Izoxazoly na báze trifluórmetylovaných flavonoidov ako antidiabetiká a činidlá proti obezite: syntéza, in vitro inhibičná aktivita amylázy, molekulárne dokovanie a analýza vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comvedieť viac

Faisal K. Algethami 1,*, Ilyes Saidi 2, Hani Nasser Abdelhamid 3, Mohamed R. Elamin 1, Babiker Y. Abdulkhair 1, Amani Chrouda 4 a Hichem Ben Jannet 2,*

Abstrakt:Diabetes mellitus je celosvetovo závažným zdravotným problémom. Riadenie trávenia sacharidov poskytuje alternatívnu liečbu.Flavonoidytvoria najväčšiu skupinupolyfenolickézlúčeniny, produkované rastlinami široko konzumovanými ako potrava a/alebo využívanými na terapeutické účely. Izoxazoly ako také pritiahli pozornosť medicínskych chemikov svojou značnou bioaktivitou. Hlavným cieľom tejto práce teda bolo objaviť nové hybridné molekuly s vlastnosťami flavonoidov aj izoxazolov za účelom kontroly trávenia sacharidov. Okrem toho je trifluórmetylová skupina kľúčovou entitou pri vývoji liekov vďaka svojej silnej lipofilite a metabolickej stabilite. Preto táto práca opisuje kondenzáciu predtým syntetizovaného trifluórmetylačného flavonolu s rôznymi arylnitriloxidmi, čím sa získa 13 hybridných molekúl označených ako izoxazoly na báze trifluórmetylačných flavonoidov. Štruktúry získaných zlúčenín boli odvodené z1H NMR,13C NMR a HRMS analýzy. 15 novo syntetizovaných zlúčenín inhibovalo aktivitu -amylázy s účinnosťou v rozsahu od 64,5 ± 0,7 percenta do 94,7 ± 1,2 percenta pri koncentrácii 50 uM as hodnotami IC50 12,6 ± 0,2 uM – 27,6 ± 1,1 uM. Najúčinnejšie zlúčeniny z hľadiska účinnosti a účinnosti boli 3b, 3h, 3j a 3m. Medzi nové trifluórmetyláciena báze flavonoidovizoxazoly, zlúčenina 3b bola najúčinnejším inhibítorom aktivity -amylázy (PI=94,7 ± 1,2 percenta pri 50 µM), s účinnosťou (IC50=12,6 ± { {13}},2 uM) podobne ako pozitívna kontrola akarbózy (IC50=12,4 ± 0,1 uM). Štúdia vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou založená na molekulárnej dokovacej analýze ukázala nízku väzbovú energiu, správny spôsob interakcie v aktívnom vrecku cieľového enzýmu a schopnosť interagovať s kľúčovými zvyškami glykozidového štiepenia (GLU{{16 }} a ASP-206), ktoré vysvetľujú inhibičné účinky -amylázy vytvorené niekoľkými derivátmi.

Kľúčové slová:-inhibícia amylázy; antidiabetikum; proti obezite; cykloadícia; flavonoidy; izoxazoly na báze trifluórmetylačných flavonoidov; molekulárne dokovanie; Analýza SAR

Kliknite sem a dozviete sa viac

1. Úvod

Obezitaa diabetes mellitus predstavujú celosvetovo hlavné zdravotné problémy [1,2]. Diabetes mellitus je totiž primárne charakterizovaný nekontrolovanou hladinou cukru v krvi. Diabetes mellitus 1. typu je však výsledkom prerušenia sekrécie inzulínu (závislý od inzulínu), zatiaľ čo typ 2 zvyčajne pochádza z inzulínovej rezistencie (zmeny štruktúry receptora na cieľových bunkách, čo vedie k zníženiu afinity hormón-receptor), narušenia v sekrécii inzulínu alebo oboch [3,4]. Inhibícia degradácie polysacharidov na monosacharidy vhodné na absorpciu do buniek nevyhnutne implementuje základné stratégie na kontrolu diabetu a pomáha pri zvládaní obezity [3]. Enzým -amyláza (EC.3.2.1.1) je tráviaci enzým hydrolyzujúci -1,4-glykozidové väzby uhľohydrátov, ako sú škroby [5]. Preto inhibícia -amylázy tak či onak prispieva k riadeniu trávenia sacharidov [6,7]; teda predstavuje čiastočnú dráhu regulácie enzymatickej aktivity -amylázy; je teda ideálnou terapiou na reguláciu obezity a diabetu, ako aj s nimi súvisiacich komplikácií [4]. Väčšina komerčných inhibítorov amylázy – ako je akarbóza, miglitol, fázolamín a voglibóza – bola spojená s črevnými vedľajšími účinkami, ako je plynatosť, bolesť brucha, hnačka, zlyhanie pečene, závažné kožné alergie a pneumatóza, cystoidná črevná infekcia [6] ]. Najlepšie inhibítory -amylázy sú takzvané kompetitívne inhibítory, ktoré inhibujú enzým ireverzibilne. Kompetitívny inhibítor sa viaže na aktívne miesto cieľového enzýmu, a tak zabraňuje väzbe substrátu. Preto pri kompetitívnej inhibícii inhibítor súťaží so substrátom o aktívne miesto. Na druhej strane, pri ireverzibilnej inhibícii sa inhibítor od cieľového enzýmu oddeľuje veľmi pomaly, pretože sa pevne naviaže na enzým. Ireverzibilné inhibítory sa zvyčajne kovalentne viažu na aktívne miesto enzýmu modifikáciou zvyškov alebo funkčných skupín nevyhnutných pre enzymatickú aktivitu tak, že enzým je ireverzibilne inhibovaný. Na dobrú inhibíciu trávenia uhľohydrátov – čo môže pomôcť kontrolovať obezitu a dokonca aj cukrovku 2. typu – potrebujeme neselektívnu látku schopnú inhibovať väčšinu tráviacich enzýmov cukrov, konkrétne slinnú -amylázu, pankreatickú -amylázu a -glukozidázu. [8,9]. Predchádzajúci výskum polosyntetizovaných flavonoidov zistil, že deriváty flavonoidov na báze izoxazolu vykazovali významné antidiabetické účinky zvýšením absorpcie glukózy v bunkách HepG2 rezistentných na inzulín [10]. Okrem toho sú flavonoidy najväčšou skupinou polyfenolových sekundárnych metabolitov, ktoré sa bežne vyskytujú v rastlinách. Tieto sekundárne metabolity sú zodpovedné za atraktívne sfarbenie plodov, plodov a listov [11]. Štruktúrne majú flavonoidy uhlíkový skelet C15 pozostávajúci z dvoch aromatických kruhov (A) a (B), ktoré sú spolu spojené reťazcom C3 tvoriacim heterocyklus (C) [12]. Pre tento typ polyfenolovej zlúčeniny bolo popísaných mnoho biologických vlastností, ako je inhibícia -amylázy [7,13–15], antidiabetická [16,17], protirakovinová [18,19] aantioxidantúčinky [20] a iné biologické aktivity [21–25]. Tento bohatý biologický profil však motivoval niekoľko chemických výskumných tímov k syntéze flavonoidov so špeciálnymi skupinami a substituentmi na zacielenie na konkrétne biologické aktivity [26–30]. Na druhej strane, izoxazol je päťčlenný heterocyklus, ktorý má veľký význam v medicínskej chémii. Okrem toho prirodzene sa vyskytujúce izoxazoly – ako je kyselina iboténová (halucinogénna, neurotoxín) a muscimol (halucinogénny, antagonista receptora GABAA) [31–34] – priťahujú čoraz väčšiu pozornosť chemikov a farmakológov vďaka svojim silným biologickým a farmakologickým vlastnostiam. Okrem toho sa ukázalo, že deriváty izoxazolu majú široké spektrum biologických vlastností, ako sú antidiabetické, analgetické, protizápalové, anti-HIV a protirakovinové aktivity [10,35–40]. Izoxazolový kruh sa vo veľkej miere používa ako kľúčový stavebný prvok pre lieky, ako je zonisamid (antikonvulzívum) [41], valdekoxib, parekoxib (inhibítory COX-2) [42] a leflunomid (antireumatikum) [43]. V posledných desaťročiach je trifluórmetylová skupina čoraz viac žiadaná pre vývoj bioaktívnych zlúčenín, a to z dôvodu jej silného charakteru priťahovania elektrónov, metabolickej stability a lipofilnej povahy, ktoré sa považujú za dôležité fyzikálno-chemické vlastnosti bioaktívnych molekúl [44]. Zistilo sa, že táto fluórovaná skupina je nenahraditeľná v mnohých dôležitých liekoch vrátane flufenazínu (antipsychotikum, protirakovina) [45], leflunomidu (antireumatikum) [43], celekoxibu (selektívny inhibítor COX{22}}) [46], fluoxetínu (antidepresívum) [47] a fluazinam (fungicíd) [48]. V jednom prehľade literatúry sa uvádza, že trifluórmetylačná kyselina 5-aminonikotínová vykazuje sľubnú -amylázovú aktivitu [49]. Okrem toho sa zistilo, že chlórované hybridné molekuly pyrazol-tiazol sú dobrými inhibítormi enzýmu -amylázy [50], čo tiež naznačuje dôležitosť atómu chlóru v štruktúrach inhibujúcich -amylázu. Vyššie uvedené literárne údaje uvádzajúce dôležité fyzikálno-chemické vlastnosti trifluórmetylovej skupiny – a jej príspevok spolu s flavonoidmi a izoxazolmi k inhibícii –amylázy a antidiabetickým aktivitám – nás povzbudili k príprave novej série hybridných molekúl, kde bol trifluórmetylačný flavonoid spojené so sériou arylizoxazolov cez metylénový linker a na vyhodnotenie ich inhibičnej sily na enzým -amyláza. Vzťah medzi štruktúrou a aktivitou (SAR) bol študovaný a schválený pomocou molekulárnej dokovacej analýzy.

Cistanche na zlepšenie imunity

2. Výsledky a diskusia

2.1. Chémia Príprava trifluórmetylačného flavonolu (1) – predtým syntetizovaného v našom laboratóriu a vykazujúceho zaujímavý cytotoxický potenciál – bola opísaná podľa postupu prijatého Znati et al. (2019) [30]. 5-Chlór-2-hydroxyacetofenón sa kondenzoval s 4-(trifluórmetyl)benzaldehydom pod spätným chladičom metanolu a v prítomnosti hydroxidu sodného počas 3 hodín za vzniku 5-chlóru{{10 }}(trifluórmetyl)-2-hydroxychalkón; potom sa pyránový kruh (C) cyklizoval a uhlík C-3 sa oxidoval pridaním (H202, NaOH) počas 2 hodín pri teplote miestnosti (schéma 1). Molekula 1 sa získala s dobrým výťažkom (79 percent) po vyzrážaní v ľadovej vode. Schéma 1. Syntetická dráha trifluórmetylačného flavonolu (1). Štruktúra flavonolu (1) bola potvrdená spektroskopickou analýzou a porovnaním s údajmi z literatúry [30]. 1,3-dipolárna cykloadícia je chemická reakcia medzi 1,3-dipólom a dipolarofilom za vzniku päťčlenného kruhu. Preto sa 1,3-dipolárna cykloadícia považuje za najdôležitejší spôsob syntézy širokého spektra izoxazolov. Okrem toho regiošpecifická syntéza izoxazolov katalyzovaná Cu(I) pri mikrovlnnom ožiarení je založená na [3 plus 2] cykloadícii medzi terminálnymi alkínmi (dipololarofilmi) a arylnitriloxidmi (dipólmi), čím sa získajú výlučne 3,5-disubstituované regioizoméry [39,51]. Náš prístup k zacieleniu na trifluórmetylačné flavonoidové izoxazoly (3a–m), najprv začal prípravou dipolarofilu (2) prostredníctvom propargylácie hydroxylovej skupiny v polohe C-3 flavonolu (1) v bezvodom DMF pre 2 h pri teplote miestnosti, v prítomnosti K2C03, ako je znázornené v schéme 2. Dipolarofil (2) bol pripravený s vynikajúcim výťažkom (94 percent). Schéma 2. Syntetická dráha dipolarofilu (2).

Štruktúra zlúčeniny 2 bola stanovená podľa jej spektrálnych údajov. Okrem signálov zodpovedajúcich protónom a uhlíkom zavedeným flavonolom (1) boli v 1H a 13C NMR spektrách detegované nové signály propargylovej skupiny. Okrem toho 1H NMR spektrum dipolarofilu (2), zaznamenané v CDCI3 pri 300 MHz, ukázalo dublet pri 5H 5,06 (2H, d, J=2,4 Hz) zodpovedajúci metylénovému protónu H{{13 }}“ a triplet pri 5H 2,36 (1H, t, J=2,4 Hz) pripísateľný protónu etinylovej skupiny (H-3). 13C NMR spektrum potvrdilo zavedenie propargylovej skupiny pozorovaním nových signálov pri 8C 78,4, 76,9 a 59,6, ktoré možno pripísať C-2“, C-3“ a C{{29} Hydroxymylchloridy a–m sú hlavnými prekurzormi in situ generácií arylnitriloxidov – činidiel, ktoré sa podieľajú na reakcii 1,3-dipolárnej cykloadície na syntézu izoxazolov. Prekurzory (a –m) boli syntetizované z vhodných aldehydov podľa všeobecného postupu opísaného v Himo a kol., (2005) [51]. 1). Zodpovedajúce arylnitriloxidy teda vznikli in situ dehydrohalogenáciou zodpovedajúcich hydroxylchloridov s použitím trietylamínu ako bázy Tabuľka 1. Štruktúry a výťažky hydroxylchloridov (a–m) a trifluórmetylačných izoxazolov na báze flavonoidov (3a –m).

1,3-dipolárna cykloadičná reakcia bola aplikovaná v regiošpecifickom prístupe s použitím terminálneho alkínu (2) a rôznych hydroxylchloridov (a–m) rôzne substituovaných (schéma 3). Získané výsledky sú uvedené v tabuľke 1. Schéma 3. Syntetická dráha trifluórmetylačných flavonoidov izoxazolov 3a–m. Všetky reakcie sa uskutočňovali pod mikrovlnným ožarovaním (250W) v DMF v prítomnosti trietylamínu a jodidu meďného (Cul) počas 5 minút. Produkty sa izolovali z reakčnej zmesi jednoduchým čistením na silikagélovej kolóne. Novo pripravené 3,{{10}}disubstituované izoxazoly (3a–m) sa získali vo výťažkoch v rozmedzí od 73 do 96 percent (tabuľka 1). Štruktúry syntetizovaných izoxazolov na báze trifluórmetylačných flavonoidov (3a–m) (tabuľka 1) boli stanovené pomocou 1H, 13C NMR a DEPT 135. 1H NMR spektrá týchto zlúčenín ukázali singlet rezonujúci pri 5H 6,3{{68 }}–6,60 pripísateľný metínovému protónu H-4“ izoxazolového kruhu, ďalšiemu singletu pri δH 5,35–5,45 pripísateľnému metylénovému protónu H-6} a ďalším signálom v aromatická protónová zóna týkajúca sa protónov zavedených arylovou skupinou. Navyše tieto štruktúry boli potvrdené ich 13C NMR a DEPT 135 spektrami, ktoré ukazujú všetky očakávané uhlíkové signály – najmä tie aromatické zavedené použitými hydroxylchloridmi, ako aj uhlík metínu C-4 izoxazolový kruh rezonujúci na δC 1{{9{{1{{1{112}}5}}0}}}}2,5–103.{142}} a ten, ktorého signál je invertovaný v spektre DEPT 135, rezonujúci na δC 63,5–63,9, pripísateľného metylénu C-6“. 2.2. Hodnotenie inhibície -amylázy Na kontrolu aktivity enzýmu je inhibícia jedným z najúspešnejších terapeutických prostriedkov. Preto inhibícia enzýmu -amylázy predstavuje čiastočnú cestu na zvládnutie cukrovky a kontrolu hmotnosti tým, že bráni tráveniu sacharidov. Lieky ako akarbóza dodnes tvoria súčasť arzenálu liekov používaných na liečbu DM a obezity. Avšak akarbóza sa nepoužíva ako monoterapia kvôli jej účinnosti a vedľajším účinkom; namiesto toho sa akarbóza používa ako doplnková terapia a veľmi často sa používa v kombinácii s inými hypoglykemickými liekmi. Spolu s tým sa tento liek bežne používa ako štandardná zlúčenina pri štúdiu inhibície -amylázy. V tejto štúdii sa u 15 syntetizovaných zlúčenín (1, 2 a 3a–m) hodnotila ich inhibičná aktivita na amylázu. Výsledky boli vyjadrené v parametroch účinnosti (IC50 ± SEM uM) a účinnosti (PI pri 50uM) a sú uvedené v tabuľke 2. Podľa výsledkov boli syntetizované molekuly (1, 2 a 3a–m) majú výraznú anti{63}}amylázovú aktivitu (p menšie alebo rovné 0.05), s účinnosťou v rozmedzí od 64,5 ± {{177} },7 až 94,7 ± 1,2 percenta pri koncentrácii 50 µM a účinnosti hodnôt IC5{{2{{207}}2}} v rozmedzí od 12,6 ± {{219} },2 až 27,6 ± 1,1 uM. Spomedzi novo pripravených izoxazolov na báze trifluórmetylačných flavonoidov sa zistilo, že 3b (R1 =F, R2 =H) je najúčinnejší (IC50=12,6 ± 0,2 µM) a najúčinnejšia (PI=94 0,7 ± 1,2 percenta pri 50 uM) zlúčenina na inhibíciu aktivity enzýmu -amylázy. Zistilo sa, že tieto významné hodnoty sú porovnateľné s hodnotami akarbózy (PI=97,8 ± 0,5 percent pri 50 uM; IC50=12,4 ± 0,1 uM), použitej ako štandardná látka. Podobne zlúčeniny 3h, 3j a 3m možno považovať za bioaktívne z hľadiska účinnosti a potencie (PI= 93.1 ± 0,9 percenta –93,5 ± 1,1 percenta pri 50 µM; IC{119}}.3 ± 0,2 µM – 13,8 ± 0,1 µM) v porovnaní s ich analógom 3b a akarbózou. Zistilo sa, že zvyšok zlúčenín (1, 2, 3a, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 3i, 3k a 3l) je tiež schopný inhibovať enzým -amylázu, ale zostáva menej účinný (PI{{ 140}},5 ± 0,7 percenta –87,1 ± 0,7 percenta pri 50 uM; IC50=14 0,4 ± 0,2 uM až 27,6 ± 1,1 uM) ako vyššie uvedené analógy. Anti- -amylázová aktivita dosiahnutá syntetizovanými zlúčeninami je v súlade s predchádzajúcimi správami, medzi ktorými Nie et al. (2020) [10] uviedli, že izoxazoly na báze flavonoidov by mohli predstavovať cenné skelety pre objavovanie antidiabetických liekov. Porovnaním štruktúr a aktivít syntetizovaných molekúl vykazovali zlúčeniny 3bd, halogénované v para polohe fenylovej skupiny pripojenej k izoxazolovému kruhu, významnú účinnosť (PI= 85,4 ± 0,9 percenta –94,7 ± 1,2 percenta pri 50 µM) a účinnosť (IC50=12,6 ± 0,2 µM–14,6 ± 0,3 µM) pri inhibícii enzýmu -amylázy. Toto zistenie je v dobrej zhode s literatúrou, ktorá ukazuje, že prítomnosť atómov halogénu (F, Cl alebo Br) v štruktúre bola nevyhnutná pre silnú inhibíciu -amylázy [49,50]. Štúdia vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou nám navyše umožnila dospieť k záveru, že viac induktívnych účinkov atraktora (-I) a mezomérneho donoru (plus M) zvyšuje inhibičnú účinnosť a potenciu -amylázy (aktivita fluórovaného derivátu 3b (R{{186} } F, R2 =H; PI=94,7 ± 1,2 percenta pri 50 µM; IC50=12,6 ± 0,2 µM) je vyššie ako v prípade chlórovaného derivátu 3c (R{ {198}} Cl, R2 =H; PI=87,1 ± 0,7 percenta pri 50 uM; IC50=14,4 ± 0,2 uM), po ktorom nasleduje brómovaný derivát 3d (R 1=Br, R2=H; PI=85,4 ± 0,9 percent pri 50 µM; IC 50=14,6 ± 0,3 µM)), v súlade s predchádzajúcimi štúdiami [ 4,49]. Je zrejmé, že inhibícia -amylázy sa zvyšuje s účinkami indukčného atraktora (-I) a mezomérneho donoru (plus M) atómov halogénu.

2.3. Štúdie molekulárneho dokovaniaEnzým -amyláza (EC 3.2.1.1) – glykozylhydroláza – hydrolyzuje -1,4-glykozidové väzby v škroboch, ako je amylóza. Kryštalická štruktúra enzýmu -amyláza (PDB: 7TAA) je zložená z reťazca A s dĺžkou sekvencie 478 aminokyselín [52]. -Amyláza je jedným z najdôležitejších kľúčových enzýmov zodpovedných za trávenie sacharidov [5]; blokovanie enzýmu -amylázy teda ponúka stratégiu kontroly diabetu a pomáha pri zvládaní obezity [6,7]. Bola vykonaná rozsiahla analýza molekulového dokovania, aby sa preskúmal väzbový režim, určili sa pravdepodobné interakcie syntetizovaných molekúl (1, 2 a 3a–m) v hydrofóbnom väzobnom vrecku ABC (modifikovaný hexasacharid akarbózy) štruktúry proteínových kryštálov Aspergillus oryzae - enzýmu amylázy (PDB: 7TAA) [52] pomocou softvéru AutoDock Vina a racionalizovali pozorovanú in vitro inhibičnú aktivitu voči amyláze novo syntetizovaných zlúčenín. Všetky syntetizované molekuly (1, 2 a 3a-m) - a akarbóza, ktorá sa používa ako štandardná látka - boli študované in silico. Väzbové energie a podrobnosti o interakciách (počet interakcií, počet interagujúcich aminokyselín, interagujúcich aminokyselín a vodíkových väzieb) ligandov s cieľovým enzýmom sú uvedené v tabuľke 2. Z výsledkov in silico dokovania (tabuľka 2) bolo pozorované že zlúčeniny 1 a 2 vykazovali dobré väzbové energie (-7,7 a -7,8 kcal/mol, v danom poradí) vo väzbovom mieste enzýmu -amylázy (PDB: 7TAA). Tieto hodnoty sú porovnateľné s hodnotami štandardnej látky (akarbóza, -7,9 kcal/mol), čo im umožňuje priaznivo zapadnúť do aktívneho miesta cieľového enzýmu. Je zaujímavé, že novo syntetizované izoxazoly na báze trifluórmetylačných flavonoidov (3a–m) poskytli očakávané výsledky; boli správne vo väzbovej polohe a vykazovali nádherné väzbové energie v rozsahu od -9,6 do -8,2 kcal / mol (tabuľka 2). To by im všetkým umožnilo priaznivo zapadnúť do aktívneho miesta enzýmu -amylázy, lepšie ako akarbóza. Spôsob väzby troch najaktívnejších zlúčenín (3b, 3h a 3j) s cieľovým enzýmom je diskutovaný nižšie. Zlúčenina 3b – najsilnejší a najúčinnejší inhibítor enzýmu -amylázy v testovanej sérii izoxazolov na báze trifluórmetylačných flavonoidov – vykazovala vynikajúcu väzbovú energiu -9,6 kcal/mol. Okrem toho spôsob väzby 3b naznačuje, že sa podieľa na 16 nekovalentných interakciách s 10 aminokyselinami (tabuľka 2). 3-(3-(4-fluórfenyl)izoxazol-5-yl)metoxylová časť dôkladne tvorí dve halogénové (fluórové) väzby s ASP-206, Pi –Pí väzba v tvare T s TYR-82, Pi–katiónová väzba s HIS-80, Molekuly 2021, 26, 5214 8 z 18 dvoch konvenčných vodíkových väzieb s ARG{{71 }} a Pi–anión a väzba uhlík-vodík s ASP-340 zvyškom. Okrem toho sa trifluórmetylová skupina pripojená k C-40 flavonoidového skeletu podieľa na konvenčnej vodíkovej väzbe s GLY-167 a dvoch alkylových väzbách s LEU-166 a LEU-173 aminoskupinou kyseliny. Na druhej strane flflavonoidový skelet interaguje prostredníctvom Pi–aniónovej väzby s ASP-340, konvenčnej vodíkovej väzby s GLN-35 a Pi–alkylovej a dvoch vrstvených väzieb Pi–Pi s TYR{ {80}} (obrázok 1).

Obrázok 1. Zlúčenina 3b zapadá do hydrofóbneho väzbového vrecka ABC v PDB: 7TAA.

Okrem toho zlúčenina 3h vykazovala zaujímavú väzbovú energiu -9, 3 kcal / mol. Jeho väzbový režim ukazuje, že sa podieľa na 15 nekovalentných interakciách s 10 zvyškami (tabuľka 2). Molekulárny pohľad z analýzy dokovania teda naznačuje, že 3-(3-(4- metoxyfenyl)izoxazol-5-yl)metoxylová časť tvorí dve väzby uhlík-vodík s GLU{{12 }}, Pi–Pi väzba v tvare T s TYR-82, dve konvenčné vodíkové väzby s ARG-344, väzba uhlík-vodík s HIS-80 a Pi–aniónová väzba so zvyškom ASP{18}}. Okrem toho je trifluórmetylová skupina zapojená do konvenčnej vodíkovej väzby s GLY-167 a dvoch alkylových interakcií s LEU-166 a LEU-173 aminokyselinami. Okrem toho je flflavonoidový skelet zapojený do konvenčnej vodíkovej väzby s GLN-35, Pi–aniónovej väzby s ASP-340, dvoch vrstvených väzieb Pi–Pi a Pi–alkylovej väzby s TYR{ {24}} (obrázok 2)

Na druhej strane zlúčenina 3j vykazovala významnú väzbovú energiu -9,2 kcal/mol. Jeho väzbový režim ukazuje, že sa podieľa na 16 nekovalentných interakciách s 13 aminokyselinami (tabuľka 2). Hĺbková analýza molekulárneho dokovania preto naznačuje, že 3-(3-(4-butoxy-3-chlórfenyl)izoxazol-5-yl)metoxylová časť tvorí dve bežné vodíkové väzby s ARG-344, tri Pi-alkylové väzby s TYR-82, HIS-210 a HIS-296, alkylová interakcia s LEU-232, a uhlík-vodíková väzba s GLU-230 zvyškom, Pi–aniónová väzba s ASP-340 a Pi–katiónová väzba s HIS-80. Okrem toho je trifluórmetylová skupina spojená s aromatickým kruhom B flavonoidového skeletu zapojená do konvenčnej vodíkovej väzby s GLY-167 a dvoch alkylových interakcií so zvyškami LEU-166 a LEU-173. Okrem toho je flflavonoidný skelet zapojený do konvenčnej vodíkovej väzby s GLN-35 a Pi-alkyl a dvoch Pi-Pi vrstvených väzieb s aminokyselinou TYR-75 (obrázok 3). V enzýme -amyláza Aspergillus oryzae (PDB: 7TAA) sú nukleofilom a zvyškami katalytických kyselín/báz, ktoré sú zodpovedné za štiepenie glykozidických väzieb, aminokyseliny ASP-206 a GLU-230 , respektíve [5]. Preto interakcie medzi proteínom a ligandom, predovšetkým prostredníctvom zvyškov GLU-230 a ASP-206, sú najlepším spôsobom, ako blokovať štiepenie glykozidických väzieb. V skutočnosti nízka väzbová energia, správna väzbová poloha, schopnosť interagovať s kľúčovými zvyškami glykozidického štiepenia (GLU-230 a ASP-206) a veľký počet interakcií v aktívnom vrecku cieľový enzým (tabuľka 2) môže vysvetliť silnú inhibičnú -amylázovú účinnosť zistenú väčšinou zlúčenín.

Obrázok 3. Zlúčenina 3j zapadá do hydrofóbneho väzbového vrecka ABC v PDB: 7TAA

3. Materiály a metódy

3.1. Všeobecné experimentálnePostup Všetky použité rozpúšťadlá boli pred použitím čerstvo destilované. Všetky chemické reakcie boli monitorované s použitím komerčných TLC platní (Silikagel 60, F254, SDS). Na stanovenie teplôt topenia sa použil prístroj Büchi 510. Všetky1H NMR (300 MHz), DEPT 135 a13C NMR (75 MHz) spektrá boli zaznamenané v deuterovanom chloroforme a dimetylsulfoxide-d6 pomocou spektrometra Bruker AC{10}}. Všetky chemické posuny (5) boli uvedené v dieloch na milión (ppm), väzbové konštanty (J) boli uvedené v Hertzoch (Hz) a rezonancia rezonancie reziduálneho nedeuterovaného rozpúšťadla bola použitá ako interná referencia. DCI-HRMS spektrá boli merané v aWaters GCT 1er v režime kladných iónov. ESI-HRMS spektrá boli zaznamenané pomocou ESI-TOF (Waters LCT, Markham, Ontario, Kanada) v pozitívnom iónovom móde s použitím reflektrónového módu.

4. Závery

15 novosyntetizovaných izoxazolov na báze trifluórmetylačných flavonoidov (3a–m) bolo hodnotených in vitro na ich inhibičnú aktivitu na amylázu a boli zaznamenané významné výsledky. Cykloadukty 3b, 3h, 3j a 3m vykazovali porovnateľnú účinnosť a silu ako akarbóza používaná ako štandardná látka na inhibíciu enzýmu -amylázy. Okrem toho analýza vzťahu štruktúra-aktivita odhalila, že halogenované a alkoxylované deriváty boli najaktívnejšie zlúčeniny. Podľa analýzy silicodocking izoxazoly na báze trifluórmetylačných flavonoidov vykazovali nízku väzbovú energiu, veľký počet interakcií a správnu väzbovú polohu v aktívnom vrecku cieľového enzýmu. Väčšina z nich interagovala s nukleofilom a zvyškami katalytických kyselín/báz (GLU-230 a ASP-206), čo môže vysvetliť ich účinnosť a silu pri inhibícii enzymatickej aktivity -amylázy. Sľubné aktivity vykazované syntetizovanými hybridnými zlúčeninami podporujú ich zapojenie ako kandidátov na objavenie nových antidiabetík a látok proti obezite. Veľmi hĺbkové štúdie a bezpečnostné faktory však musia brať do úvahy riziká spojené s novosťou účinnej látky, toxicitou, stabilitou a rozpustnosťou vo vodnom médiu a farmakodynamickými charakteristikami vrátane spoľahlivosti, s akou je možné sledovať vedľajšie účinky. u ľudí skôr, ako sa rozvinú potenciálne závažné/nevratné účinky. Doplnkové materiály: Nasledovné sú dostupné online, NMR spektrá syntetizovaných zlúčenín (1, 2 a 3a–m), Tabuľka S1: Krivky odozvy na koncentráciu použité na výpočet hodnôt IC50. Príspevky autora: Konceptualizácia FKA a IS; metodika, HBJ; softvér, IS a H.NA; validácia, FKA a AC; formálna analýza, MRE; vyšetrovanie, FKA a IS; zdroje, BYA; správa údajov, FKA a IS; písanie – príprava pôvodného návrhu, FKA a IS; písanie – recenzia a úprava, HBJ; vizualizácia, FKA a BYA; supervízia, HBJ; administrácia projektov, FKA a HBJ; získanie financií, FKA Všetci autori si prečítali a súhlasili s uverejnenou verziou rukopisu. Financovanie: Tento výskum nedostal žiadne externé financovanie.Vyhlásenie inštitucionálnej kontrolnej rady: Neuplatňuje sa.Vyhlásenie o informovanom súhlase: Neuplatňuje sa.Vyhlásenie o dostupnosti údajov: Neuplatňuje sa.Poďakovanie: Autori oceňujú dekanát vedeckého výskumu imáma Mohammada Ibn Saud Islamic Univerzite za financovanie tejto práce prostredníctvom Výskumnej skupiny. RG-21-09-69.Konflikty záujmov: Autori nevyhlasujú žiadny konflikt záujmov.Dostupnosť vzorky: Vzorky zlúčenín nie sú u autorov k dispozícii.

Referencie
1. Boutayeb, A.; Boutayeb, S. Záťaž neprenosných chorôb v rozvojových krajinách. Int. J. Equity Health 2005, 4, 1–8. [CrossRef]
2. Wagner, KH; Brath, H. Globálny pohľad na vývoj neprenosných chorôb. Predch. Med. 2012, 54, S38–S41. [CrossRef]
3. Tseng, CH Potenciálne biologické mechanizmy arzénom indukovaného diabetes mellitus. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2004, 197, 67-83. [CrossRef]
4. Sala, D.; Zorzano, A. Diferenciálna kontrola svalovej hmoty pri diabetes mellitus 1. a 2. typu. Bunka. Mol. Life Sci. 2015, 72, 3803–3817. [CrossRef]
5. Brzozowski, AM; Davies, GJ Štruktúra aspergillus oryzae -amylázy v komplexe s inhibítorom akarbózou pri rozlíšení 2.0 Å. Biochemistry 1997, 36, 10837-10845. [CrossRef]
6. Jayaraj, S.; Suresh, S.; Kadeppagari, inhibítory RK amylázy a ich biomedicínske aplikácie. Starch-Stärke 2013, 65, 535–542. [CrossRef]
7. Khan, S.; Nazir, M.; Raiz, N.; Saleem, M.; Zengin, G.; Fazal, G.; Saleem, H.; Mukhtar, M.; Tousif, MI; Tareen, RB; a kol. Fytochemické profilovanie, biologické vlastnosti in vitro a štúdie in silico na populáciách Caragana ambigua (Fabaceae): komplexný prístup. Ind. Crops Prod. 2019, 131, 117–124. [CrossRef]
8. Berg, JM; Tymoczko, JL; Stryer, L. Enzýmy môžu byť inhibované špecifickými molekulami. In Biochemistry, 5. vydanie; WH Freeman: New York, NY, USA, 2002.
9. Kam, A.; Li, KM; Razmovski-Naumovski, V.; Nammi, S.; Shi, J.; Chan, K.; Li, GQ Porovnávacia štúdia o inhibičných účinkoch rôznych častí a chemických zložiek granátového jablka na -amylázu a -glukozidázu. Phytother. Res. 2013, 27, 1614–1620. [CrossRef]
10. Nie, JP; Qu, ZN; Chen, Y.; Chen, JH; Jiang, Y.; Jin, MN; Yu, Y.; Niu, WY; Duan, veliteľstvo; Qin, N. Objav a antidiabetické účinky nových derivátov flavonoidov na báze izoxazolu. Fitoterapia 2020, 142, 104499. [CrossRef]
11. Malešev, D.; Kunti´c, V. Skúmanie chelátov kov-flavonoidov a stanovenie flavonoidov prostredníctvom reakcií tvoriacich komplex kov-flavonoid. J. Srb. Chem. Soc. 2007, 72, 921-939. [CrossRef]
12. Pinheiro, PF; Goncalon, CJ Štrukturálna analýza flavonoidov a príbuzných zlúčenín – prehľad spektroskopických aplikácií. In Fytochemikálie – globálny pohľad na ich úlohu vo výžive a zdraví; InTech: Londýn, Spojené kráľovstvo, 2012.
13. Lo Piparo, E.; Scheib, H.; Frei, N.; Williamson, G.; Grigorov, M.; Chou, CJFlavonoidy prekontrola trávenia škrobu: Štrukturálne požiadavky na inhibíciu ľudskej -amylázy. J. Med. Chem. 2008, 51, 3555–3561. [CrossRef]
14. Xiao, J.; Ni, X.; Kai, G.; Chen, X. Prehľad o vzťahu štruktúry a aktivity stravyinhibícia polyfenolov-amyláza. Crit. Food Sci. Nutr. 2013, 53, 497–506. [CrossRef] [PubMed]
15. Hua, F.; Zhou, P.; Wu, HY; Chu, GX; Xie, ZW; Bao, GH Inhibícia -glukozidázy a -amylázy flavonoidovými glykozidmi z čaju Lu'an GuaPian: Molekulárne dokovanie a mechanizmus interakcie. Funkcia jedla. 2018, 9, 4173–4183. [CrossRef] [PubMed]
16. Vinayagam, R.; Xu, B. Antidiabetické vlastnosti flavonoidov v strave: Prehľad bunkového mechanizmu. Nutr. Metab. 2015, 12, 1–20. [CrossRef] [PubMed] 17. Ghorbani, A. Mechanizmy antidiabetických účinkov flavonoidu rutínu. Biomed. Pharmacother. 2017, 96, 305–312. [CrossRef] [PubMed]