Imunitné reakcie na sekvenčnú binokulárnu transplantáciu alogénnych retinálnych progenitorových buniek do sklovca u myší

Abstrakt:

Intravitreálna transplantácia alogénnych ľudských progenitorových buniek sietnice (RPC) je sľubná ako liečba oslepujúcej degenerácie sietnice. Predchádzajúca práca ukázala, že nervové progenitory sú dobre tolerované ako aloštepy po jednotlivých injekciách; avšak postupné dodávanie alogénnych buniek zvyšuje potenciálne riziko senzibilizácie hostiteľa s následným imunitným odmietnutím štepov. Súčasná štúdia bola navrhnutá tak, aby zhodnotila, či by bola imunitná odpoveď vyvolaná opakovanými intravitreálnymi transplantáciami alogénnych RPC s využitím myšacieho zvieracieho modelu. Myšie retinálne progenitorové bunky (gmRPC), pôvodne odvodené od darcov s genetickým pozadím C57BL/6, sme injikovali myšiam príjemcom BALB/c, aby sme poskytli bezpečnostné údaje o tom, čo možno očakávať po opakovanej liečbe pacientov alogénnym produktom z ľudských buniek . Imunitné reakcie na gmRPC boli mierne, pozostávali z T buniek, B buniek, neutrofilov a prirodzených zabíjačských buniek, pričom jasne prevládali makrofágy. Zvieratá liečené opakovanými dávkami gmRPC nevykazovali známky senzibilizácie, ani nedošlo k imunitne sprostredkovanej deštrukcii štepov. Napriek absencii imunosupresívnej liečby prežili alogénne štepy gmRPC po opakovanom dávkovaní, čo poskytuje podporu pre predbežné pozorovanie, že opakovaná injekcia alogénnych RPC do sklovcovej dutiny je tolerovaná u pacientov s retinitis pigmentosa.

cistanche rastlina zvyšujúca imunitný systém

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Kľúčové slová: kmeňové bunky; imunitná tolerancia; imunitné privilégium; odmietnutie štepu; intravitreálna injekcia

1. Úvod

Retinitis pigmentosa (RP) zahŕňa triedu genetickej degenerácie tyčinky a kužeľa a vedie k progresívnemu poškodeniu zraku a prípadnej slepote. Vo veľkej väčšine prípadov nie sú k dispozícii žiadne overené terapeutické opatrenia na zachovanie alebo obnovenie zraku; jednou stratégiou na riešenie tejto nenaplnenej medicínskej potreby je však transplantácia kmeňových buniek. Naša výskumná skupina skúmala intravitreálnu injekciu kultivovaných ľudských progenitorových buniek sietnice (RPC) ako spôsob zásahu do RP s terapeutickým cieľom stabilizovať progresiu alebo možno zvrátiť priebeh ochorenia. RPG môžu byť odvodené z nezrelých sietníc prostredníctvom darcovstva tkaniva alebo novšie z pluripotentných bunkových línií. Štúdie na zvieracích modeloch ukázali, že tieto bunky sú schopné zachrániť fotoreceptory pred degeneráciou po injekcii do oka a sú tiež schopné diferenciácie na tyčinkové fotoreceptory v oku hostiteľa. Existujú určité dôkazy zo štúdií na zvieratách, že injikované hRPC sa môžu stať funkčnými integrovanými fotoreceptormi a tým potenciálne stabilizovať sietnicu priamou náhradou umierajúcich buniek. Injikované hRPC teda môžu liečiť RP neurotrofickým spôsobom, ako aj mechanizmom nahradenia buniek. Či tak alebo onak, tento prístup založený na bunkách ponúka racionálnu stratégiu na liečbu pacientov postihnutých RP a potenciálne inými ochoreniami sietnice.

Ďalšou priaznivou vlastnosťou RPC a možno neurálnych progenitorov vo všeobecnosti je relatívna tolerancia, ktorú tieto bunky poskytujú po transplantácii ako aloštepy, najmä ak sú dodané na miesto vykazujúce imunitné privilégium, ako je sietnica [1,2]. Nedávne prehľady klinických štúdií uskutočnených v oblasti regeneratívnej medicíny však naďalej uvádzajú rozsiahle a významné problémy súvisiace so zápalom a imunitným odmietnutím [3,4], vrátane intervencií zameraných na oko, ako sú génové terapie sietnice [5], ako napr. ako aj niektoré, ale nie všetky bunkové terapie [6]. Hoci ide o lokálny bunkový typ, bunka pigmentového epitelu sietnice (RPE) nie je vyňatá z problémov s rejekciou [7–9]; preto je imunosupresia príjemcov v súčasnosti štandardnou praxou [10,11]. Na druhej strane sa zdá, že ľudské RPC sú pozoruhodne dobre tolerované ako aloštepy [6,12–16], aj keď sa to nevzťahuje na ich použitie ako xenoštepov, kde je potrebná supresia imunity [17]. Základom trvalého prežitia alogénnych RPC v oku je pravdepodobne množstvo faktorov súvisiacich s použitými bunkami a miestom príjemcu [1,8,18,19]. V predchádzajúcej práci s použitím prietokovej cytometrie sme ukázali, že ľudské neurálne progenitory, pochádzajúce z mozgu aj zo sietnice, exprimujú hlavné histokompatibilné antigény (MHC) triedy I, ale nie triedy II [20,21]. Klasický mechanizmus odmietnutia štepu zahŕňa nešpecifické rozpoznanie cudzích molekúl MHC triedy II hostiteľskými lymfocytmi CD4+ [20–25]. Týmto spôsobom môže absencia molekúl triedy II umožniť naštepeným progenitorovým bunkám vyhnúť sa imunitnému odmietnutiu sprostredkovanému týmto mechanizmom. Zjavný „imunitný privilegovaný“ stav intravitreálne injikovaných hRPC však nie je nevyhnutne absolútny. Zatiaľ čo myšie progenitory centrálneho nervového systému (CNS) neexprimujú detekovateľné molekuly MHC triedy I alebo triedy II na začiatku a vykazujú zjavné imunitné privilégium ako aloštepy [1,2,20], tieto bunky môžu za určitých okolností podliehať imunitnému odmietnutiu. Štúdie ukázali, že MHC antigény môžu byť indukované stimuláciou progenitorov CNS interferónom-gama (IFN) [1,26]. Progenitory CNS môžu byť odmietnuté po senzibilizácii predtým naštepeného hostiteľa. Preto progenitorové bunky CNS (vrátane RPC) exprimujú aloantigény, ktoré sú detegované hostiteľským imunitným systémom. Spolu to znamená, že imunitne privilegovaný stav transplantovaných progenitorových buniek je dočasný a podlieha modulácii, napr. cytokínmi prítomnými v lokálnom mikroprostredí, a ktorý sa môže meniť v priebehu degenerácií, ako je RP. Zo všetkých týchto dôvodov je ťažké predpovedať imunitnú odpoveď na viacnásobné intravitreálne injekcie RPC a musí sa špecificky preskúmať.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Ak sa liečba RPC ukáže ako klinicky úspešná pri RP, budú existovať silné stimuly na liečbu oboch očí pri tomto bilaterálnom oslepujúcom ochorení. Prinajmenšom z bezpečnostných dôvodov by sa binokulárne ošetrenia typicky uskutočňovali postupne, s výrazným oneskorením medzi dvoma injekciami. Je potrebné poznamenať, že toto postupné dodávanie alogénnych buniek môže viesť k senzibilizácii hostiteľa v reakcii na prvú injekciu, čo môže potenciálne spustiť imunitné odmietnutie v reakcii na druhú injekciu. To by mohlo viesť k strate štepov v oboch očiach. Predchádzajúce správy skúmajúce jednorazové subretinálne dávkovanie hRPC pri RP [27] alebo opakované dávkovanie s ľudskými nervovými progenitormi u zvierat [28,29] zahŕňali imunosupresiu. Preto bola nasledujúca štúdia navrhnutá ako translačné vyšetrenie myších RPC ako sekvenčných aloimplantátov v imunitne kompetentnom myšacom kmeni s odlišným genetickým pozadím. Hoci táto práca nezahŕňa ľudské produkty RPC, táto práca bola vykonaná ako súčasť štúdií umožňujúcich IND s cieľom poskytnúť údaje na zvieratách týkajúce sa bezpečnosti, tj či by bola u pacientov, ktorí dostávali opakovanú liečbu aloštepom RPC v štúdiách registrovaných FDA, potrebná imunitná supresia.

2. Výsledky

Na štúdium imunologických dôsledkov bilaterálnej injekcie RPC u alogénnych myší sa gmRPC (genetické pozadie C57BL/6) intravitreálne injikovali do jedného oka príjemcov BALB/c a druhá dávka RPC sa injikovala do druhého oka o 2 týždne neskôr. 2-týždenný časový interval bol zvolený tak, aby bol dostatočný na to, aby umožnil prvému štepu vyvolať vrodenú aj adaptívnu imunitnú odpoveď. Žiadne z experimentálnych zvierat nedostalo žiadnu imunosupresívnu liečbu liekom, aby bolo možné pozorovať prirodzené fyziologické imunitné reakcie.

2.1.Klinické pozorovanie a očné vyšetrenie neodhalilo žiadne abnormality

Hmotnosti experimentálnych zvierat sa merali v čase každej injekcie gmRPC. Všetky pokusné zvieratá vykazovali prírastok hmotnosti medzi prvou a druhou injekciou, čo je v súlade s celkovým dobrým zdravotným stavom. Zvieratá, ktoré boli ukončené v deň 14 a deň 28 ± 1 po druhej injekcii gmRPC, boli vyšetrené chirurgickým mikroskopom. Predný aj zadný segment väčšiny vyšetrovaných očí boli posúdené ako „v rámci normálnych limitov“ (WNL). Nezistili sa žiadne známky zápalu alebo iných viditeľných abnormalít v neliečených, falošne liečených a gmRPC liečených skupinách, čo naznačuje, že intravitreálna injekcia gmRPC nevyvolala nezákonné zápalové reakcie alebo fyzické poškodenie tkaniva detekovateľné touto metódou. Bunkové zhluky obsahujúce štep boli viditeľné v sklovci 14. aj 28. deň ± 1 po druhej injekcii gmRPC (obrázok 1). Opakovaná injekcia gmRPC neindukovala viditeľné zmeny vo veľkosti bunkových zhlukov, čo je v súlade s trvalým prežitím darcovských buniek. Hrubá patológia bola tiež hodnotená v terminálnom koncovom bode a neboli zaznamenané žiadne zväčšené očné buľvy (indikujúce tvorbu nádoru) alebo iné abnormality.

Obrázok 1. Transplantované gmRPC vizualizované in vivo prostredníctvom fotografie fundu cez chirurgický mikroskop (všetky=ľavé oko, OS). (A, B), simulovane liečené zvieratá (sham/sham, S/S); (C, D), kontrolné zvieratá s falošne ošetreným pravým okom, po ktorom nasledovalo ľavé oko ošetrené gmRPC (sham/bunka, S/C) a zvieratá s oboma očami ošetrené postupne s gmRPC (bunka/bunka, C/C) boli pozorované a zobrazené cez chirurgický mikroskop. Horný panel (A, C, E) ukazuje obrázky OS urobené v deň 14 po druhej injekcii; spodný panel (B, D, F) ukazuje obrázky OS urobené v deň 28 po druhej injekcii. Aloštepy boli pozorované ako bledo sfarbené bunkové zhluky (šípky) viditeľné v sklovci ľavých očí (S/C, C/C) v oboch časových bodoch (deň 14: (C, D); a deň 28: ( E, F)). Okrem štepov nebol pozorovaný žiadny zjavný zápal alebo ďalšia abnormalita v prednom a zadnom segmente, ako je axiálne videné týmto spôsobom.

2.2. Imunofluorescenčné značenie ukázalo imunitné bunky v sklovci

Imunofluorescenčné značenie pre päť hlavných typov imunitných buniek (makrofágy, neutrofily, prirodzené zabíjačské bunky, T bunky a B bunky) sa uskutočnilo na očných kryosekciách a odhalilo pozitívnu infiltráciu imunitných buniek v oku po injekcii gmRPC (obrázok 2A–F). T bunky (CD3), B bunky (CD45R), neutrofily (Ly-6G) a prirodzené zabíjačské bunky (CD49b) vykazovali obmedzenú prítomnosť v očiach s injekciou gmRPC, zatiaľ čo aktivované makrofágy (Iba{5}} ) boli hlavné imunitné bunky reagujúce na intravitreálne štepy. Porovnateľné tkanivo z neliečených a simulovane liečených zvierat nevykazovalo imunitné bunky v očných kryosekciách, čo naznačuje, že pozorovaná infiltrácia imunitných buniek bola odpoveďou na štepy gmRPC. V súlade s týmto pozorovaním boli imunitné bunky umiestnené v oblasti obklopujúcej štepy gmRPC alebo v samotných zhlukoch gmRPC.

Obrázok 2. Imunoznačenie infiltrovaných imunitných buniek podľa liečenej skupiny. Imunofluorescenčné snímky (A) kontrolných rezov (samotná sekundárna protilátka), (B) anti-Iba-1 (aktivovaný makrofág a mikrogliový marker), (C) anti-Ly{5}}G (neutrofilný marker), (D) anti-CD49b (marker prirodzených zabíjačských buniek), (E) protilátky anti-CD3 (marker T buniek) a (F) anti-CD45R (marker buniek B) sú zobrazené na obrázku. Prítomné obmedzené červené signály indikujú pozitívne značenie protilátky pre leukocytové markery, zelené signály indikujú štepy gmRPC a modré signály indikujú jadrové značenie DAPI. Žltá je nešpecifické prekrytie signálov, najzreteľnejšie vo vonkajších segmentoch fotoreceptora, ktoré vykazujú autofluorescenciu. Liečebné skupiny: neliečené (UT), obe oči neliečené; S/S, obe oči simulované (postupne) s vehikulom; S/C, do pravého oka s injekciou vehikula a následne do ľavého oka s 50,000 gmRPC a; C/C, do oboch očí sa injekčne podá 50000 gmRPC (postupne) podľa plánu v časti 4

Maximálne počty každej imunitnej bunky v oku sa líšili podľa typu bunky (obrázok 3A–E). Na rozdiel od toho dvojcestná ANOVA neodhalila žiadne rozdiely v infiltrácii imunitných buniek pri porovnaní zvierat, ktoré dostali jednotlivé injekcie gmRPC (sham/bunky) so zvieratami, ktoré dostali bilaterálne injekcie (bunky/bunky). To bol prípad infiltrácie makrofágov (farbenie anti-Iba-1) (obrázok 3A), neutrofilov (farbenie anti-Ly{6}}G) (obrázok 3B), prirodzených zabíjačských buniek (farbenie CD49b) ( Obrázok 3C), T bunky (farbenie CD3) (obrázok 3D) a B bunky (farbenie CD45R) (obrázok 3E).

2.3. ELISPOT neukázal reakcie vyvolania antigénu

ELISPOT je spôsob testovania aktivácie T-buniek produkujúcich IFN špecifický pre antigén. Liečba forbol 12-myristát 13-acetátom (PMA) bola pozitívnou kontrolou napodobňujúcou druhého posla, DAG, na aktiváciu dráhy receptora T buniek a následne na aktiváciu T buniek. Na obrázku 4A–D skupiny liečené PMA vykazovali oveľa vyšší počet škvŕn IFN v porovnaní s kontrolnými skupinami so samotnými odpovedajúcimi bunkami (tj lymfocyty z CLN, splenocyty zo sleziny). Keď boli bunky respondérov kultivované spoločne so splenocytmi C57BL/6 (B6 SPL), vzorky dňa 14 boli porovnateľné so skupinami samotných buniek respondérov, len s mierne vyšším počtom IFN bodov, čo naznačuje nedostatok aktivácie T buniek (obrázok 4A, B).

Obrázok 3. Kvantifikácia infiltrácie imunitných buniek po transplantácii gmRPC. Infiltrované imunitné bunky boli vizualizované ako červené fluorescenčné signály v zobrazovacom poli po injekcii gmRPC pre každý experimentálny stav, spočítané pomocou ImageJ a vynesené do stĺpcových grafov. Údaje z Iba-1 (marker aktivovaných makrofágov a mikroglií) (A), anti-Ly-6G (marker neutrofilov) (B), anti-CD49b (marker prirodzených zabíjačských buniek) (C), protilátky anti-CD3 (marker T buniek) (D) a anti CD45R (marker B buniek) (E) boli zobrazené na obrázku. Na testovanie významnosti medzi simulovanými/bunkovými skupinami a bunkami/bunkami boli použité dvojcestné testy ANOVA; hodnoty p boli: (A) p < {{10}},4492, (B) p < 0,9376, (C) p < 0,119{{18 }}, (D) p < 0,6411 a (E) p < 0,7201 (žiadne neboli významné).

Keď sa testovali alogénne darcovské bunky pomocou tohto testu, bunky odpovedajúce na zvieratá, ktorým boli intraperitoneálne injikované gmRPC (skupina IP), nemali reakcie vyvolané antigénom, pretože vzorky nevykazovali väčšiu aktiváciu T buniek počtom IFN škvŕn v porovnaní s falošnými zvieratami, ktoré nikdy neboli vystavené na gmRPC (sham/sham). Ani zvieratá, ktorým boli intravitreálne injikované gmRPC, či už raz (predstieraná/bunka) alebo opakovane (bunka/bunka), nevykazovali žiadnu odozvu vyvolanú antigénom. V jednom prípade sa reakcie na opakované dávkovanie gmRPC zdali tlmenejšie (obrázok 4B). Tieto výsledky spolu ukázali, že gmRPC vykazujú veľmi nízku antigenicitu. Všimnite si, že splenocyty C57BL/6 sa zhodovali s genetickým pozadím gmRPC. Alternatívne stimulačné bunky, gmRPC, neočakávane zvýšili počet škvŕn IFN vo všetkých experimentálnych skupinách v porovnaní s negatívnymi kontrolnými skupinami (obrázok 4A–D). Potenciálnym vysvetlením môžu byť gmRPC spôsobujúce vysoké pozadie v tomto teste. Dôležité je, že medzi neliečenými, simulovane liečenými skupinami s jednou injekciou gmRPC a skupinami s opakovanou injekciou gmRPC, čo opäť naznačovalo absenciu odozvy vyvolanej antigénom.

Obrázok 4. Kvantifikácia ELISPOT po transplantácii gmRPC. Testy ELISPOT boli nastavené ako nasledujúce skupiny: kontrola, samotné odpovedajúce bunky (lymfocyty alebo splenocyty obsahujúce T bunky izolované z cervikálnych lymfatických uzlín (CLN) alebo slezín (SPL) experimentálnych zvierat; PMA, odpovedajúce bunky ošetrené forbolom {{1} }myristát 13-acetát (PMA) a Ca ionofór; B6 SPL, bunky respondérov zmiešané so splenocytmi izolovanými zo zvierat C57BL/6; gmRPC, rovnaké bunky respondéra zmiešané s gmRPC. (A), Bunky respondéra boli splenocyty z experimentálnych zvierat, ktoré boli usmrtené v deň 14 po druhej injekcii gmRPCs. (B) Reagujúce bunky boli lymfocyty z CLN experimentálnych zvierat, ktoré boli usmrtené v deň 14 po druhej injekcii gmRPCs. (C) Reagujúce bunky boli splenocyty z experimentálnych zvierat, ktoré boli usmrtené v deň 29 po druhej injekcii gmRPCs.(D) Reagujúce bunky boli lymfocyty z CLN experimentálnych zvierat, ktoré boli usmrtené v deň 29 po druhej injekcii gmRPCs. Na testovanie významnosti (*) medzi simulovanými/bunkovými skupinami a bunkami/bunkami boli použité dvojcestné testy ANOVA; hodnoty p boli: (A) p < 0,5332, (B) p < 0.0001 (významné), (C) p < 0,0207 ( významné) a (D) p < 0,3355.

3. Diskusia 

Existuje značný záujem o technológiu kmeňových buniek ako prostriedok na liečbu degeneratívnych ochorení sietnice a naša skupina skúmala použitie alogénnych hRPC v RP. Aby sme zhromaždili údaje týkajúce sa potenciálnych imunitných dôsledkov, keď sa intravitreálnou injekciou podáva viac ako jedna dávka alogénneho ľudského RPC produktu, uskutočnili sme súčasnú štúdiu na zvieratách s použitím gmRPC z pozadia C57BL/6 ako štepov a myší BALB/c ako hostiteľov. Tieto rôznorodé genetické pozadie sa použili na modelovanie sekvenčnej liečby alogénnymi hRPC a poskytli predbežné bezpečnostné údaje pred testovaním na ľuďoch.

Na úplné vyhodnotenie odpovedí hostiteľské zvieratá nedostali žiadnu imunosupresívnu liečbu. Porovnali sme imunitné reakcie generované jednou injekciou gmRPC so sekvenčným bilaterálnym dávkovaním podľa opísaného injekčného plánu. Oftalmologické vyšetrenia neodhalili zápal ani žiadne iné významné rozdiely medzi skupinami zvierat, ktoré dostali 1 dávku gmRPC alebo 2 dávky gmRPC, čo naznačuje, že buď príjemcovia neboli senzibilizovaní počiatočnými ošetreniami gmRPC, alebo bola senzibilizácia jemná. Výsledky imunoznačenia odhalili, že všetkých päť skúmaných typov imunitných buniek, a to T bunky (CD3), B bunky (CD45R), makrofágy (Iba-1), neutrofily (Ly{5}}G) a prirodzené zabíjačské bunky ( CD49b), infiltroval do oka a zacielil štepy RPC po transplantácii. Napriek tomu bola táto infiltrácia relatívne mierna a hoci boli detegovateľné iné typy buniek, pozostávala prevažne z Iba-1 pozitívnych makrofágov. Bol prítomný veľmi obmedzený počet T buniek, B buniek, neutrofilov a prirodzených zabíjačských buniek. Je zaujímavé, že prežitie demonštrované jednotlivými a opakovanými RPC štepmi bolo ekvivalentné, bez straty štepov v oboch prípadoch, napriek prítomnosti makrofágov. Celkovo to naznačuje, že vrodené aj adaptívne imunitné reakcie na geneticky odlišné RPC boli mierne, aj keď sa nepoužila imunitná supresia. Okrem toho výsledky testu ELISPOT nepreukázali žiadne reakcie na vyvolanie antigénu v skupinách liečených gmRPC, čo je v súlade s tvrdením, že T bunky nehrajú dôležitú úlohu pri odmietnutí gmRPC štepov z myší C57BL/6. Opäť bola pozorovaná infiltrácia gmRPC štepov makrofágmi, aj keď to nebolo spojené s významnou deštrukciou štepu typu spojeného s klasickou imunitnou rejekciou [22–24].

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

Spoločne tieto pozorovania odhaľujú situáciu, ktorá sa jasne odlišuje od všeobecne uznávaných mechanizmov odmietnutia alogénneho transplantátu sprostredkovaného T a B bunkami pozorovanými v iných tkanivách. K tejto situácii môže prispieť viacero faktorov. Na jednej strane je tu predstava oka ako miesta „privilegovaného imunity“, aj keď rozsah, v akom sklovec zdieľa takéto vlastnosti s rohovkou a sietnicou, je menej preštudovaný a možno viac sporný. Na druhej strane sa zdá, že samotné RPC vykazujú zníženú imunogenicitu ako aloštepy v porovnaní s častejšie študovanými bunkovými typmi. Ako sme už predtým ukázali, myším RPC chýba základná expresia antigénov MHC triedy I a triedy II, hoci tieto sú indukovateľné stimuláciou cytokínov. Táto absencia expresie MHC môže prispieť k prežitiu týchto buniek po transplantácii. Prítomnosť imunitných buniek v štepoch však podporuje myšlienku, že tolerancia štepu v tomto prostredí nie je pasívna a je výsledkom aktívneho imunoregulačného fenoménu. Tu je potrebné zdôrazniť, že rovnaký druh infiltrácie imunitných buniek už bol prítomný po jednotlivých injekciách a nezhoršil sa opakovaným dávkovaním, čím sa zdôrazňuje náš záver, že infiltrácia štepov imunitnými bunkami, najmä makrofágmi, nebola výsledkom predchádzajúcich senzibilizácia hostiteľa. V rámci parametrov tohto experimentu sa nezdá, že by opakované dávkovanie znížilo celkovú životaschopnosť štepu, čo bolo v súlade s možnosťou trvalej účinnosti v terapeutických kontextoch. Alternatívne parametre, ako sú rôzne intervaly medzi injekciami, môžu buď zvýšiť alebo znížiť aktivitu imunitných buniek v rozsahu, ktorý by bol relevantný pre klinickú aplikáciu. Nie je jasné, či by sa bunkové zložky infiltrátov, vrátane prevahy makrofágov, vzťahovali aj na ľudí. Okrem toho prežitie týchto aloimplantátov nemusí závisieť od normálnej sietnice so zdravou bariérou medzi krvou a sietnicou. Príjemcovia BALB/c, ktorí sa tu používajú, sú albíni a sú náchylní na poškodenie svetlom [30]. Navyše, trvalé prežitie bolo opakovane pozorované v predchádzajúcej práci s rôznymi modelmi degenerácie sietnice (napr. [31]).

V porovnaní s prežitím štepov predstavuje životaschopnosť buniek v štepoch zložitejšiu situáciu. Je známa strata progenitorových buniek CNS, ku ktorej dochádza rýchlo po transplantácii, pravdepodobne v dôsledku viacerých faktorov, vrátane náhleho vysadenia rastového faktora. Po usadení sa v oku sa disociované bunky zlúčia do guľovitých agregátov, ktorých centrá sa zdajú poskytovať suboptimálne mikroprostredie pre rast, možno v dôsledku nedostatku vaskularizácie a problémov s difúziou živín. Zjavný tropizmus makrofágov pre štepy RPC by mohol byť nešpecifickou odpoveďou na prítomnosť týchto neživotaschopných buniek vo vnútri štepov, pričom makrofágy fungujú vo svojej úlohe zachytávačov bunkového odpadu. Alternatívne môžu plne životaschopné RPC aktívne priťahovať makrofágy, napr. prostredníctvom expresie chemo-atraktívnych cytokínov, pričom hostiteľské bunky by sa sekundárne stretli s úlomkami z neživotaschopných darcovských buniek. Dôležité je, že stupeň infiltrácie makrofágmi pozorovaný v týchto konkrétnych nastaveniach sa nezdá, že by mal negatívne dôsledky pre štep alebo sietnicu hostiteľa, na rozdiel od odpovedí na bunkové aloštepy v neimunitných privilegovaných miestach [4]. Nakoniec stojí za zmienku, že tu uvedené výsledky, aj keď sú obmedzené na myšací model, môžu mať dôsledky pre prácu u ľudí. Na rozdiel od myši vieme, že kultivované ľudské RPC exprimujú silné hladiny antigénov MHC triedy I na začiatku; preto je porovnanie nepochybne predbežné. Napriek tomu je zaujímavé poznamenať, že klinické testovanie subretinálnych hRPC štepov skupinou v Číne [13], ako aj intravitreálna transplantácia hRPC našou skupinou následne ukázali trvalé prežitie aloštepov u neimunosupresívnych pacientov s RP (JC -01, [32], nepublikované údaje). Bolo tomu tak aj po sekvenčnej injekcii oboch očí (rozšírenie JC{10}}, nepublikované údaje), analogicky k práci, ktorá je tu prezentovaná. Okrem toho sa prežitie štepu pozorovalo v následnej štúdii na JC-02 [33], v ktorej sa do toho istého oka podávali sekvenčné opakované dávky [34]. Celkovo tieto zistenia naznačujú, že imunitná supresia nie je vždy potrebná pri transplantácii nervových progenitorov, najmä do oka, hoci limity tohto javu a základné regulačné mechanizmy ešte treba objasniť.

4. Materiály a metódy

4.1. Bunková kultúra

Predtým charakterizované gmRPC [31] boli vybrané ako darcovské bunky pre túto alogénnu štúdiu. Pôvodne boli gmRPC izolované z GFP-transgénnych myší C57BL/6 geneticky modifikovaných tak, aby exprimovali zosilnený zelený fluorescenčný proteín (GFP). Expresia GFP proteínu v gmRPC bola zaujímavá v tom, že umožňuje vizualizáciu štepov po injekcii bez potreby ďalšieho značenia. Pre súčasnú štúdiu boli gmRPC kultivované v Advanced DMEM/F12 doplnenom o doplnok N-2 (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, USA), Glutamax-1 (1:100, Life Technology , Carlsbad, CA, USA) a EGF (20 ng/ml, rekombinantný, ľudský, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) a inkubované pri 37 ◦C a 5 % CO2. Bunky sa udržiavali v zmiešaných suspenziách/voľne pripojených kolóniách v nepotiahnutých fľašiach na tkanivové kultúry. Bunky boli pasážované trypsinizáciou s TrypLE Select CTS (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) zriedené 1:5 v PBS počas jednej minúty a neutralizované 10-násobkom objemu pridaného trypsínu. Zmes buniek a trypsínu sa centrifugovala pri 140 g počas 2 minút pri teplote miestnosti, supernatant sa odstránil a bunková peleta sa resuspendovala v čerstvom médiu pred nasadením do fliaš na tkanivové kultúry v požadovanej koncentrácii. Koncentrácia buniek a životaschopnosť boli stanovené farbením trypánovou modrou; počítanie sa uskutočnilo pomocou Countess (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) a hemocytometra.

Pre intravitreálne injekcie bola bunková peleta resuspendovaná na 50 000 buniek/ul v BSS PLUS®. Koncentrácia a životaschopnosť buniek sa hodnotili pred a po injekciách. Injikovaná dávka bola 50 000 buniek na oko na injekciu. Dávka a vehikulum boli vybrané na základe našich predchádzajúcich štúdií.

4.2. Experimentálne zvieratá

Účelom súčasnej štúdie bolo preskúmať potenciálne alogénne imunitné reakcie indukované opakovanou intravitreálnou injekciou alogénnych RPC. Príjemcami boli myši BALB/c, ktoré sa geneticky líšia od myší C57BL/6, z ktorých boli izolované gmRPC. Použitie aspoň troch zvierat na liečenú experimentálnu skupinu pre každý časový bod sa považovalo za potrebné, aby sa umožnilo vyhodnotenie štatistickej významnosti medzi skupinami vzhľadom na výsledné premenné a potenciálne straty zvierat počas experimentálneho obdobia. Okrem toho, vzhľadom na mnohé ďalšie faktory potenciálne ovplyvňujúce výsledok experimentu, ako je neúspešný postup injekcie buniek alebo potenciálne opotrebovanie v dôsledku boja zvierat, sa injekčné postupy vykonali na piatich zvieratách na skupinu, aby sa ďalej zabezpečilo splnenie minimálnych počtov požadovaných na štatistickú analýzu.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Tabuľka 1 ukazuje štyri skupiny zvierat pripravené pre každý zo štyroch časových bodov (4, 7, 14 a 28 dní), v ktorých by sa vykonalo vyhodnotenie histopatológie, vrátane imunofluorescencie. Dve ďalšie skupiny zvierat, ktorým sa intraperitoneálne injikovalo 10ˆ6 gmRPC, boli pripravené ako pozitívne kontroly pre každý z dvoch časových bodov hodnotenia ELISPOT (14 a 28 dní). Tabuľka 2 sumarizuje hodnotenia naplánované pre každú skupinu.

Tabuľka 1. Experimentálne skupiny.

Tabuľka 2. Časové body hodnotenia.

4.3. Intravitreálna injekcia

GmRPC sa podávali intravitreálnou injekciou. Po anestetizácii sa do oboch očí zvieraťa, ktoré má byť injikované, aplikovali Mydriacyl (1 % očný roztok tropikamidu) a fenylefrín (2,5 % očný roztok). Keď sa dosiahla primeraná mydriáza, zviera sa ručne zadržalo a hlava zvieraťa sa otočila tak, aby sa zarovnala očná os oka, ktorá sa má podať injekciou, s optikou chirurgického mikroskopu, aby sa zviditeľnil zadný očný segment (tj sklovec a sietnica). . Oko bolo jemne navrhnuté manuálne tlakom na očné viečka a ihla 31G na inzulínovej striekačke bola použitá na jemné prepichnutie skléry priľahlej k limbu v dolnom nazálnom kvadrante. Leštený sklenený hrot mikropipety obsahujúci darcovské bunky (alebo kontrolné vehikulum) sa posunul cez rez do sklovcovej dutiny za priamej vizualizácie. Dbalo sa, aby sa nenarušila integrita šošovky alebo štruktúr zadného segmentu. Samotné bunky alebo vehikulá boli injikované v objeme 1 mikroliter. Po niekoľkých chvíľach pauzy, aby sa umožnila rovnováha vnútroočného tlaku, sa špička pipety postupne odstránila z oka, všetko pod priamou vizualizáciou. Zaznamenalo sa akékoľvek vnútroočné krvácanie spolu s lokalizáciou. Po injekcii sa zviera umiestnilo do čistej klietky vystlanej čerstvou jednorazovou vložkou orientovanou absorpčnou stranou nahor/plastovou stranou nadol, aby sa zotavilo. Zotavenie sa uľahčilo použitím vyhrievacej podložky a overilo sa schopnosťou zvieraťa chodiť. Po prebudení bolo zviera prenesené do pooperačnej klietky s ad libitným prístupom k vode. Zvieratá boli denne po operácii vizuálne monitorované. Boli pozorované minimálne alebo žiadne príznaky súvisiace s vnútroočnou injekciou.

Po zákroku boli zvieratá pozorované na trenie operovaného oka, naježenú srsť alebo trvalú letargiu, čo všetko bolo dôvodom na okamžitú eutanáziu. Dve zvieratá boli utratené v dôsledku zranení utrpených v boji. Všetky ostatné zvieratá boli ukončené v plánovaných koncových bodoch. Eutanázia bola vykonaná inhaláciou CO2.

4.4. Oftalmologické vyšetrenie

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) a odozva na svetelnú stimuláciu. Ako kompenzácia za stratu žmurkania bol topicky aplikovaný roztok hypromelózy (Gonak) podľa potreby do oboch očí, aby sa zabránilo vysychaniu rohovky. Pre zobrazovací postup sa anestetizované zvieratá umiestnili na vyhrievaciu podložku a umiestnili sa do polohy hrudnej kosti. Na záver postupu sa dosiahlo čiastočné zvrátenie anestézie podaním atipamezolu (0,1–1 mg/kg) intraperitoneálnou injekciou.

4.5. Histopatológia

Imunitné reakcie u zvierat, ktoré dostali dva sekvenčné štepy (jeden do každého oka) sa hodnotili histopatológiou oboch očí v deň 4, deň 7, deň 14 a deň 28 ± 1 po injekcii do druhého oka. Myši, ktoré boli liečené podľa tabuľky 1, boli usmrtené na základe schémy uvedenej v tabuľke 2. Zvieratá boli usmrtené pomocou inhalácie oxidu uhličitého. Srdcové perfúzie sa uskutočňovali na experimentálnych zvieratách s 2% paraformaldehydom (PFA) vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS). Potom sa zozbierali všetky očné buľvy a nechali sa namočiť v 2% PFA/PBS počas 48 hodín pri 4 °C. Fixované očné buľvy boli spracované cez sacharózový gradient (10 % sacharóza v PBS počas 1 hodiny pri teplote miestnosti, 20 % sacharóza v PBS počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a 30 % sacharóza v PBS pri teplote 4 °C cez noc) predtým, ako boli vložené do OCT médium na kryosekciu. Kryorezy (10 um) očí sa zafarbili Harrisonovým hematoxylínom a eozínom (H&E), aby sa vizualizovala mikroanatómia sietnice a lokalizovali sa injikované darcovské bunky.

Pre skupiny liečené gmRPC boli kryorezy hodnotené pomocou imunofluorescencie pre GFP+ (darcovské) bunky. Identifikácia špecifických typov imunitných buniek prítomných v očiach sa uskutočnila prostredníctvom značenia špecifickými primárnymi protilátkami pre nasledovné: CD3 (marker T lymfocytov) [35], CD45R (marker B lymfocytov) [36], Iba-1 (marker aktivovaných makrofágov a mikroglií) [37], Ly-6G (marker neutrofilov) [38] a CD49b (marker prirodzených zabíjačských buniek) [39]. Kryorezy boli trikrát premyté v PBS pri izbovej teplote a blokované 0,03 % Triton X-100 a 10 % normálnym kozím sérom v PBS (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA). 1 h pri izbovej teplote. Potkanie anti-myšie CD3 (riedenie 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), potkanie anti-myšie CD45R (1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), králičie anti-myšie Iba{{ 26}} (riedenie 1:400, Wako Chemicals, Richmond, VA, USA), potkaní antimyší Ly-6G (riedenie 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) a potkaní antimyší -myší CD49b (riedenie 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) boli aplikované na vzorky a inkubované cez noc pri 4 stupňoch. Vzorky sa opäť trikrát premyli v PBS pri teplote miestnosti. Sekundárne protilátky konjugované s Alexa-Fluor (kozia anti-potkania Alexa-Flour-568 a kozia anti-králičia Alexa-Flour-568, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) sa aplikovali na vzorky počas 1 hodiny pri izbovej teplote. Všetky vzorky sa potom premyli v PBS ešte trikrát pri teplote miestnosti. Krycie sklíčka boli pripevnené pomocou DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) a sklíčka boli ponechané sušiť cez noc pri teplote miestnosti.

4.6. ELISPOT a MLR testy

RPC-špecifické pamäťové T bunky sa monitorovali 2 a 4 týždne po umiestnení prvého štepu pomocou testu ELISPOT (enzyme-linked immunosorbent spot). Experimentálne skupiny boli zostavené tak, ako je uvedené v tabuľkách 1 a 2 pre každý časový bod. Test ELISPOT zachytáva vylučované proteíny na mikrodoštičke potiahnutej špecifickou protilátkou a môže sa použiť na určenie aktivácie pamäťových T buniek detekciou sekrécie IFN T buniek. Experimentálny údaj je počet IFN škvŕn na mikroplatni. Počet prítomných IFN bodov indikuje počet aktivovaných T buniek. Frekvencia aloreaktívnych T buniek bola hodnotená vykonaním 48-hodinovej zmiešanej leukocytovej reakcie (MLR) na 96-jamkových Multiscreen-IP platniach (Millipore, Burlington, MA, USA). Reagujúce bunky boli lymfocyty/splenocyty obsahujúce T bunky purifikované z cervikálnych lymfatických uzlín (CLN) a slezín experimentálnych zvierat a stimulačné bunky boli gmRPC pôvodne odvodené od myší C57BL/6. Testy ELISPOT sa uskutočňovali na základe štandardného protokolu. 96-jamkové Multiscreen-IP doštičky sa vopred navlhčili 15 ul 35 % etanolu na jamku za sterilných podmienok. Doštičky sa trikrát premyli sterilným PBS a potom sa na platne nanieslo 100 ul IFN záchytnej protilátky (klon AN-18, eBioscience, San Diego, CA, USA) zriedenej v PBS (2 ug/ml). Platne sa inkubovali cez noc pri 4 stupňoch predtým, ako sa na platniach vykonali testy MLR. Doštičky potiahnuté zachytávacou protilátkou boli trikrát premyté PBS a potom blokované RPMI1640 počas 2 hodín pri 37 °C.

Každá z testovacích doštičiek obsahovala nasledujúce kontroly: jamky neobsahujúce žiadne bunky, jamky obsahujúce bunky bez stimulácie a jamky obsahujúce bunky ošetrené forbol {{0}}myristát 13-acetátom (PMA) a Ca ionofór ako pozitívne kontroly. Ošetrenie PMA slúži ako pozitívna kontrola napodobňovaním druhého posla, DAG, na aktiváciu dráhy receptora T buniek a následne spôsobuje aktiváciu T buniek, pričom Ca ionofór uľahčuje vstup vápenatých iónov do buniek. Doštičky sa pred farebnou reakciou inkubovali 36 hodín pri 37 °C. Platne boli premyté PBS obsahujúcim {{10}}.{22}}1 % Tween 20 šesťkrát a potom 100 ul detekčnej protilátky (klon R64A2, eBioscience, San Diego, CA, USA), zriedenej v PBS (0,5 ug/ml) sa aplikovalo do každej jamky. Doštičky sa inkubovali pri 37 °C ďalšie 2 hodiny. Doštičky sa opäť premyli 0,01 % Tween 20 v PBS. Aplikovalo sa 100 ul Streptavidínu-AP (riedenie 1:1000, Invitrogen) na jamku a platne sa inkubovali 45 minút pri teplote miestnosti. Všetky doštičky sa znova trikrát premyli 0,01 % Tween 20 v PBS a samotný PBS ešte trikrát. Nakoniec sa do každej jamky pridalo 100 ul BCIP/NBT (Sigma Aldrich, Mníchov, Nemecko) na zafarbenie. Všetky platne boli dôkladne premyté vodou z vodovodu a vysušené pred analýzou údajov.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

5. Závery

Táto štúdia ukazuje, že sekvenčné binokulárne štepy alogénnych RPC do sklovcovej dutiny nevyvolávajú klasické imunitné odmietnutie u myši. Hoci sa uznáva, že tieto alogénne histologické štúdie nebolo možné vykonať s ľudským klinickým produktom RPC, údaje sa zdajú byť v súlade s výsledkami klinickej štúdie bezpečnosti (jCyte, JC{0}}E, nepublikované údaje), v ktorej pacienti s retinitídou pigmentosa dostávali nesúčasné bilaterálne injekcie bez imunosupresívnej liečby. Aj keď je ťažké priamo porovnať tieto dve štúdie, je pozoruhodné, že celkové výsledky oboch preukázali podobnosť z hľadiska prežitia aloštepu.

Referencie

1. Hori, J.; Ng, TF; Shatos, M.; Klassen, H.; Streilein, JW; Mladým MJ nervovým progenitorovým bunkám chýba imunogenicita a odolávajú deštrukcii ako aloštepy. Kmeňové bunky 2003, 21, 405–416. [CrossRef] [PubMed]

2. Klassen, H.; Schwartz, PH; Ziaeian, B.; Nethercott, H.; Young, MJ; Bragadottir, R.; Tullis, GE; Warfvinge, K.; Narfstrom, K. Nervové prekurzory izolované z vyvíjajúceho sa mozgu mačky vykazujú integráciu sietnice po transplantácii do sietnice dystrofickej mačky. Vet. Oftalmol. 2007, 10, 245–253. [CrossRef] [PubMed]

3. Salado-Manzano, C.; Perpina, U.; Straccia, M.; Molina-Ruiz, FJ; Cozzi, E.; Rosser, AE; Canals, JM Je imunologická odpoveď prekážkou bunkovej terapie pri neurodegeneratívnych ochoreniach? Predné. Cell Neurosci. 2020, 14, 250. [CrossRef]

4. Petrus-Reurer, S.; Romano, M.; Howlett, S.; Jones, JL; Lombardi, G.; Saeb-Parsy, K. Imunologické úvahy a výzvy pre regeneračné bunkové terapie. komun. Biol. 2021, 4, 798. [CrossRef]

5. Bucher, K.; Rodriguez-Bocanegra, E.; Dauletbekov, D.; Fischer, MD Imunitné reakcie na retinálnu génovú terapiu s použitím bez pridružených vírusových vektorov - Dôsledky pre úspech a bezpečnosť liečby. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 83, 100915. [CrossRef]

6. Singh, MS; Park, SS; Albini, TA; Canto-Soler, MV; Klassen, H.; MacLaren, RE; Takahashi, M.; Nagiel, A.; Schwartz, SD; Bharti, K. Transplantácia retinálnych kmeňových buniek: Vyváženie bezpečnosti a potenciálu. Prog. Retin. Eye Res. 2020, 75, 100779. [CrossRef]

7. Kamao, H.; Mandai, M.; Okamoto, S.; Sakai, N.; Suga, A.; Sugita, S.; Kiryu, J.; Takahashi, M. Charakterizácia bunkových listov sietnicového pigmentového epitelu odvodených z pluripotentných kmeňových buniek s cieľom klinickej aplikácie. Rep. kmeňových buniek 2014, 2, 205–218. [CrossRef]

8. Sugita, S.; Kamao, H.; Iwasaki, Y.; Okamoto, S.; Hashiguchi, T.; Iseki, K.; Hayashi, N.; Mandai, M.; Takahashi, M. Inhibícia aktivácie T-buniek retinálnymi pigmentovými epitelovými bunkami odvodenými z indukovaných pluripotentných kmeňových buniek. Vyšetrovať. Oftalmol. Vis. Sci. 2015, 56, 1051–1062. [CrossRef]

9. McGill, TJ; Stoddard, J.; Renner, LM; Messaoudi, I.; Bharti, K.; Mitalipov, S.; Lauer, A.; Wilson, DJ; Neuringer, M. Alogénne zlyhanie štepu buniek RPE odvodené od iPSC po transplantácii do subretinálneho priestoru u primátov (okrem človeka). Vyšetrovať. Oftalmol. Vis. Sci. 2018, 59, 1374–1383. [CrossRef]

10. Sugita, S.; Mandai, M.; Kamao, H.; Takahashi, M. Imunologické aspekty transplantácie buniek RPE. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 84, 100950. [CrossRef]

11. Nair, DSR; Thomas, BB Stratégie liečby degeneratívnych ochorení sietnice založené na kmeňových bunkách. Curr. Stem Cell Res. Ther. 2022, 17, 214–225. [CrossRef] [PubMed]

12. Martinez Velazquez, LA; Ballios, BG Nová generácia molekulárnej a bunkovej terapie pre dedičné ochorenie sietnice. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11542. [CrossRef]

13. Liu, Y.; Chen, SJ; Li, SY; Qu, LH; Meng, XH; Wang, Y.; Xu, HW; Liang, ZQ; Yin, ZQ Dlhodobá bezpečnosť transplantácie ľudských retinálnych progenitorových buniek u pacientov s retinitis pigmentosa. Stem Cell Res. Ther. 2017, 8, 209. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Y.; Tang, Z.; Gu, P. Transplantácia kmeňových/progenitorových buniek pre degeneráciu sietnice: Prehľad klinických štúdií. Cell Death Dis. 2020, 11, 793. [CrossRef] [PubMed]

15. nemčina, OL; Vallese-Maurizi, H.; Soto, TB; Rotstein, NP; Politi, LE Retina kmeňové bunky, nádeje a prekážky. World J. Stem Cells 2021, 13, 1446–1479. [CrossRef]

16. Karamali, F.; Behtaj, S.; Babaei-Abraki, S.; Hadady, H.; Atefi, A.; Savoj, Š.; Soroushzadeh, S.; Najafian, S.; Nasr Esfahani, MH; Klassen, H. Potenciálne terapeutické stratégie pre degeneráciu fotoreceptorov: Cesta k obnove zraku. J. Transl. Med. 2022, 20, 572. [CrossRef]

17. Semo, M.; Haamedi, N.; Stevanato, L.; Carter, D.; Brooke, G.; Young, M.; Coffey, P.; Sinden, J.; Patel, S.; Vugler, A. Účinnosť a bezpečnosť ľudských progenitorových buniek sietnice. Prekl. Vis. Sci. Technol. 2016, 5, 6. [CrossRef]

18. Mochizuki, M.; Sugita, S.; Kamoi, K. Imunologická homeostáza oka. Prog. Retin. Eye Res. 2013, 33, 10–27. [CrossRef]

19. Yamasaki, S.; Sugita, S.; Horiuchi, M.; Masuda, T.; Fujii, S.; Makabe, K.; Kawasaki, A.; Hayashi, T.; Kuwahara, A.; Kishino, A.; a kol. Nízka imunogenita a imunosupresívne vlastnosti ľudských sietníc odvodených od ESC a iPSC. Rep. kmeňových buniek 2021, 16, 851 – 867. [CrossRef]

20. Klassen, H.; Schwartz, MR; Bailey, AH; Young, MJ povrchové markery exprimované multipotentnými ľudskými a myšacími nervovými progenitorovými bunkami zahŕňajú tetraspaníny a neproteínové epitopy. Neurosci. Lett. 2001, 312, 180–182. [CrossRef]

21. Klassen, H.; Ziaeian, B.; Kirov, II; Young, MJ; Schwartz, PH Izolácia progenitorových buniek sietnice z post-mortem ľudského tkaniva a porovnanie s autológnymi progenitormi mozgu. J. Neurosci. Res. 2004, 77, 334-343. [CrossRef]

22. Ingulli, E. Mechanizmus bunkovej rejekcie pri transplantácii. Pediatr. Nephrol. 2010, 25, 61–74. [CrossRef]

23. Issa, F.; Schiopu, A.; Wood, KJ Úloha T buniek pri odmietnutí štepu a tolerancii transplantácie. Expert Rev. Clin. Immunol. 2010, 6, 155–169. [CrossRef] [PubMed]

24. Nasr, M.; Sigdel, T.; Sarwal, M. Pokroky v diagnostike rejekcie transplantátu. Expert Rev. Mol. Diag. 2016, 16, 1121–1132. [CrossRef] [PubMed]

25. Klassen, H.; Imfeld, KL; Ray, J.; Young, MJ; Gage, FH; Berman, MA Imunologické vlastnosti dospelých hipokampálnych progenitorových buniek. Vis. Res. 2003, 43, 947-956. [CrossRef] [PubMed]

26. Weinger, JG; Weist, BM; Plátované, WC; Klaus, SM; Walsh, CM; Dráha, nesúlad TE MHC vedie k odmietnutiu nervových progenitorových buniek po transplantácii miechy v modeli vírusom indukovanej demyelinizácie. Kmeňové bunky 2012, 30, 2584–2595. [CrossRef] [PubMed]

27. ReNeuron, L. First-in-Human Phase I/IIa, Open-Label, Prospektívna štúdia bezpečnosti a znášanlivosti subretinálne transplantovaných ľudských retinálnych progenitorových buniek (hRPC) u pacientov s retinitis Pigmentosa (RP). Klinická skúška č. NCT02464436. Dostupné na internete: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02464436 (prístup 27. februára 2023).

28. Lu, B.; Lin, Y.; Tsai, Y.; Girman, S.; Adamus, G.; Jones, MK; Shelley, B.; Svendsen, CN; Wang, S. Následná transplantácia ľudského nervového progenitora do degenerovanej sietnice neohrozuje počiatočné prežitie štepu ani terapeutickú účinnosť. Prekl. Vis. Sci. Technol. 2015, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

29. Jones, MK; Lu, B.; Girman, S.; Wang, S. Bunkové terapeutické stratégie na nahradenie a zachovanie pri degeneratívnych ochoreniach sietnice. Prog. Retin. Eye Res. 2017, 58, 1–27. [CrossRef] [PubMed]

30. Bell, BA; Kaul, C.; Bonilha, VL; Rayborn, ME; Shadrach, K.; Hollyfield, JG Myš BALB/c: Vplyv štandardného osvetlenia vivária na patológiu sietnice počas starnutia. Exp. Eye Res. 2015, 135, 192–205. [CrossRef]

31. Klassen, HJ; Ng, TF; Kurimoto, Y.; Kirov, I.; Shatos, M.; Coffey, P.; Young, MJ Multipotentné retinálne progenitory exprimujú vývojové markery, diferencujú sa na retinálne neuróny a zachovávajú svetlom sprostredkované správanie. Vyšetrovať. Oftalmol. Vis. Sci. 2004, 45, 4167-4173. [CrossRef]

32. jCyte, Inc. Bezpečnosť jedinej intravitreálnej injekcie ľudských retinálnych progenitorových buniek (jCell) pri retinitis Pigmentosa. Klinická skúška č. NCT02320812. Dostupné na internete: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02320812 (prístup 24. februára 2023).

33. jCyte, Inc. Bezpečnosť a účinnosť intravitreálnej injekcie ľudských retinálnych progenitorových buniek u dospelých s retinitis Pigmentosa. Klinická skúška č. NCT03073733. Dostupné na internete: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03073733 (prístup 24. februára 2023).

34. jCyte, Inc. Bezpečnosť opakovanej intravitreálnej injekcie ľudských retinálnych progenitorových buniek (bunky) u dospelých jedincov s retinitis Pigmentosa. Klinická skúška č. NCT04604899. Dostupné na internete: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04604899 (prístup 24. februára 2023).

35. Oudejans, JJ; van der Valk, P. Imunohistochemická klasifikácia novotvarov T buniek a NK buniek. J. Clin. Pathol. 2002, 55, 892. [CrossRef] [PubMed]

36. Tostanoski, LH; Chiu, YC; Gammon, JM; Simon, T.; Andorko, JI; Bromberg, JS; Jewell, CM Preprogramovanie mikroprostredia lokálnej lymfatickej uzliny podporuje toleranciu, ktorá je systémová a špecifická pre antigén. Cell Rep. 2016, 16, 2940–2952. [CrossRef] [PubMed]

37. Jurga, AM; Paleczna, M.; Kuter, KZ Prehľad všeobecných a diskriminačných markerov fenotypov diferenciálnych mikroglií. Predné. Cell Neurosci. 2020, 14, 198. [CrossRef] [PubMed]

38. Li, JC; Zou, XM; Yang, SF; Jin, JQ; Zhu, L.; Li, CJ; Yang, H.; Zhang, AG; Zhao, TQ; Chen, CY Neutrofilné extracelulárne pasce sa podieľajú na rozvoji trombózy súvisiacej s rakovinou u pacientov s rakovinou žalúdka. World J. Gastroenterol. 2022, 28, 3132–3149. [CrossRef]

39. Kee, BL Development of Natural Killer Cells a ILC1. Encykl. Immunobiol. 2016, 1, 140–148.