Identifikácia a funkčná analýza bifavónu ako nového inhibítora prechodných receptorových potenciálnych vaniloidných 4-dependentných aterogénnych procesov

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comvedieť viac

Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei & Shaik O. Rahaman

Ateroskleróza, progresívne zápalové ochorenie veľkých artérií, je hlavným prispievateľom k celosvetovo rastúcemu zaťaženiu úmrtnosťou a chorobnosťou súvisiacou s kardiovaskulárnymi ochoreniami1. Hlavná iniciačná udalosť, ktorá vedie k ateroskleróze, zahŕňa retenciu modifikovaných častíc lipoproteínu s nízkou hustotou (oxLDL) v subendoteliálnych aortálnych intimálnych priestoroch primárne v bodoch arteriálnej vetvy2. Počas skorej aterogenézy, po endoteliálnej dysfunkcii, cirkulujúce krvné monocyty transmigrujú do oblastí intimy a diferencujú sa na tkanivové makrofágy3. V intimálnych priestoroch aorty vytvára väzba a vychytávanie oxLDL makrofágmi pomocou vychytávacích receptorov, ako sú SRA a CD36, doprednú atero-zápalovú slučku, ktorá vedie k vývoju penových buniek naplnených lipidmi, čo je kritický proces pri ateroskleróze2–8. Kaskády zápalových javov vyvolané penovými bunkami vedú k vytvoreniu skorého tukového pruhu a prípadne k objaveniu sa pokročilých lézií aterosklerózy charakterizovaných prítomnosťou fibrózneho uzáveru, kalcifikovaného tkaniva, imunitných buniek, matricových proteínov a lipidov2–10. Prechodný receptorový potenciál Vaniloid 4 (TRPV4) podrodiny TRPV, neselektívny, polymodálny katiónový kanál priepustný pre Ca2 plus je všadeprítomne exprimovaný v rôznych typoch buniek vrátane makrofágov11–24. Predtým známy ako osmosensor, je teraz známe, že TRPV4 reaguje na rôzne biochemické a biomechanické stimuly vrátane tepla, tuhosti matrice, osmolarity, rastových faktorov, pH a 4 forbolesterov11–24. Uvádza sa, že TRPV4 sprostredkováva niekoľko fyziologických funkcií, ako je pocit bolesti pri zápale a neuropatiách18, 22, 23, diferenciácia a migrácia myofibroblastov 17, 25, 26 a diferenciácia osteoklastov v kosti27. Mutácie TRPV4 boli spojené s niekoľkými kanálopatiami28–31. Nedávne štúdie našej skupiny a iných naznačujú možnú úlohu tohto kanála v nespočetných patologických stavoch, ako sú poranenia pľúc22,32, tvorba penových buniek14,16, tkanivová fbróza17,33, reakcia na cudzie teleso13 a rakovina34,35. Predtým bola preukázaná ateroprotektívna úloha TRPV4, v ktorej sa ukázalo, že funkcia TRPV4 indukovaná chemickým agonistom v endotelových bunkách je spojená s aktiváciou eNOS a inhibíciou adhézie monocytov na endotelové bunky36. Na rozdiel od toho, nedostatky vo funkciách TRPV4 boli spojené s početnými ateroinfammárnymi odpoveďami vrátane endoteliálnej dysfunkcie, zníženej tvorby penových buniek makrofágov a vaskulárnych ochorení14, 16, 37–39. Naše laboratórium nedávno identifikovalo proaterogénnu úlohu TRPV4, pričom reguluje tvorbu penových buniek makrofágov indukovanú oxLDL. Mechanicky sme ukázali, že TRPV4 ovplyvňuje vychytávanie, ale nie väzbu oxLDL v makrofágoch spôsobom nezávislým od CD36-14. V inej štúdii sme zaznamenali exacerbáciu tvorby penových buniek indukovanú oxLDL v prítomnosti lipopolysacharidu a zvyšujúcu sa tuhosť matrice závislú od TRPV, čím sme poskytli spojenie medzi mechanosenzovaním a rizikom aterosklerózy16. Všetky tieto zistenia naznačujú, že TRPV4 je atraktívnym cieľom pri ateroskleróze a iných ochoreniach, čím sa podnecuje objav malých molekúl inhibítorov TRPV4, ktoré možno preložiť do klinicky účinných terapeutík. Využitie prírodných zlúčenín v terapeutikách sa dostalo do popredia, predovšetkým kvôli potrebe nákladovo efektívnych a biokompatibilných zlúčenín v porovnaní so súčasnými syntetickými liečivami. Prírodné zlúčeniny ako naprflavonoidy, alkaloidy,polyfenolya kurkuminoidy ovplyvňujú kardiovaskulárne ochorenia prostredníctvom rôznych mechanizmov, ako je inhibíciaprozápalovésignály, senzibilizáciu na inzulín a zlepšenie profilov krvných lipidov zacielením na dráhy AMPK, COX1/2, eNOS a Nrf240–45. Nedávne štúdie viacerých skupín identifikovali dva flavonoidy, berberín a apigenín, ako potenciálne modulátory aktivity TRPV446,47. Vyvinuli sme a použili sme polovysoko výkonnú skríningovú metódu na identifikáciu potenciálnych antagonistov TRPV4 z knižnice prírodných zlúčenín pomocou Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR) na báze Ca2 plus influx testu. V tomto dokumente uvádzame identifikáciu a funkčnú analýzu Linkedinu, flavónu, ako nového inhibítora TRPV4-závislých aterogénnych procesov v makrofágoch, čím položíme základ pre ďalšie štúdie tejto prírodnej zlúčeniny ako prírodnej antiaterosklerotickej malej látky. molekulová zlúčenina. Uvádza sa, že Linkedin vykazuje neuroprotektívne,antikarcinogénne, aprotizápalovérole48,49. Uvádzame mechanizmus účinku Linkedinu proti TRPV4 pri tvorbe makrofágových penových buniek pomocou mnohých biochemických a bunkových testov.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Materiály a metódy Živočíšna a bunková kultúra

Kúpili sme kongénne myši C57BL/6 divokého typu (WT) od Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, USA). Pri všetkých pokusoch na zvieratách boli dodržané pokyny Výboru pre starostlivosť o zvieratá a používanie zvierat Marylandskej univerzity a autori dodržiavali pokyny ARRIVE. Na izoláciu tioglykolátom indukovaných myších rezidentných makrofágov (MRM) sa po 4 dňoch intraperitoneálnej injekcie tioglykolátu odobral peritoneálny výplach a bunky sa udržiavali v 10 percentnom fetálnom bovinnom sére (FBS) obsahujúcom DMEM7,14,16. Myšia makrofágová bunková línia (RAW264.7) a ľudské dermálne fibroblasty (HDF) boli zakúpené od ATCC (Manassas, VA) a boli kultivované s DMEM alebo MEM (Gibco, Waltham, MA). Makrofágy odvodené od myšej kostnej drene (BMDM) boli odobraté od 6- do 7-týždňových myší, ako už bolo opísané14,50,51. Stručne povedané, stehenné kosti od myší WT a TRPV4 KO sa odobrali a kostná dreň stehenných kostí sa vypláchla kompletným médiom DMEM s 10 percentami FBS. Suspendované bunky kostnej drene boli filtrované cez 70 um sitko (BD bioscience), centrifugované a udržiavané v médiu DMEM doplnenom M-CSF (25 ng/ml) počas 7 až 8 dní pri 37 stupňoch, aby sa umožnila diferenciácia na makrofágy.

Činidlá

Linkedin a GSK1016790A (GSK101) boli zakúpené od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) a testovacia súprava FLIPR Calcium 6 bola získaná od Molecular Device (Sunnyvale, CA). Ľudský prirodzený LDL (VLDL) bol zakúpený od Stemcell Technologies (Vancouver, Kanada). LDL sme inkubovali s 5 uM CuSO4 počas 12 hodín pri 37 stupňoch, aby sme pripravili LDL oxidovaný meďou (oxLDL)7,14,16. Fluorescenčným farbivom značený, DiI-oxLDL, bol zakúpený od Invitrogen (Carlsbad, CA) a MCSF od R&D (Minneapolis, MN). Protilátky na analýzu FACS boli: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 a TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). PE-konjugované sekundárne protilátky boli od R&D (Minneapolis, MN) a PE-konjugované izotypové kontroly boli od BD (Franklin Lake, NJ). Pre kvantitatívnu polymerázovú reťazovú reakciu (qRT-PCR) sme použili súpravu RNeasy od QIAGEN (Redwood City, CA). Všetky priméry boli zakúpené od Bio-Rad (Hercules, CA). Bunkové kultivačné médiá, produkty súvisiace s bunkovou kultúrou a reagencie Western blot boli získané od Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).

Cistanche proti únave

Semi-vysokovýkonný skríning

Uskutočnili sme polovysokovýkonný skríning antagonistov Trpv4 z knižnice 2 000 prírodných zlúčenín (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) pomocou testu prítoku vápnika na báze fluorometrickej zobrazovacej čítačky platní (FLIPR)14,17. Identifikovali sme ginkgetín (GGT) ako nového antagonistu TRPV4. Primárny a sekundárny skríning sa uskutočnil s RAW264.7, HDF a BMDM na posúdenie schopnosti Linkedinu a iných kandidátov inhibovať TRPV{10}}vyvolaný Ca2 plus infux14,17. Ako kontroly sme použili A23187, ionofór vápnika, BMDM s nulovým TRPV4 a GSK219, selektívneho antagonistu TRPV417. Po sekundárnom skríningu sme identifikovali šesť zlúčenín vykazujúcich viac ako trojnásobnú inhibíciu TRPV4-sprostredkovaného prílevu Ca2 plus v porovnaní s kontrolou vehikula. Linkedin bol identifikovaný ako najsilnejší inhibítor aktivity TRPV4. BMDM (5 x 104 buniek/jamka) sa naočkovali do kolagénom potiahnutých (10 ug/ml) 96-jamkových čiernych platní s čírym dnom a inkubovali sa pri 37 stupňoch, 5 percent C02. V deň experimentu boli bunky naplnené farbivom vápnika 6 v HBSS, 20 mM HEPES, 2,5 mM probenecid a inkubované počas 45 minút pri 37 stupňoch. Po inkubácii sa do každej jamky pridali zlúčeniny z knižnice do konečnej koncentrácie 2 uM. Doštičky sa inkubovali ďalších 45 minút pri 37 stupňoch. Príliv Ca2 plus bol indukovaný pridaním 10 nM TRPV4 agonistu GSK1016790A do buniek vopred ošetrených vehikulom alebo zlúčeninou a zaznamenaný meraním AF/F (Max-Min), ako už bolo opísané17. Údaje sú uvedené ako relatívne fluorescenčné jednotky (RFU).

Imunobloty

Tioglykolátom vyvolané peritoneálne makrofágy sa naočkovali do 10 percentného FBS obsahujúceho DMEM a inkubovali sa cez noc. Neadherované bunky sa premyli a na platňu sa pridalo 1 percento hovädzieho sérového albumínu (BSA) obsahujúceho DMEM a inkubovalo sa 3 hodiny pred ošetrením Linkedinom. Na stanovenie expresie CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 a GAPDH proteíny sa pripravili lyzáty celých buniek z buniek ošetrených cez noc Linkedínom (1 a 5 uM) alebo vehikulom v prítomnosti alebo neprítomnosti oxLDL (25 ug/ml ). Na stanovenie hladín expresie LPS-spustených p-JNK a JNK boli bunky vopred ošetrené Linkedínom (5 a 10 uM) počas 3 hodín a potom stimulované E. coli LPS počas 30 minút. Celobunkové lyzáty boli pripravené z dvakrát premytých buniek (ľadovo studený PBS) s použitím RIPA pufra s pridaným kokteilom inhibítora proteázy (Thermo Scientific, MA). Bloty boli testované s králičím anti-TRPV4 (Alomone Lab, Jerusalem, Izrael), anti-myšacím CD36 (R&D, Minneapolis, MN), králičím anti-TLR4, králičím anti-TLR6, králičím anti-JNK a králičím anti-p- Primárne protilátky JNK (Cell Signaling, Danvers, MA) nasledované sekundárnymi protilátkami konjugovanými s králičím a anti-myším HRP (R&D, Minneapolis, MN). Bloty boli stripované a znovu sondované s anti-GAPDH IgG (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) na kontrolu plnenia.

Tvorba penových buniek.Tioglykolátom spustené MRM sa naočkovali na sklenené krycie sklíčka v 12-jamkovej platni s DMEM, 10 percent FBS a inkubovali sa pri 37 stupňoch, 5 percent C02 počas 2 hodín. K bunkám sa pridal GGT (1 alebo 10 uM) a po 3 hodinách inkubácie sa pridal oxLDL (50 ug/ml) a kultúry sa inkubovali cez noc pri 37 °C. Natívny LDL (50 ug/ml) sa pridal do jamiek kontrolnej skupiny a inkuboval sa cez noc. Bunky boli fixované v 4 percentách paraformaldehydu, po čom nasledovalo farbenie Oil Red O, aby sa kvantifikovala tvorba penových buniek.

Adenovírusová vektorová transdukcia.Zozbierali sme adenovírusové konštrukty na expresiu Ad(RGD)-myší TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml) a adenovírusový prázdny vektor, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), z Vector Biolabs, Malvern, PA. Pre všetky experimenty sme použili 1× 108 pfu/ml. Pre štúdie generovania penových buniek sa myšie peritoneálne makrofágy inkubovali s Ade-TRPV4 alebo Ade-Vec v médiu DMEM počas 72 hodín pred pridaním oxLDL na vytvorenie makrofágových penových buniek.

Väzba a príjem ox-LDL.Na posúdenie väzby boli peritoneálne makrofágy ošetrené dvoma dávkami (1 alebo 10 uM) Linkedinu alebo vehikula počas 3 hodín a inkubované s DiI-oxLDL pri 4 stupňoch počas jednej hodiny. Po predbežnom ošetrení Linkedinom alebo vehikulom sa bunky inkubovali s DiI-oxLDL pri 37 stupňoch počas 30 minút, aby sa vyhodnotil príjem. Obrázky boli zachytené fluorescenčnou mikroskopiou (63x) a na kvantifikáciu výsledkov sa použil obrázok J.

Analýza prietokovou cytometriou.Tioglykolátom vyvolané peritoneálne makrofágy sa kultivovali v DMEM, 10 percent FBS počas 24 hodín. Neadherované bunky sa odmyli, pridalo sa médium bez séra a bunky sa inkubovali 2 hodiny, po čom nasledovalo pridanie 5 uM GGT alebo vehikula a inkubácia pokračovala 3 hodiny. Ošetrené bunky boli zoškrabané z platne a resuspendované v PBS, 2 percentá BSA. Bunky sa inkubovali s primárnymi protilátkami počas 45 minút, po ktorých nasledovala 30 minútová inkubácia so sekundárnou protilátkou konjugovanou s PE. Na získanie údajov sa použil prietokový cytometer FACSCantoII (BD Bioscience, Ontario, Kanada). Všetky údaje boli spracované pomocou softvéru FlowJo.

qRT-PCR.Makrofágy indukované tioglykolátom boli ošetrené 5 uM Linkedinom alebo vehikulom počas 3 hodín; K bunkám ošetreným vehikulom alebo Linkedinom sa pridalo 25 ug/ml oxLDL a inkubácia pokračovala cez noc. Na extrakciu celkovej RNA sa použila súprava RNeasy Micro Kit (č. 74 004) od spoločnosti QIAGEN a na reverznú transkripciu RNA sa použila súprava Universal SYBR Green One-Step Kit od Bio-Rad. Na získanie údajov bol použitý C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad). Expresia génu bola stanovená ako množstvo génovo špecifickej mRNA v porovnaní s mRNA GAPDH pomocou porovnávacej CT metódy opísanej v užívateľskom bulletine systému Bio-Rad qRT-PCR.

Štatistická analýza.Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM biologických triplikátov. Použil sa softvér GraphPad Prism 7.{1}} a výpočty sa vykonali pomocou Studentovho t-testu pre dve skupiny alebo jednosmernej ANOVA pre viaceré skupiny.

Etické schválenie.Všetky experimenty na myšiach sa uskutočňovali v súlade s usmerneniami Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť o zvieratá a použitie (IACUC) a boli schválené Revíznym výborom University of Maryland-College Park.

Výsledky in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>trojnásobný; p<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Obrázok 1. Identifikácia Linkedinu ako nového inhibítora TRPV4 z knižnice prírodných zlúčenín založená na čiastočne vysokovýkonnom skríningu. (A) Vývojový diagram znázorňujúci pracovný postup vedúci k identifikácii ginkgetínu ako potenciálneho inhibítora TRPV4 z knižnice 2000 prírodných zlúčenín. (B) Reprezentatívny záznam FlexStation 3 ukazujúci inhibičný účinok 6 prírodných zlúčenín na agonistom TRPV4 (GSK1016790A) indukovaný prítok Ca2 plus v BMDM naplnených farbivom vápnikom 6 počas sekundárneho skríningu. Predbežné ošetrenie všetkými 6 zlúčeninami vykazovalo inhibičné účinky na TRPV4-závislý prítok Ca2 plus v porovnaní s bunkami vopred ošetrenými vehikulom (negatívna kontrola; vehikulum plus GSK1016790A (10 nM)) alebo ionofórom vápnika (A23187, 2 μM). Použili sme selektívneho antagonistu TRPV4, GSK2193874 (10 nM), ako negatívnu kontrolu. Všetky experimenty sa opakovali trikrát štvormo. RFU: relatívna fluorescenčná jednotka.

Inhibícia TRPV4 pomocou GGT ruší tvorbu penových buniek makrofágov indukovanú oxLDL.Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že TRPV4-vyvolaný prítok Ca2 plus sa podieľa na tvorbe penových buniek sprostredkovaných oxLDL 14,16. Preto sme vyhodnotili možnosť, že tvorba penových buniek bola inhibovaná antagonizáciou aktivity TRPV4 sprostredkovanou GGT. Divoké myšie peritoneálne makrofágy boli inkubované s oxLDL na vyvolanie tvorby penových buniek v prítomnosti alebo neprítomnosti GGT a analyzované farbením Oil Red O. Ako sa očakávalo, zistili sme, že tvorba penových buniek sa u makrofágov ošetrených oxLDL zvýšila päťnásobne v porovnaní s natívnym LDL (obr. 2A, B). Avšak ošetrenie makrofágov GGT (1 alebo 10 uM) pred stimuláciou oxLDL významne znížilo percento penových buniek (obr. 2A, B). Súhrnne tieto zistenia naznačujú inhibičný účinok GGT na tvorbu penových buniek makrofágov, ktoré môžu byť zamerané na TRPV{12}}vyvolaný prítok Ca2 plus. Okrem toho sme nadmerne exprimovali TRPV4 v makrofágoch bez TRPV4 pomocou konštruktu adenovírusu a potom sme indukovali tvorbu penových buniek pomocou oxLDL v prítomnosti GGT. Zistili sme, že nadmerná expresia TRPV4 zvýšila tvorbu penových buniek, ktorá bola blokovaná, keď sme bunku vopred ošetrili GGT, čo naznačuje, že inhibícia tvorby proaterogénnych penových buniek pomocou GGT je závislá od TRPV4 (obr. 2C, D).

GGT neblokuje bazálnu úroveň expresie TRPV4 a zápalových receptorov.Scavenger receptor CD36 hrá hlavnú úlohu pri vychytávaní a väzbe oxLDL a tvorbe penových buniek, čo sú kritické procesy pri ateroskleróze4–7,54,55. V poslednej dobe narastajúce množstvo dôkazov naznačuje zapojenie receptorov podobných mýtu do aterosklerózy2,4,56. Aby sme zistili, či GGT blokuje tvorbu penových buniek ovplyvnením expresie CD36, TLR4, TLR6 a TRPV4, vykonali sme imunoblotovú analýzu pri dvoch koncentráciách GGT (1 alebo 5 uM). Zistili sme podobné úrovne expresie CD36, TRPV4, TLR6 a TLR4 v porovnaní s neošetrenou kontrolou (obr. 3A–D). Analýza prietokovou cytometriou tiež neodhalila žiadny významný rozdiel v expresii proteínov na bunkovom povrchu s liečbou GGT alebo bez nej (obr. 3E–H, I–L). Vzhľadom na všetky tieto výsledky naznačujú, že GGT blokuje tvorbu penových buniek makrofágov bez inhibície bazálnych hladín povrchovej expresie TRPV4, CD36, TLR4 a TLR6.

Obrázok 2. Inhibícia TRPV4 pomocou Linkedinu ruší tvorbu penových buniek makrofágov indukovanú oxLDL. (A) Tioglykolátom indukované myšie peritoneálne makrofágy boli ošetrené cez noc s 50 ug/ml oxLDL, po čom nasledovala 3-hodinová predinkubácia s vehikulom alebo 1 alebo 10 uM Linkedinom. Bunky boli ošetrené 50 ug/ml natívneho LDL (VLDL) ako kontrola. Pôvodné zväčšenie: 40x. (B) Kvantifikácia výsledkov je uvedená v (A). n =500 buniek/podmienku. Študentov t-test; ***p<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

Príjem oxLDL, ale neviazanie makrofágmi je potlačené GGT. Pretože sa predtým ukázalo, že TRPV4 má úlohu pri vychytávaní oxLDL a tvorbe penových buniek14, 16, hodnotili sme, či liečba GGT spôsobila zhoršenie väzby oxLDL na povrch makrofágov. Peritoneálne makrofágy WT boli ošetrené GGT pred inkubáciou s DiI-oxLDL pri 4 stupňoch a bola hodnotená väzba. Výsledky ukazujú, že väzba oxLDL na povrchu makrofágov nebola významne obmedzená liečbou GGT (1 alebo 10 µM) v porovnaní s kontrolou vehikulom (obr. 5A-C). Po zistení, že GGT neinhibuje väzbu oxLDL, sme sa ďalej zamerali na určenie, či bolo vychytávanie oxLDL v makrofágoch narušené liečbou GGT. Je zaujímavé, že naše výsledky ukázali, že došlo k významnej inhibícii príjmu oxLDL v makrofágoch v bunkách vopred ošetrených GGT v porovnaní so skupinou ošetrenou vehikulom (obr. 6A, B). Ak vezmeme do úvahy všetky dohromady, tieto výsledky naznačujú, že GGT blokuje vychytávanie oxLDL, ale neviaže sa v makrofágoch.

GGT blokuje oxLDL-indukovanú expresiu TRPV4 v makrofágoch.

Keďže naše predtým publikované štúdie ukázali, že TRPV{0}}vyvoláva Ca2 plus hrá úlohu pri tvorbe penových buniek makrofágov sprostredkovaných oxLDL14,16, snažili sme sa zistiť, či GGT blokuje tvorbu penových buniek prostredníctvom potlačenia expresie CD36 indukovanej oxLDL, TLR2, TLR4, TLR6 alebo TRPV4. Zistili sme, že nočná stimulácia makrofágov pomocou oxLDL viedla k významnej upregulácii expresie TRPV4 proteínov v porovnaní s LDL, zatiaľ čo expresia iných receptorov (CD36, TLR2, TLR4 a TLR6) zostala nezmenená (obr. 4A–F). Predošetrenie buniek GGT pred stimuláciou oxLDL selektívne znížilo hladinu expresie TRPV4 proteínov v porovnaní s liečbou vehikulom (obr. 4A–F). Súhrnne tieto zistenia naznačujú inhibičný účinok GGT na expresiu proteínu TRPV4, ktorý sa môže čiastočne podieľať na potlačení tvorby penových buniek pomocou GGT.

Obrázok 3. Ošetrenie linkedínom nemení celkovú proteínovú alebo povrchovú expresiu TRPV4, CD36 a TLR v makrofágoch. (A–D) Imunobloty lyzátov celých buniek makrofágov po ošetrení cez noc 1 alebo 5 uM Linkedinom alebo vehikulom. Reprezentatívne imunobloty ukazujú celkovú proteínovú expresiu CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) a TLR4 (D) v bunkách ošetrených Linkedínom a neošetrených bunkách. Uskutočnili sa tri nezávislé biologické replikácie a 3 experimentálne opakovania pre každú sadu experimentov. (E–H) Prietoková cytometrická analýza makrofágov ošetrených cez noc 5 uM Linkedinom alebo neošetrených, ktorá ukazuje povrchovú expresiu TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) a TLR6 (G) v neošetrených a Linkedinom ošetrených bunkách. Analyzovali sa tri nezávislé biologické replikáty a 30{18}} buniek na stav. (I–L) Kvantitatívna analýza výsledkov z (E–H). Analyzované obojstranným t-testom s 99-percentným intervalom spoľahlivosti. Bunky spočítané na experiment, 30,000; dve experimentálne opakovania.

GGT blokuje proaterogénnu aktiváciu JNK2 a zápal v makrofágoch. Publikované správy z nášho laboratória a iných ukázali, že aktivácia JNK2 hrá rozhodujúcu úlohu pri tvorbe penových buniek a ateroskleróze7,57. Aby sa určilo, či GGT môže inhibovať aktiváciu JNK1/2, makrofágy sa ošetrili GGT, po čom nasledovala stimulácia LPS alebo oxLDL. Výsledky z imunoblotovej analýzy ukázali, že liečba GGT významne potlačila fosforyláciu JNK1/2 indukovanú oxLDL alebo LPS v porovnaní s neošetrenou alebo natívnou kontrolou ošetrenou LDL (obr. 7A–D). Ukázalo sa, že aktivácia JNK v makrofágoch indukuje transkripciu prozápalových mediátorov spojených s aterosklerózou58–60. Aby sa určilo, či by GGT mohla potenciálne blokovať expresiu týchto prozápalových regulátorov v makrofágoch, bunky vopred ošetrené GGT sa stimulovali pomocou oxLDL a hladiny expresie mRNA TNF, IL6, IL12, IL1 a MCP1 sa kvantifikovali analýzou qRT-PCR. Zistili sme významnú downreguláciu v hladinách expresie TNF, IL12, IL1 a MCP1 mRNA v bunkách ošetrených GGT indukovanou oxLDL v porovnaní s kontrolami ošetrenými vehikulom (obr. 7E–I). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že GGT blokuje proaterogénnu aktiváciu JNK2 a expresiu zápalového génu v reakcii na stimuláciu oxLDL v makrofágoch. Diskusia O prírodných zlúčeninách, ako sú flavonoidy a polyfenoly, je známe, že modulujú kardiovaskulárne reakcie prostredníctvom rôznych mechanizmov, ako je inhibícia prozápalových signálov, senzibilizácia na inzulín, oxidačný stav a zlepšenie profilov krvných lipidov40–45. V tomto dokumente uvádzame identifikáciu a funkčnú charakterizáciu Linkedinu, flavónu, založenú na čiastočne vysokovýkonnom skríningu, ako nového inhibítora proterogénnych / zápalových procesov závislých od TRPV v makrofágoch. Konkrétne sme ukázali, že i) ginkgetín blokuje TRPV4-sprostredkovaný prítok Ca2 plus do makrofágov, ii) ginkgetínová blokáda funkcie TRPV4 výrazne znížila tvorbu penových buniek indukovanú oxLDL potlačením vychytávania oxLDL v makrofágoch a iii) ginkgetín blokuje LPS- a oxLDL-indukovaná fosforylácia JNK1/2, expresia TRPV4 proteínov a expresia zápalových génov. Celkovo výsledky našej štúdie ukázali, že ginkgetín inhibuje proaterogénnu/zápalovú funkciu makrofágov v závislosti od TRPV4-. Ateroskleróza, ochorenie aorty, je spočiatku podporované zápalom a prekrvením makrofágov oxLDL, čo indukuje tvorbu makrofágových penových buniek, ktoré následne progredujú do aterómu2–10. Pretože tvorba penových buniek je kritickým procesom v aterogenéze, pochopenie a manipulácia s tvorbou penových buniek môže mať terapeutický potenciál. Je známe, že makrofágy exprimujú rad iónových kanálov a púmp prenikajúcich cez membránu, vrátane TRPV4, mechanosenzitívneho polymodálneho Ca2 plus priepustného iónového kanála, ktorý je aktivovaný fyzikálnymi aj biochemickými stimulmi11–24. Publikované štúdie nášho laboratória a iných identifikovali úlohu TRPV4 pri zápale makrofágov a tvorbe penových buniek indukovanej oxLDL14–16, 26. TRPV4 tak môže slúžiť ako životaschopný cieľ pre útlm proaterogénnych procesov.

Obrázok 5. Linkedin nepotláča väzbu DiI-oxLDL na makrofágy. Makrofágy boli vopred ošetrené vehikulom alebo Linkedinom (1 alebo 10 uM) počas 3 hodín, po čom nasledovala inkubácia s DiI-značeným oxLDL (2,5 ug/ml) počas 1 hodiny pri 4 stupňoch. (A) Reprezentatívne fluorescenčné mikroskopické snímky (pôvodné zväčšenie, 63x) väzby DiI-oxLDL na povrch makrofágovej membrány (n =20 buniek/stav). (B) Výsledky z experimentu A zobrazené ako profil grafu s použitím softvéru NIH ImageJ. (C) Kvantitatívna analýza výsledkov z A. n=20 buniek/stav. pri zlepšovaní aterosklerózy znížením MMP-2 a MMP-9 a zvýšením hladín NO a NOS v hrudných aortách potkana52. V tejto štúdii sme ukázali, že ginkgetín blokuje TRPV4-vyvolaný prílev Ca2 plus do makrofágov. Mechanicky sme ukázali, že ginkgetín blokuje vychytávanie oxLDL, ale neviaže sa v makrofágoch. Štúdie vykonané in vivo a in vitro naznačujú kritickú úlohu CD36 ako hlavného vychytávacieho receptora pri vychytávaní oxLDL a tvorbe penových buniek makrofágov2–7. Ukázalo sa, že myši s nulovým CD36, ktorým chýba ApoE alebo LDLR, sú menej náchylné na rozvoj aterosklerotických lézií5,6. Predchádzajúce štúdie našej skupiny identifikovali zásadnú úlohu signálnej kaskády CD36-JNK pri tvorbe penových buniek makrofágov7. Toll-like receptory TLR2, TLR4 a TLR6 pôsobia ako koreceptory interakciou s CD36 a ukázalo sa, že sa podieľajú na aterogenéze2,56,63. Skúmali sme možnosť, že nedostatok tvorby penových buniek pozorovaný v makrofágoch ošetrených Linkedínom bol spôsobený zníženou expresiou proteínov CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 alebo TLR6. Je zaujímavé, že liečba Linkedinom významne neznížila expresiu proteínov CD36, TLR2, TLR4 alebo TLR6 na bazálnych hladinách alebo za podmienok stimulovaných oxLDL. Linkedin však špecificky blokoval oxLDL-indukovanú upreguláciu expresie TRPV4 proteínov, zatiaľ čo jeho expresia na bazálnych hladinách zostala nezmenená. Vzhľadom na všetky tieto výsledky naznačujú, že ginkgetín blokuje tvorbu penových buniek indukovanú oxLDL mechanizmom nezávislým od expresie CD36 a TLR, ale závislým od TRPV4. Predchádzajúce štúdie z našej skupiny a iných ukázali, že aktivácia JNK2 sa podieľa na tvorbe penových buniek a vývoji aterosklerotických lézií7,57. Tiež sa uvádza, že JNK sa podieľa na modulácii MMP-9 a MMP-13, ktoré sú nadmerne exprimované v aterosklerotických léziách64–68. Vzhľadom na uznávanú väzbu JNK v aterogénnych procesoch sme chceli určiť, či by ginkgetín mohol inhibovať aktiváciu JNK. V súlade s predchádzajúcimi správami naše výsledky tiež ukázali, že ginkgetín blokuje fosforyláciu JNK2 v makrofágoch indukovanú zápalovým stimulom. Tento výsledok naznačuje možný mechanizmus, ktorým Linkedin blokuje tvorbu penových buniek. Ďalej sme zistili významnú downreguláciu v oxLDL-indukovanej expresii TNF, IL12, IL1 a MCP1 mRNA v bunkách ošetrených ginkgetínom v porovnaní s kontrolou vehikula, čo zdôrazňuje potenciálne protizápalové úlohy ginkgetínu v reakcii na oxLDL. Stručne povedané, naše výsledky ukázali, že ginkgetín inhibuje proaterogénnu a zápalovú funkciu makrofágov v závislosti od TRPV. Tieto zistenia teda posilňujú odôvodnenie použitia prírodných zlúčenín pri vývoji potenciálnych terapeutík a/alebo chemopreventívnych činidiel.

Referencie
1. Barquera, S. a kol. Globálny prehľad epidemiológie aterosklerotického kardiovaskulárneho ochorenia. Arch. Med. Res. 46, 328 – 338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Bunková biológia makrofágov pri ateroskleróze. Cela 145, 341-355 (2011).
3. Libby, P. Zápal pri ateroskleróze. Nature 407, 233-241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Cytokíny, metabolizmus lipidov makrofágov a penové bunky: dôsledky pre terapiu kardiovaskulárnych chorôb. Prog. Lipid Res. 50, 331 – 347 (2011).
5. Febbraio, M. a kol. Cielené narušenie vychytávacieho receptora triedy B CD36 chráni pred rozvojom aterosklerotických lézií u myší. J. Clin. investovať. 105, 1049-1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV a kol. Vychytávacie receptory triedy AI/II a CD36 sú hlavné receptory zodpovedné za vychytávanie modifikovaného lipoproteínu s nízkou hustotou, čo vedie k zaťaženiu makrofágmi lipidmi. J. Biol. Chem. 277, 49982-49988 (2002).
7. Rahaman, SO a kol. CD36-závislá signálna kaskáda je nevyhnutná na tvorbu penových buniek makrofágov. Cell Metab. 4, 211-221 (2006).
8. Ross, R. Ateroskleróza-zápalové ochorenie. N Engl J Med. 340(2), 115-126 (1999).
9. Libby P. Te molekulárne mechanizmy trombotických komplikácií aterosklerózy. J. Intern. Med. 517-527, 2008.
10. Lusis, AJ Ateroskleróza. Nature 407, 233-241 (2000).
11. Matthews, BD a kol. Ultra rýchla aktivácia iónových kanálov TRPV4 mechanickými silami aplikovanými na beta1 integríny bunkového povrchu. Celé číslo. Biol. (Camb). 2(9), 435-442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-TAZ mechanotransdukčná signalizačná os v tuhosti matrice a TGF 1-indukovanom epitelovo-mezenchymálnom prechode. Cell Mol. Bioeng.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Prechodný receptorový potenciál vaniloid 4 je potrebný pre reakciu cudzieho telesa a tvorbu obrovských buniek. Am. J. Pathol. 189(8), 1505 – 1512 (2019).
14. Goswami, R. a kol. Vápnikový priepustný kanál TRPV4 je novým regulátorom tvorby penových buniek makrofágov indukovanej oxidovaným LDL. Voľný Radic. Biol. Med. 110, 142 – 150 (2017).