Hyperozid zmierňuje zápal v HT22 bunkách prostredníctvom upregulácie SIRT1 k aktivitám Wnt/-Catenin a Sonic Hedgehog Pathways, časť 1

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Neurozápal hrá dôležitú úlohu v patogenéze a progresii zmeneného neurovývoja, senzorineurálnej strate sluchu a niektorých neurodegeneratívnych ochoreniach. Hyperozid (kvercetín-3-O- -D-galaktozid) je aktívna zlúčenina izolovaná z rastlín Hypericum. V tejto štúdii skúmame ochranný účinok peroxidu na neurozápal a jeho možný molekulárny mechanizmus. Lipopolysacharid (LPS) a hyperozid sa použili na liečbu buniek HT22. Životaschopnosť buniek sa merala testom MTT. Rýchlosť apoptózy buniek sa merala prietokovou cytometriou. Úrovne expresie mRNA interleukínu-1 (IL-1), interleukínu-6(IL-6), interleukínu-8(IL-8), a tumor necrosis factor- (TNF-a) boli stanovené kvantitatívnou reverznou transkripciou-polymerázovou reťazovou reakciou. Pomocou súprav sa merali hladiny indexov oxidačného stresu superoxiddismutázy (SOD), reaktívnych foriem kyslíka (ROS), katalázy (CAT), glutatiónu (GSH) a malondialdehydu (MDA). Expresia neurotrofického faktora a vzťah medzi hyperozidom, homológom regulácie informácií 2 tichého párenia (SIRT1) a Wnt/-katenínom a sonickým ježkom sa skúmali westernovým prenosom. V LPS-indukovaných HT22 bunkách hyperozid podporuje prežitie buniek; zmierňuje hladiny IL-1, IL-6, IL-8, TNF-, ROS, MDA, Bax a kaspázy-3; a zvyšuje expresiu CAT, SOD, GSH, Bcl-2, BDNF, TrkB a NGF. Okrem toho hvperozid upreguloval expresiu SIRT1. Ďalšie mechanické skúmanie ukázalo, že hyperozid zmiernil LPS-indukovaný zápal, oxidačný stres a apoptózu zvýšením regulácie SIRTl, aby sa aktivovali Wnt/-katenín a dráhy zvukového ježka. Celkovo naše údaje naznačujú, že hyperozid pôsobí ako ochranca pri neurozápaloch.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

1. Úvod

Neurozápal je chronický zápal mozgového tkaniva, ktorý hrá dôležitú úlohu v patogenéze a progresii zmeneného neurovývoja, senzorineurálnej strate sluchu a niektorých neurodegeneratívnych ochoreniach[1-5]. V skorých štádiách centrálnej sluchovej dráhy súvisí strata sluchu spôsobená hlukom a prevodová strata sluchu s neurozápalmi [6]. Okrem toho, neurozápal prispieva k smrti neurónov a neurologickému zhoršeniu zvýšením produkcie prozápalových faktorov a oxidačného stresu[7]. Početné štúdie ukázali, že neuróny hipokampu sú náchylné na neurozápaly a spôsobujú neurologické komplikácie [8]. Stále však neexistujú žiadne účinné látky alebo metódy na obnovu a prevenciu poškodenia neurónov spôsobeného neurozápalom. Identifikácia účinných protizápalových ochranných kandidátskych činidiel je teda rozhodujúca.

Hyperozid (kvercetín3-O- -D-galaktozid) je aktívna zlúčenina izolovaná z rastlín Hypericum. Má antioxidačné a protizápalové účinky, znižuje preťaženie vápnikom a inhibuje apoptózu [9, 10]. Predchádzajúce štúdie potvrdili, že hyperozid účinne predchádza neurologickým komplikáciám spôsobeným neurozápalmi. V modeli oxidačného stresu vyvolaného hyperglykémiou a akútneho diabetu so zápalom podávanie hyperozidu predchádzalo kognitívnej dysfunkcii, neurozápalu a oxidačnému stresu spôsobenému DM prostredníctvom signálnej dráhy TNF-/NF-Bx/kaspázy-3 [11]. Pri ochoreniach, ako je Parkinsonova choroba, hyperozid pôsobí ako protektívne činidlo tým, že zoslabuje LPS-indukovanú aktiváciu mikroglií [12]. Doteraz existuje len málo štúdií o ochrannom účinku hyperozidu na neurozápal a mechanizmus nie je úplne objasnený.

Lipopolysacharid (LPS) sa široko používa na aktiváciu vrodeného imunitného systému. Predchádzajúce štúdie ukázali, že LPS sa zvyčajne používa na prípravu modelov neurozápalu vyvolaných zápalovými odpoveďami [13,14]. V tejto štúdii sme vystavili bunky HT22 LPS, aby sme napodobnili bunkový model neurozápalu. Súčasne bol na tomto modeli študovaný ochranný účinok hyperozidu na neurozápal a jeho možný molekulárny mechanizmus. Zistili sme, že hyperozid chráni bunky HT22 pred zápalom vyvolaným LPS; oxidačný stres a apoptóza úzko súvisia s hladinami SIRT1. Ďalšia analýza ukázala, že hyperozid zmiernil LPS-indukovaný zápal, oxidačný stres a apoptózu zvýšením regulácie SIRT1 na aktiváciu Wnt/-katenínu a dráh sonických ježkov.

2. Materiály a metódy

2.1. Činidlá a liečivá. LPS, hyperozid a 3-(4,5- bromid dimetyl-2-tiazolyl)-2,5-difenyltetrazólium

(MTT) boli zakúpené od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Dulbeccovo modifikované Eagle médium obsahujúce 10 percent fetálneho bovinného séra (FBS) bolo zakúpené od Gibco (Carls-bad, USA). 100 U/ml penicilínu a 100 mg/ml streptomycínu bolo zakúpených od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). LiCl a sonický hedgehog agonista SAg boli zakúpené od Merck (San Diego, CA, USA). Primárne protilátky proti Bcl-2,Bax, kaspáze-3,BDNF,NGF, SIRT1,Wnt1, -catenin, Shh, Patch a GAPDH a sekundárne protilátky boli zakúpené od spoločnosti Cell Signaling (Boston, MA, USA). 2.2. Bunková kultúra a liečba. Myšia neurónová bunková línia HT22 bola zakúpená od Kunming Cell Bank z Čínskej akadémie vied (Kunming, Čína). Bunky HT22 sa vysiali v množstve 2 x 104 buniek/jamku na 6-jamkovú doštičku a kultivovali sa v DMEM s 10 percentným fetálnym hovädzím sérom, 100 U/ml penicilínu a 100 ug/ml streptomycínu pri 37 °C v 5 percentnom CO, zvlhčenom inkubátor. Keď HT22 dosiahol 70 percent konfluencie po 24 hodinách, uskutočnila sa transfekcia buniek vopred ošetrená rôznymi koncentráciami hyperozidu a LPS（1 ug/ml）.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

2.3. Životaschopnosť buniek. Životaschopnosť buniek bola stanovená testom MTT.

V stručnosti, bunky HT22 sa naočkovali do 24-jamkových doštičiek v hustote 2 x 104 buniek/ml počas 24 hodín. Bunky sa nechali cez noc hladovať a potom sa vopred ošetrili rôznymi koncentráciami hyperozidu počas 24 hodín, po čom nasledovala inkubácia s LPS (1 ug/ml) počas ďalších 24 hodín. Médium sa obnovilo a inkubovalo s 50 ul MTT (5 mg/ml pripraveného vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom) počas 4 hodín pri 37 °C. Potom sa roztok odstránil a na platne sa pridal DMSO. Absorbancia pri 570 nm sa merala pomocou čítačky doštičiek.

2.4. Western blotovanie.

RIPA pufor sa pridal k bunkám HT22 (Invitrogen; USA), aby sa zhromaždil celkový proteín; potom sa stanovili koncentrácie proteínov pomocou metódy BCA (Invitrogen, USA).

Proteínové vzorky boli zmiešané s 5x nanášacím pufrom a denaturované pri vare. Proteíny sa oddelili pomocou 15 % SDS-PAGE a preniesli sa na polyvinylidénfluoridové membrány. Ďalej boli membrány inkubované s primárnymi protilátkami (Bcl-2, Bax, kaspáza-3, BDNF, NGF, SIRT1, Wntl, -catenin, Shh, Patch a GAPDH) pri 4 noci. Potom sa nasledujúci deň membrány premyli PBS a inkubovali sa so sekundárnymi protilátkami počas 1 hodiny. Nakoniec sa proteínové pásy merali pomocou softvéru ImageJ. Údaje boli zhromaždené z najmenej troch nezávislých experimentov.

2.5.qRT-PCR. Celková RNA buniek HT22 sa izolovala pomocou súpravy na extrakciu RNA TRIzol (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) a izolovaná celková RNA sa reverzne prepísala na cDNA pomocou súpravy na reverznú transkripciu (Takara, Kyoto, Japonsko). SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Kyoto, Japonsko) sa použil na uskutočnenie qRT-PCR amplifikácie. Amplifikačné priméry IL-1, I-6 a TNF- boli nasledovné: IL-1 ,5'-GATGGTCGCATTAGCTCC-3'a 5'-GGCTGTAGCTGTAGCGTC{{15} }';IL-6,5'-ATTG CGGCGGCTGACGCGTAG-3'a 5'-GTCTGTTGCGC GAGCTGGTA-3';IL-8,5'-GTCGAGCTGCCGCGTAGCG T{{26} }'a 5'-CGCGATGCGTGCAGC-3'; a TNF-a,5'-CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3'a5'-CGGACTCCG CAAAGTCTAAG-3'. Relatívna expresia mRNA sa analyzovala pomocou metódy 2-Act.

2.6. SOD, GSH a MDA test. Pomocou zodpovedajúcich testovacích súprav (Nanjing Jian-cheng Bio Company, Čína) sme merali aktivitu hladín foriem kyslíka (ROS), katalázy (CAT), superoxiddismutázy (SOD), glutatiónu (GSH) a malondialdehydu (MDA).

2.7. Prietoková cytometria.

Na meranie rýchlosti bunkovej apoptózy sa použil test prietokovej cytometrie podľa predchádzajúcej správy [15]. Bunky HT22 v každej skupine boli zozbierané a resuspendované. Apoptotické bunky boli dvojito označené anexínom V-FITC a PI s použitím anexínovej V-FITC/PI súpravy na detekciu apoptózy (Beyotime Biotechnology, Čína) počas 30 minút pri izbovej teplote v tme. Potom sa intenzita fluorescencie buniek kvantifikovala prietokovou cytometriou.

2.8. Štatistická analýza.

V tejto štúdii sa rozdiel medzi dvoma skupinami porovnával pomocou t-testu a rozdiel medzi skupinami sa analyzoval jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA). Všetky údaje boli prezentované ako priemerné hodnoty ±

Obrázok 1: Hyperozid zmiernil apoptózu a zápal v LPS-indukovaných HT22 bunkách. Životaschopnosť buniek HT22 sa merala testom MTT. Životaschopnosť buniek sa pozorovala mikroskopom (100x) (a, b). Expresia Bcl-2, Bax a kaspázy-3 v HT22 bunkách sa merala pomocou Western blotting (c). Rýchlosť apoptózy buniek HT22 sa merala pomocou prietokového cytometrického testu (d). Úrovne IL-1, IL-6. IL-8 a TNF-mRNA v HT22 bunkách sa merali pomocou art-PCR(e);* sa považovali za významné v porovnaní s kontrolou (*P<0.05);# was="" considered="" significant="" compared="" to="" lps="" ("p=""><>

Tento článok je prevzatý z Hindawi Neural Plasticity Volume 2021, ID článku 8706400, 10 strán https://doi.org/10.1155/2021/8706400