných HA-DHCR7 boli inkubované s GST proteínom alebo GST-NS4B proteínom, ktorý bol inkubovaný s glutatión-Sepharosovými guľôčkami. Zmesi sa detegovali Western blotom s anti-HA a anti-GST protilátkami (hore). Lyzáty z transfekovaných buniek HEK293T a purifikované proteíny boli detegované Western blotom s anti-HA a anti-GST protilátkami (dole). Bunky F U251 boli transfekované plazmidom kódujúcim FLAG-NS4B (0, 1, 2 ug). Relatívne hladiny proteínov DHCR7, FLAG-NS4B a GAPDH sa detegovali pomocou Western blotu. Bunky G, H HEK293T boli kotransfekované plazmidom alebo prázdnym vektorom exprimujúcim NS4B, spolu s plazmidom kódujúcim TBK1-(F), plazmidom exprimujúcim IRF3-a plazmidmi kódujúcimi RIG-I (G) . Bunky sa zozbierali 24 hodín po transfekcii a podrobili sa Western blotu s uvedenými protilátkami [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 (S396), anti-FLAG a antiGAPDH ]. Bunky I DHCR7-umlčanie U251 (sh-DHCR7) a sh-NTC U251 boli transfekované plazmidom exprimujúcim NS4B alebo prázdnym vektorom. Bunky sa zozbierali 6 hodín po transfekcii a podrobili sa Western blotu s uvedenými protilátkami [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 (S396), anti-FLAG a antiGAPDH ]. Údaje sú reprezentatívne pre tri nezávislé experimenty.

5. Závery

Stručne povedané, predchádzajúca štúdia odhalila, že enzým metabolizmu cholesterolu DHCR7 sa podieľa na vrodenej imunitnej odpovedi proti rôznym vírusovým infekciám. Naša štúdia ukázala, že ZIKV NS4B interagoval s DHCR7 a indukoval expresiu DHCR7. Zvýšená DHCR7 výrazne inhibuje aktiváciu TBK1 a IRF3 a vedie k zníženej produkcii IFN- a ISG, čo tak uľahčuje infekciu ZIKV v gliových bunkách. Tieto zistenia odhalili nový vírusový imunitný únikový mechanizmus, ktorý ZIKV prekonáva imunitnú odpoveď priamym zacielením DHCR7 s NS4B.

Referencie

Akula, MK, Shi, M., Jiang, Z., Foster, CE, Miao, D., Li, AS, Zhang, X., Gavin, RM, Forde, SD, Germain, G., Carpenter, S., Rosadini, CV, Gritsman, K., Chae, JJ, Hampton, R., Silverman, N., Gravallese, EM, Kagan, JC, Fitzgerald, KA, Kastner, DL, Golenbock, DT, Bergo, MO, Wang, D ., 2016. Kontrola vrodenej imunitnej odpovede mevalonátovou dráhou. Nat. Immunol. 17, 922-929.

Berthoud, L., 2020. Obmedzenie flavivírusov. Virol. Sin. 35, 363-377.

Blanc, M., Hsieh, WY, Robertson, KA, Kropp, KA, Forster, T., Shui, G., Lacaze, P., Watterson, S., Griffiths, SJ, Spann, NJ, Meljon, A., Talbot, S., Krishnan, K., Covey, DF, Wenk, MR, Craigon, M., Ruzsics, Z., Haas, J., Angulo, A., Griffiths, WJ, Glass, CK, Wang, Y. , Ghazal, P., 2013. Transkripčný faktor STAT-1 spája syntézu 25-hydroxycholesterolu na makrofágoch s antivírusovou odpoveďou na interferón. Imunita 38, 106–118.

Cao-Lormeau, V.-M., Blake, A., Mons, S., Lastere, S., Roche, C., Vanhomwegen, J., Dub, T., Baudouin, L., Teissier, A., Larre, P., Vial, A.-L., Decam, C., Choumet, V., Halstead, SK, Willison, HJ, Musset, L., Manuguerra, J.-C., Despres, P., Fournier , E., Mallet, H.-P., Musso, D., Fontanet, A., Neil, J., Ghawche, F., 2016. Prepuknutie syndrómu Guillain-Barre spojeného s infekciou vírusom Zika vo Francúzskej Polynézii: prípad -kontrolná štúdia. Lancet 387, 1531–1539.

Chazal, M., Beauclair, G., Gracias, S., Najburg, V., Simon-Loriere, E., Tangy, F., Komarová, AV, Jouvenet, N., 2018. RIG-I rozpoznáva 5' oblasť genómov vírusu dengue a Zika. Cell Rep. 24, 320-328.

Chen, Q., Gouilly, J., Ferrat, YJ, Espino, A., Glaziou, Q., Cartron, G., El Costa, H., AlDaccak, R., Jabrane-Ferrat, N., 2020. Metabolické preprogramovanie vírusom Zika vyvoláva zápal v ľudskej placente. Nat. komun. 11, 2967. Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017. Oxysterolové obmedzenie syntézy cholesterolu zabraňuje aktivácii zápalu AIM2. Bunka 171, 1057–1071 e1011.

Ding, Q., Cao, X., Lu, J., Huang, B., Liu, YJ, Kato, N., Shu, HB, Zhong, J., 2013. Vírus hepatitídy C NS4B blokuje interakciu STING a TBK1, aby sa vyhol vrodenej imunite hostiteľa. J. Hepatol. 59, 52-58.

Fanunza, E., Grandi, N., Quartu, M., Carletti, F., Ermellino, L., Milia, J., Corona, A., Capobianchi, MR, Ippolito, G., Tramontano, E., 2021 INMI1 Zika vírus NS4B antagonizuje signalizáciu interferónu potlačením fosforylácie STAT1. Vírusy 13, 2448.

Fitzgerald, KA, McWhirter, SM, Faia, KL, Rowe, DC, Latz, E., Golenbock, DT, Coyle, AJ, Liao, SM, Maniatis, T., 2003. IKKε a TBK1 sú základné zložky signalizácie IRF3 chodník. Nat. Immunol. 4, 491-496.

Fitzky, BU, Witsch-Baumgartner, M., Erdel, M., Lee, JN, Paik, Y.-K., Glossmann, H., Utermann, G., Moebius, FF, 1998. Mutations in the Δ{{ 3}} gén pre sterolreduktázu u pacientov so Smith-Lemli-Opitzovým syndrómom. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 95, 8181–8186.

Gorman, MJ, Caine, EA, Zaitsev, K., Begley, MC, Weger-Lucarelli, J., Uccellini, MB, Tripathi, S., Morrison, J., Yount, BL, Dinnon 3rd, KH, Ruckert, C ., Young, MC, Zhu, Z., Robertson, SJ, McNally, KL, Ye, J., Cao, B., Mysorekar, IU, Ebel, GD, Baric, RS, Best, SM, Artyomov, MN, Garcia -Sastre, A., Diamond, MS, 2018. Imunokompetentný myšací model infekcie vírusom Zika. Cell Host Microbe 23, 672-685.e6.

Grant, A., Ponia, SS, Tripathi, S., Balasubramaniam, V., Miorin, L., Sourisseau, M., Schwarz, MC, Sanchez-Seco, MP, Evans, MJ, Best, SM, Garcia-Sastre , A., 2016. Vírus Zika sa zameriava na ľudský STAT2, aby inhiboval signalizáciu interferónu typu I. Cell Host Microbe 19, 882-890.

Hertzog, J., Dias Junior, AG, Rigby, RE, Donald, CL, Mayer, A., Sezgin, E., Song, C., Jin, B., Hublitz, P., Eggeling, C., Kohl, A., Rehwinkel, J., 2018. Infekcia brazílskym izolátom vírusu Zika generuje RIG-I stimulačnú RNA a vírusový proteín NS5 blokuje indukciu a signalizáciu IFN typu I. Eur. J. Immunol. 48, 1120-1136.

Horlick, L., 1966. Účinok nového inhibítora biosyntézy cholesterolu (AY 9944) na sérové ​​a tkanivové steroly u potkanov. J. Lipid Res. 7, 116-121.

Ikonen, E., 2008. Obchodovanie s bunkovým cholesterolom a kompartmentalizácia. Nat. Mol. Cell Biol. 9, 125-138.

Kato, H., Takeuchi, O., Sato, S., Yoneyama, M., Yamamoto, M., Matsui, K., Uematsu, S., Jung, A., Kawai, T., Ishii, KJ, Yamaguchi , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. Diferenciálne úlohy MDA5 a RIG-I helikázy pri rozpoznávaní RNA vírusov. Príroda 441, 101–105.

Kuan, V., Martineau, AR, Griffiths, CJ, Hypp€onen, E., Walton, R., 2013. Mutácie DHCR7 spojené s vyšším stavom vitamínu D umožnili skorú migráciu človeka do severných zemepisných šírok. BMC Evol. Biol. 13, 144.

Kumar, A., Hou, S., Airo, AM, Limonta, D., Mancinelli, V., Branton, W., Power, C., Hobman, TC, 2016. Vírus Zika inhibuje produkciu interferónu typu I a downstream signalizácia. EMBO Rep. 17, 1766–1775.

Lazear, HM, Govero, J., Smith, AM, Platt, DJ, Fernandez, E., Miner, JJ, Diamond, MS, 2016. Myší model patogenézy vírusu Zika. Cell Host Microbe 19, 720-730. Lee, LJ, Komarasamy, TV, Adnan, NAA, James, W., Rmt Balasubramaniam, V., 2021. Skrývanie a hľadanie: súhra medzi vírusom Zika a imunitnou odpoveďou hostiteľa. Predné. Immunol. 12, 750365.

Leier, HC, Weinstein, JB, Kyle, JE, Lee, JY, Bramer, LM, Stratton, KG, Kempthorne, D., Navrátil, AR, Tafesse, EG, Hornemann, T., Messer, WB, Dennis, EA, Metz, TO, Barklis, E., Tafesse, FG, 2020. Globálna lipidová mapa definuje sieť nevyhnutnú pre replikáciu vírusu Zika. Nat. komun. 11, 3652.

Li, A., Wang, W., Wang, Y., Chen, K., Xiao, F., Hu, D., Hui, L., Liu, W., Feng, Y., Li, G., Tan, Q., Liu, Y., Wu, K., Wu, J., 2020. Konzervatívne miesto NS5 je potrebné pre vírus Zika na obmedzenie signalizácie RIG-I. Predné. Immunol. 11, 51.

Li, C., Deng, YQ, Wang, S., Ma, F., Aliyari, R., Huang, XY, Zhang, NN, Watanabe, M., Dong, HL, Liu, P., Li, XF, Ye, Q., Tian, ​​M., Hong, S., Fan, J., Zhao, H., Li, L., Vishlaghi, N., Buth, JE, Au, C., Liu, Y., Lu , N., Du, P., Qin, FX, Zhang, B., Gong, D., Dai, X., Sun, R., Novitch, BG, Xu, Z., Qin, CF, Cheng, G. , 2017. 25- Hydroxycholesterol chráni hostiteľa pred infekciou vírusom Zika as ňou spojenou mikrocefáliou na myšom modeli. Imunita 46, 446–456.

Liu, CI, Liu, GY, Song, Y., Yin, F., Hensler, ME, Jeng, WY, Nizet, V., Wang, AH, Oldfield, E., 2008. Inhibítor biosyntézy cholesterolu blokuje virulenciu Staphylococcus aureus . Veda 319, 1391–1394.

Liu, SY, Aliyari, R., Chikere, K., Li, G., Marsden, MD, Smith, JK, Pernet, O., Guo, H., Nusbaum, R., Zack, JA, Freiberg, AN, Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. Interferónom indukovateľná cholesterol-25-hydroxyláza vo veľkej miere inhibuje vstup vírusu produkciou 25- 25-hydroxycholesterolu. Imunita 38, 92–105.

Luo, J., Yang, H., Song, BL, 2020. Mechanizmy a regulácia homeostázy cholesterolu. Nat. Mol. Cell Biol. 21, 225-245.

Luu, W., Hart-Smith, G., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015. Terminálne enzýmy syntézy cholesterolu, DHCR24 a DHCR7, interagujú fyzicky a funkčne. J. Lipid Res. 56, 888-897.

Ma, J., Ketkar, H., Geng, T., Lo, E., Wang, L., Xi, J., Sun, Q., Zhu, Z., Cui, Y., Yang, L., Wang, P., 2018. Neštrukturálny proteín 4A vírusu Zika blokuje signalizáciu RLR-MAVS. Predné. Microbiol. 9, 1350. Moebius, FF, Fitzky, BU, Lee, JN, Paik, YK, Glossmann, H., 1998.

Molekulárne klonovanie a expresia ľudskej delta7-sterolreduktázy. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 95, 1899–1902.

Munoz-Jordan, JL, Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, WI, Garcia-Sastre, A., 2005. Inhibícia signalizácie alfa/beta interferónom proteínom NS4B flavivírusov. J. Virol. 79, 8004-8013.

Munoz-Jordan, JL, Sanchez-Burgos, GG, Laurent-Rolle, M., Garcia-Sastre, A., 2003. Inhibícia interferónovej signalizácie vírusom dengue. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 100, 14333–14338.

Petersen, J., Drake, MJ, Bruce, EA, Riblett, AM, Didigu, CA, Wilen, CB, Malani, N., Samec, F., Lee, FH, Bushman, FD, Cherry, S., Doms, RW, Bates, P., Briley Jr., K., 2014. Hlavná regulačná dráha bunkových sterolov je potrebná pre infekciu vírusom Ánd. PLoS Pathog. 10, e1003911.

Pierson, TC, Diamond, MS, 2020. Pokračujúca hrozba nových flavivírusov. Nat. Microbiol. 5, 796-812. Prabhu, AV, Luu, W., Li, D., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016a. DHCR7: životne dôležitý enzýmový prepínač medzi tvorbou cholesterolu a vitamínu D. Prog. Lipid Res. 64, 138-151.

Prabhu, AV, Luu, W., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016b. Cholesterolom sprostredkovaná degradácia 7-dehydrocholesterol reduktázy mení rovnováhu od cholesterolu k syntéze vitamínu D. J. Biol. Chem. 291, 8363-8373. Randall, G., 2018. Metabolizmus lipidových kvapiek počas infekcie vírusom dengue. Trends Microbiol. 26, 640-642.

Rasmussen, SA, Jamieson, DJ, Honein, MA, Petersen, LR, 2016. Vírus Zika a vrodené chyby – preskúmanie dôkazov o príčinnej súvislosti. N. Engl. J. Med. 374, 1981-1987.

Reboldi, A., Dang, EV, McDonald, JG, Liang, G., Russell, DW, Cyster, JG, 2014. Zápal. 25-Hydroxycholesterol potláča zápal vyvolaný interleukínom-1- v smere interferónu typu I. Science 345, 679–684.

Riedl, W., Acharya, D., Lee, JH, Liu, G., Sherman, T., Chiang, C., Chan, YK, Diamond, MS, Gack, MU, 2019. Vírus Zika NS3 napodobňuje bunkové { {2}}väzbový motív na antagonizáciu vrodenej imunity sprostredkovanej RIG-I a MDA5-. Cell Host Microbe 26, 493-503 e496.

Rodgers, MA, Villareal, VA, Schaefer, EA, Peng, LF, Corey, KE, Chung, RT, Yang, PL, 2012. Profilovanie lipidových metabolitov identifikuje metabolizmus desmosterolu ako nový antivírusový cieľ pre vírus hepatitídy C. J. Am. Chem. Soc. 134, 6896-6899. Savidis, G., Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P., Guo, Z., Green, S., Brass, AL, 2016. IFITM inhibujú replikáciu vírusu Zika. Cell Rep. 15, 2323-2330.

Schneider, WM, Chevillotte, MD, Rice, CM, 2014. Interferónom stimulované gény: komplexná sieť obranných mechanizmov hostiteľa. Annu. Rev. Immunol. 32, 513-545.