Ko-imunoterapia na báze lipozómov s agonistom TLR a CD47-blokádou kontrolného bodu SIRP na účinnú liečbu rakoviny hrubého čreva

Abstrakt:

Protinádorová imunita je základnou zložkou liečby rakoviny a je primárne sprostredkovaná vrodenou imunitnou odpoveďou, ktorá hrá rozhodujúcu úlohu pri iniciovaní a formovaní adaptívnej imunitnej odpovede. Nové dôkazy identifikovali vrodené imunitné kontrolné body a receptory na rozpoznávanie vzorov, ako je CD47 a Toll-like receptor 7 (TLR7), ako sľubné terapeutické ciele pre liečbu rakoviny. Na základe fúzneho proteínu Fc-CV1, ktorý obsahuje vysokoafinitný variant SIRP (CV1) a Fc fragment ľudskej protilátky IgG1, sme využili prípravok, ktorý spájal Fc-CV1 s lipozómami naplnenými imikvimodom (agonista TLR7) ( CILP) aktívne zacieliť na CT26. WT modely syngénneho nádoru hrubého čreva. Štúdie in vitro odhalili, že CILP vykazovali vynikajúce vlastnosti s predĺženým uvoľňovaním a účinnosť bunkovej absorpcie v porovnaní s voľným imichimodom. In vivo testy preukázali, že CILP vykazovali účinnejšiu akumuláciu v nádoroch a výraznejší účinok na potlačenie nádorov ako kontrolné skupiny. Tento imunoterapeutický prípravok mal výhody nízkych dávok a nízkej toxicity. Tieto výsledky ukázali, že kombinácia terapie blokádou imunitného kontrolného bodu (ICB) a agonistov vrodenej imunity, ako je Fc-CV1 a lipozómový prípravok naplnený imikvimodom použitý v tejto štúdii, by mohla predstavovať vysoko účinnú stratégiu pre terapiu nádorov.

Výhody cistanche tubulosa-Protinádorové

Kľúčové slová:

imikvimod; lipozóm; Fc-CV1; imunoterapia; rakovina hrubého čreva

1. Úvod

Celosvetový výskyt rakoviny naďalej každoročne stúpa, čo predstavuje vážnu hrozbu pre zdravie svetovej populácie a predstavuje veľkú záťaž pre systémy zdravotnej starostlivosti. Podľa správy Svetovej zdravotníckej organizácie sa v roku 2020 na celom svete vyskytlo 19,29 milióna nových prípadov rakoviny a 9,96 milióna úmrtí na rakovinu [1]. Avšak s neustálym pokrokom v klinickej diagnostike, chirurgii, rádioterapii a chemoterapii sa celkové prežitie a kvalita života pacientov s rakovinou výrazne zlepšili. Je pozoruhodné, že imunoterapia, ktorá vznikla vakcínou Coley v 90. rokoch 19. storočia [2], predchádzala rádioterapii aj chemoterapii av poslednom desaťročí zaznamenala významný pokrok, z ktorého majú prospech pacienti s rakovinou.

Nádorová imunoterapia bola uznávaná pre svoju vynikajúcu biokompatibilitu a vysokú špecificitu a je schopná vyvolať imunitné odpovede na elimináciu nádorových buniek [3–5]. Dve hlavné stratégie nádorovej imunoterapie sú posilnenie imunity a normalizácia imunity [6]. Vzory posilnenia imunity pozostávajú hlavne z cytokínovej terapie, vakcín na liečbu nádorov a monoklonálnych protilátok. Toll-like receptory (TLR) sú považované za potenciálne ciele pre imunoterapiu rakoviny kvôli ich úlohe pri aktivácii vrodeného imunitného systému. Agonisty TLR boli vyvinuté ako imunitné adjuvans a množstvo agonistov TLR sa podrobuje klinickým skúškam [7]. Monofosforyl lipid A a imikvimod, TLR4 a TLR7 agonisty, v uvedenom poradí, získali schválenie od Food and Drug Administration na klinické použitie [7–9]. Imichimod, agonista TLR7 [9], aktivuje imunitné reakcie a zvyšuje protinádorovú aktivitu spustením TLR7 [10,11]. Stratégiu imunitnej normalizácie predstavujú lieky blokujúce imunitný kontrolný bod (ICB), ktoré regulujú defektnú adaptívnu imunitnú odpoveď nádoru. Od prvého kontrolného inhibítora, ipilimumabu, ktorý bol schválený na klinickú aplikáciu v USA v roku 2011, urobili inhibítory imunitného kontrolného bodu, ako sú inhibítory PD1/PDL1, prelom v imunoterapii rakoviny [12–14]. Okrem adaptovaných imunitných kontrolných bodov podobných PD1/PDL1, niektoré vrodené imunitné kontrolné body, ako napríklad SIRP-CD47, tiež pritiahli veľkú pozornosť a stali sa oblasťami významného záujmu pri vývoji liekov na protilátky [15–17].

Kontrolný bod SIRP-CD47 bol prvýkrát identifikovaný v roku 1999 [18,19]. SIRP je CD47 receptor exprimovaný v neurónoch centrálneho nervového systému [20] a myeloidných bunkách, vrátane monocytov, makrofágov, granulocytov a dendritických buniek. CD47 je „samooznačujúca molekula“ exprimovaná na takmer všetkých normálnych bunkách a nadmerne exprimovaná na väčšine nádorových buniek [21]. Na povrchu nádorových buniek sa CD47 viaže na SIRP, čím inhibuje fagocytózu sprostredkovanú makrofágmi, ktorá je dôležitým prostriedkom imunitného úniku nádoru [22]. Ukázalo sa, že fagocytóza makrofágov v mikroprostredí nádoru sa môže zvýšiť, keď je blokovaná väzba CD47 a SIRP [20–25]. Preto boli vyvinuté a aplikované inhibítory imunitného kontrolného bodu, ktoré blokujú dráhu CD47/SIRP [26].

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

V tejto štúdii sme použili kombináciu imiquimodu a fúzneho proteínu (Fc-CV1) na liečbu rakoviny hrubého čreva. CV1 je modifikovaný ľudský rekombinantný proteín SIRP, ktorý má 50, 000-krát vyššiu afinitu k CD47 ako pôvodný proteín [27]. Fc-CV1 bol skonštruovaný pomocou technológie "Knobs-into-holes" založenej na CV1 monoméri a Fc fragmente ľudského IgG1. Aby sme prekonali obmedzenia nízkej terapeutickej účinnosti a systémovej toxicity spojenej s imichimodom [28,29], pripravili sme nanolipozómy pomocou metódy injekcie etanolu. Nanolipozómy sa vyznačujú nízkou toxicitou pri podávaní liečiva [30,31]. Následne bol imikvimod zapuzdrený do lipozómov, ktoré povrchovo konjugovali Fc-CV1. Nakoniec tento nový nanoprípravok môže aktívne dodávať agonisty TLR7 do nádorových tkanív a má dvojitú funkciu ako ICB liek a agonista TLR. Bol použitý na liečbu CD47+ CT26.WT modelu syngénneho nádoru hrubého čreva [32].

2. Výsledky a diskusia

2.1. Charakterizácia LP (prázdne lipozómy), ILP (nie CD47-cielené lipozómy zapuzdrené v imiquimode), CLP (cielené lipozómy CD47) a CILP (spojené lipozómy Fc-CV1 s imiquimodom (agonista TLR7))

CILP boli úspešne pripravené injekciou etanolu a metódou gradientu síranu amónneho. Obrázok 1A zobrazuje proces syntézy CILP. Analýza TEM ukázala, že CILP boli sférické a jednotného tvaru (obrázok 1B). Okrem toho výsledok DLS odhalil, že veľkosť častíc štyroch lipozómov bola unimodálna distribúcia (obrázok 1C). Rýchlosť viazania (BR) bola overená pomocou SDS-PAGE, ktorá je znázornená na obrázku 1D, E. Obrázok 1D ukazuje molekulovú hmotnosť Fc-CV1 a relatívnu jasnosť pásu dialyzovaných a preddialyzovaných CILP. BR bola vypočítaná na 67,13 ± 37,10 % prostredníctvom skenovacej denzitometrie elektroforetických pásov Image J (obrázok 1E), čo poskytuje možnosť CD47- zacielenia na nádorové bunky.

Obrázok 1. (A) Schematické znázornenie syntézy CILP. (B) TEM obraz CILP

HPLC sa použila na detekciu účinnosti enkapsulácie (EE) imiquimodu (doplnkový obrázok S1). Ako je znázornené na doplnkovom obrázku S1A, voľný imiquimod vykazoval významný jediný vrchol, zatiaľ čo CLP nevykazovali žiadny vrchol za rovnakých testovacích podmienok (doplnkový obrázok S1B). Preto je možné detegovať CILP priamo za testovacích podmienok. Ako sa očakávalo, detekčné hodnoty CILP pred a po dialýze sa považovali za celkový obsah liečiva a obsah liečiva v lipozómoch (doplnkový obrázok S1C, D). EE imikvimodu bola vypočítaná na 85,44 ± 4,11 %. V porovnaní s uvádzaným systémom na podávanie liečiv s pasívnym plnením [33–35] táto štúdia dosiahla vyššiu účinnosť enkapsulácie a pohodlnejší proces prípravy.

DLS preukázala, že priemery LP boli 111,567 ± 0,655 nm, zatiaľ čo CLP, ILP a CILP vykazovali o niečo väčšiu veľkosť 117,467 ± 0,34{{10} } nm, 120,233 ± 0,776 nm a 13{{30}}.033 ± 0,974 nm (tabuľka 1). Zmeny vo veľkosti týchto lipozómov možno pripísať modifikácii Fc-CV1 a imikvimodu. PDI bol blízko 0,1 (tabuľka 1), čo naznačuje, že tieto vehikulá na dodávanie liečiva boli vo svojej distribúcii vysoko homogénne. Okrem toho boli namerané hodnoty zeta-potenciálu LP, CLP, ILP a CILP -2,231 ± 0,167 mV, -2,492 ± 0,033 mV, -2,383 ± 0,070 mV a -2,07 ± 7 mV5, v tomto poradí , čo naznačuje, že povrchovo konjugovaný Fc-CV1 a zapuzdrený imiquimod mali malý vplyv na náboj lipozómov.

Tabuľka 1. Priemery, zeta-potenciál, PDI a EE LP, CLP, ILP a CILP.

2.2. Účinnosť absorpcie buniek in vitro

Účinnosť vychytávania buniek CILP bunkami sa hodnotila prostredníctvom intenzity fluorescencie Cy5 absorbovanej bunkami CT26.WT pomocou systému zobrazovania s vysokým obsahom. Ako je znázornené na obrázku 2, v porovnaní s voľnými skupinami Cy5 a ILP-Cy5, skupiny CILPs-Cy5 vykazovali silnejšiu kapacitu absorpcie buniek po 30 minútach inkubácie. Z týchto výsledkov vyplýva, že Fc-CV1 zvyšuje schopnosť intracelulárneho dodávania lipozómov naplnených imikvimodom v dôsledku špecifickej afinity k receptoru Fc-CV1, čo vedie k silnejšiemu protinádorovému účinku.

Obrázok 2. Obrázky buniek CT26.WT po inkubácii s voľným Cy5, ILPs-Cy5 a CILPs-Cy5 (červená) počas 0,5 hodiny a farbení DAPI (modrá). Mierka: 50 µm. (n {{10}}). * p < 0,05; **** p < 0,0001

2.3. Uvoľňovacie krivky lipozómov

Krivky uvoľňovania liečiva voľného imiquimodu, ILP a CILP boli merané v simulovanom prostredí in vivo. Obrázok 3 ukazuje, že voľný imiquimod sa úplne uvoľnil po 1 hodine, zatiaľ čo rýchlosť uvoľňovania (RR) imiquimodu, ktorý bol zapuzdrený s ILP a CILP, bola len 54,75 ± 4.08 % a 39,70 ± 0,05 % po 12 hodinách , resp. Okrem toho, pomalé uvoľňovanie imichimodu v ILP a CILP by mohlo byť uzavreté vlastnosťou lipozómov s riadeným uvoľňovaním liečiva. RR imichimodu v ILP a CILP nevykazovala žiadny významný rozdiel po 96 hodinách, čo naznačuje, že "po vložení" vykazovalo zanedbateľný vplyv na membránovú stabilitu lipozómov.

obrázok 3. Krivky uvoľňovania imichimodu voľného imichimodu, ILP a CILP v PBS pri 37 ◦C. Údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka (n=3). * p < 0.05, ** p < 0,01

2.4. Štúdia cytotoxicity

Na štúdium cytotoxicity CILPs in vitro sa uskutočnil test CCK{{0}} na bunkách CT26.WT. Ako je znázornené na obrázku 4, CILP v nízkych koncentráciách (0,1–1 µg/ml) nevykazovali cytotoxicitu, čo je v súlade s bezpečnosťou imunizačnej terapie. Životaschopnosť buniek sa po liečbe 5 µg/ml imichimodom mierne znížila, pravdepodobne v dôsledku imunogénnej bunkovej smrti sprostredkovanej ROS a endoplazmatickým retikulom vyvolanej imichimodom [36]. Okrem toho CILP vedú k významnému zníženiu životaschopnosti buniek v porovnaní s kontrolnými skupinami, čo sa pripisuje synergickému účinku imichimodu a Fc-CV1.

Obrázok 4. Životaschopnosť buniek ošetrených Fc-CV1, imiquimodom, CLP, ILP a CILP počas 24 hodín. Koncentrácia Fc-CV1 a imiquimodu bola 0–10 µg/ml. * p < 0,05, ** p < 0,01, ns=žiadne významné rozdiely

2.5. Štúdia biodistribúcie

Distribúcia a akumulácia rôznych formulácií v nádoroch a hlavných orgánoch priamo ovplyvňuje terapeutický účinok. Po intravenóznom podaní sa fluorescenčné signály monitorovali pomocou blízkeho infračerveného vivisekčného systému na vyhodnotenie distribúcie a akumulácie rôznych formulácií v nádoroch a hlavných orgánoch po 24 hodinách. Ako je znázornené na obrázku 5, celková intenzita fluorescencie ILPs-Cy5 a CILPs-Cy5 bola vyššia ako voľný Cy5, čo naznačuje, že lipozómy majú dlhodobú cirkuláciu in vivo. Okrem toho intenzita fluorescencie skupiny liečenej CILPs-Cy5 bola najvyššia v nádorovom tkanive, čo by sa dalo pripísať účinku Fc-CV1 ligandov na zacielenie na nádor, čím sa zosilnil protinádorový účinok. Je prekvapujúce, že intenzita fluorescencie v pečeni a slezinách bola silnejšia ako v iných orgánoch, čo je pravdepodobne spôsobené fagocytózou lipozómov retikuloendotelovým systémom (RES) v pečeni a obličkách [37].

Obrázok 5. Distribúcia Cy5-fluorescencie v nádoroch a hlavných orgánoch 24 hodín po intravenóznom podaní. Údaje sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka (n=3). **** p < 0.0001

2.6. In vivo štúdia inhibície nádorov

Terapeutický rozvrh (obrázok 6A) a účinky rôznych prípravkov sú znázornené na obrázku 6. V porovnaní so skupinami s PBS a LP vykazovali iné liečené skupiny určité tumor-supresorové účinky. Je pozoruhodné, že objem nádoru bol po liečbe CILP minimálny, čo naznačuje, že CILP mali vynikajúci supresorový účinok (obrázok 6B).

Obrázok 6. (A) Schematické znázornenie liečby rakoviny hrubého čreva na modeli nádoru CT26.WT. (B) Rastové krivky objemu nádoru počas obdobia liečby. (C) Relatívne fotografie nádoru a (D) hmotnosť nádoru zozbierané od rôznych liečebných skupín v deň 17. (E) Pomer relatívnej telesnej hmotnosti k telesnej hmotnosti v porovnaní s 0 dňom. Údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka (n=5). * p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Na konci experimentu boli myši usmrtené a ich nádory boli vyrezané, odfotografované a zvážené, aby sa určila terapeutická účinnosť rôznych prípravkov. Ako je znázornené na obrázku 6C, D, liečebná skupina CILP mala najmenšie a najľahšie nádory v porovnaní s inými skupinami, čo dokazuje, že CILP mali najväčšie supresorové účinky na nádory. Tabuľka 2 ukazuje, že miera inhibície rastu nádoru CILP bola vypočítaná na 84,35 %. Okrem toho 84,35 % miera potlačenia nádoru bola výrazne vyššia ako u skupín CLP a ILP, čo znamená, že existuje synergický efekt blokovania osi „nezjedz ma“ a aktivácie imunitnej odpovede. . V porovnaní s ekvivalentným prípravkom in vitro (2,5–5 µg/ml) vyššia miera inhibície úzko súvisela s mierou imunitnej odpovede aktivovanej formuláciou a blokovala mechanizmus imunitného úniku in vivo, ktorý nebol dostupný in vitro.

Tabuľka 2. Údaje o hmotnosti nádoru a inhibícii rastu nádoru (TGI) rôznych liečebných skupín.

2.7. CILP zvýšil infiltráciu T-buniek a sekréciu IFN

Aby sa preskúmalo prostredie imunitných buniek nádorov, imunitná bunka indukovaná CILP sa analyzovala imunohistochemicky na konci protinádorového testu. CD4+ a CD8+ T bunky boli zvýšené v nádorových sekciách skupín CILPs (obrázok 7). Spoločné podávanie Fc-CV1 a terapie imikvimodom viedlo k významnej infiltrácii CD4+ a CD8+ T-buniek. Okrem toho došlo k významnej sekrécii IFN v nádoroch podstupujúcich liečbu CILP, čo bolo spôsobené tým, že CILP spustili Toll-like receptor 7 a aktivovali imunitnú odpoveď.

Obrázok 7. Imunohistochémia myších nádorových tkanív; pozitívne bunky sú sfarbené do hneda. Mierka, 50 µm (n=5).

2.8. Hodnotenie biologickej bezpečnosti CILP

Biologická bezpečnosť terapie sprostredkovanej CILP bola tiež dôležitým ukazovateľom z hľadiska prístupu k terapeutickému hodnoteniu. Počas štúdie inhibície nádoru in vivo CILP neindukovali významný úbytok hmotnosti v období liečby (obrázok 6D). Biochemické parametre pečene a obličiek boli všetky v normálnom rozsahu podľa štandardného referenčného rozsahu myší (tabuľka 3) a histológia orgánov nevykazovala žiadne významné zmeny, čo naznačuje, že CILP mali vynikajúcu biologickú bezpečnosť (obrázok 8). Tieto zistenia sú kľúčové pri hodnotení potenciálu CILP ako bezpečného a účinného imunoterapeutického činidla na liečbu rakoviny.

Tabuľka 3. Biochemické parametre pečene a obličiek

Obrázok 8. H&E (hematoxylín a eozín) farbenie hlavných orgánov. Mierka, 50 µm (n=3)

3. Materiály a metódy

3.1. Materiály

Imiquimod bol zakúpený od MedChem Express (Shanghai, Čína). Fc-CV1 poskytlo Štátne kľúčové laboratórium protilátkových liečiv a cielenej terapie. Cholesterol, hydrogenovaný lecitín (HSPC), DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS a DSPE-PEGCy5 boli zakúpené od spoločnosti Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, Čína). 40,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) bolo získaných od Keygen Biotech (Nanjing, Čína). Síran amónny bol získaný od Sinopharm (Shanghai, Čína). Metanol (chromatografická kvalita) a acetonitril (chromatografická kvalita) boli zakúpené od spoločnosti Aladdin Reagent Company (Shanghai, Čína). Všetky ostatné činidlá sú čistoty domácej analytickej kvality. Myšia bunková línia rakoviny hrubého čreva CT26. WT poskytla Bunková banka Čínskej akadémie vied. Bunky rástli v bunkovom inkubátore v médiu RPMI 1640 obsahujúcom 10 % FBS (Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA) pri 5 % C02 a 95 % vzduchu. Samice BALB/c myší vo veku 4 až 6 týždňov boli dodané spoločnosťou Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan, Čína).

3.2. Príprava prázdnych lipozómov

Najprv sa presne odvážilo 13,455 mg HSPC, 4,3595 mg DSPE-PEG2000 a 4,7095 mg cholesterolu a rozpustilo sa v 0,1 ml etanolu (HSPC: DSPE-PEG2000:cholesterol=55.5: molárny pomer 5,05:39,3). Po druhé, etanolový roztok sa rýchlo vstrekol do predhriateho roztoku síranu amónneho (250 mM, 1 ml, 65 °C) pomocou injekčnej striekačky a potom sa inkuboval 30 minút pri 65 °C s magnetickým miešaním. Následne bol pripravený roztok postupne extrudovaný cez polykarbonátové membrány (Avanti, Alabaster, AL, USA); veľkosť bola 200 nm, 100 nm a 50 nm. Nakoniec výsledným roztokom boli blank lipozómy (LP) s koncentráciou lipidov 22,5 mg/ml.

3.3. Príprava CD47 cielených lipozómov zapuzdrených v imikvimode

Najprv sa DSPE-PEG2000-NHS rozpustil v ddH2O (60 ◦C) a potom sa zmiešal s Fc-CV1 a inkuboval sa na trepacom stole pri izbovej teplote počas 5 hodín (Fc-CV1:DSPEPEG2000- NHS=12:1 molárny pomer). Mechanizmus chemickej reakcie spojenia medzi Fc-CV1 a DSPE-PEG2000-NHS zahŕňal reakciu esteru NHS s primárnym amínom na Fc-CV1 a vytvorenie konjugátu stolovej amínovej väzby. Pripravený roztok bol proporcionálne zmiešaný s LP a inkubovaný pri 60 ◦C počas 1 hodiny, aby sa vložil Fc-CV1 do lipozómov, čo bolo nazvané "post insertion" [38]. Pomery zmesi boli také, že 2,25 mg Fc-CV1 bolo modifikovaných na 22,5 mg lipozómov. Potom sa získali CD47 cielené lipozómy (CLP).

Následne sa CLP umiestnili do dialyzačného vaku (300 kDa) a dialyzovali sa proti HEPES (10 mM, pH=7,4) počas 1 hodiny, aby sa odstránil síran amónny a zvyškový Fc-CV1 vo vonkajšej vodnej fáze. Dialyzované CLP boli inkubované s roztokom imichimodu (5 mg/ml) v pomere 1 mg až 7 µmol celkových fosfolipidov pri teplote miestnosti počas 24 hodín a potom dialyzované proti PBS (300 kDa) trikrát, aby sa eliminoval nezapuzdrený imiquimod, ktorý gradientová technika síranu amónneho [39]. Potom sa získali CILP. Okrem toho sa pripravili neCD47-cielené lipozómy zapuzdrené v imikvimode (ILP). CLP a ILP sa považovali za kontrolu pre CILP.

3.4. Charakterizácia

Morfológia týchto lipozómov bola odfotografovaná transmisným elektrónovým mikroskopom (TEM, Joel, Tokio, Japonsko). Veľkosť, zeta-potenciál a index disperzity polyméru (PDI) týchto lipozómov boli stanovené dynamickým rozptylom svetla (DLS) a elektroforetickým rozptylom svetla (ELS) s použitím Malvernovho Zeta sizera ZSE (Malvern, UK). Rýchlosť viazania (BR) Fc-CV1 vloženého do lipozómov sa merala elektroforézou na 15 % laurylsulfát sodný-polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE) a softvérom Image J (Bethesda, MD, USA). Účinnosť enkapsulácie (EE) imiquimodu bola detekovaná vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC, Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA).

Výhody cistanche tubulosa-Protinádorové

3.5. Štúdia vychytávania buniek in vitro

In vitro bunkový príjem týchto lipozómov bol stanovený kumulatívnou intenzitou fluorescencie Cy5 v CT26. WT bunky. DSPE-PEG-Cy5 sa inkuboval s CILPs a ILPs (DSPE-PEG-Cy5: CILPs alebo ILPs=1:5 hmotnostný pomer) pri 60 ◦C počas 1 hodiny a potom fluorescenčnými lipozómami boli získané ako CILPs-Cy5 a ILPs-Cy5. Bunky CT26.WT boli nasadené na 96-jamkové platne a náhodne rozdelené do troch skupín (1 x 104 buniek/jamka, n=3). Potom, čo bunková konfluencia dosiahla 50–70 %, bola každá skupina inkubovaná s voľným Cy5, ILPs-Cy5 a CILPs-Cy5 počas 30 minút pri 37 °C, pričom konečné koncentrácie Cy5 boli 1 µg/ml v 0,1 ml média RPMI 1640. Následne boli bunky imobilizované 4% paraformaldehydom počas 15 minút po tom, čo boli dvakrát premyté PBS a potom farbené s 10 ul DAPI (1 ug/ul) počas 10 minút po tom, čo boli dvakrát premyté PBS. Nakoniec sa príjem každej skupiny buniek zaznamenal pomocou systému High-Content Imaging System (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) po dvojnásobnom premytí PBS.

3.6. Štúdia uvoľňovania Imiquimodu

Krivky uvoľňovania rôznych lipozómov naplnených liečivom sa uskutočnili pomocou dialyzačnej metódy (300 kDa) a výsledky sa porovnali s roztokom voľného imichimodu. Stručne, 0,6 ml ILP, CILP a roztok imichimodu sa oddelene zabalili do dialyzačných vakov a potom sa umiestnili do 500 ml roztoku PBS (pH=7,4, 37 ◦C). Vo vopred určených časových intervaloch (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 a 96 h) a rýchlosti uvoľňovania (RR) boli z vreciek extrahované rovnaké objemy vzoriek. imikvimodu sa vypočítal pomocou nasledujúcej rovnice:

kde Sund a Sd predstavovali plochu píku HPLC imichimodu v preddialyzovaných a dialyzovaných prípravkoch v rôznych časoch (n=3).

3.7. Cytotoxicita CILP

CT {{0}}.WT bunky sa naočkovali na 96-jamkovú doštičku (1 x 104/jamka, n=3) a kultivovali sa v 100 ul média RPMI 1640 až do konfluencie tesne dosiahol 70 %. Aby sa určila cytotoxicita CILP, médium RPMI 1640 sa odstránilo z každej jamky a nahradilo sa komplexným roztokom CILP a média RPMI 1640 s koncentráciami Fc-CV1 a imiquimodu v rozmedzí od 0 do 10 ug/ml. Bunky sa inkubovali s komplexným roztokom počas 24 hodín. Okrem toho bunky, ktoré boli ošetrené Fc-CV1, CLP, roztokom imichimodu a ILP v podobnej koncentrácii, boli považované za kontrolné skupiny. Prežívajúce bunky sa detegovali pomocou testu CCK-8 po 24 hodinách a životaschopnosť neošetrených buniek sa považovala za 100 %.

3.8. Štúdia biodistribúcie

Deväť samiciam BALB/c myší sa subkutánne injikovalo CT26. Bunky WT (5 x 105 ) v pravom boku a tieto myši s nádorom boli náhodne rozdelené do troch skupín (n=3). Objemy nádorov sa merali pomocou posuvného meradla a vypočítali sa podľa nasledujúceho vzorca:

Keď objem nádoru dosiahol 100 mm3, bol intravenózne injikovaný voľný Cy5, ILP-Cy5 a CILPs-Cy5 v dávke Cy5 0,4 mg/kg. Dvadsaťštyri hodín po intravenóznej injekcii bol vybratý nádor, srdce, pečeň, slezina, pľúca a obličky. Fluorescenčné signály nádorov a hlavných orgánov boli detegované optickým zobrazovacím systémom IVIS (IVIS Lumina LT III, PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

3.9. In vivo štúdia inhibície nádorov

Tridsaťpäť samíc myší BALB/c bolo náhodne rozdelených do siedmich skupín (n=5) a 5 × 105 CT26. Bunky WT boli injikované subkutánne do pravého boku každej myši. Keď veľkosť myšacieho nádoru bola približne 100 mm3, liečba sa začala. PBS, LP, imichimod, Fc-CV1, ILP, CLP a CILP boli intravenózne podané v dňoch 0, 4, 8 a 12. Dávka imiquimodu bola 2,5 mg/kg v prvej a druhej injekcii a 5 mg/kg v tretej a štvrtej injekcii. Vo všetkých injekciách bola dávka Fc-CV1 5 mg/kg. Pri tejto dávke bola koncentrácia liečiva v tele 2,5–5 µg/ml, čo v in vitro experimente pôsobilo na bunky cytotoxicky. Priemery nádorov a telesná hmotnosť sa merali každý deň počas liečby. V deň 17 sa myšiam vybrali nádory a zmerali sa ich hmotnosti. Inhibícia rastu nádoru (TGI) sa vypočítala podľa nasledujúceho vzorca:

3.10. Imunohistochémia

Imunohistochemické farbenie CD4, CD8 a IFN sa uskutočnilo v nádorových tkanivách podľa štandardného protokolu. Po deparafinizácii a rehydratácii parafínovej časti rezov nádorových tkanív sa do kruhu pridalo 3% BSA, aby sa tkanivo pokrylo, a potom sa uzavrel na 30 minút pri teplote miestnosti. Rezy sa zafarbili protilátkami CD4, CD8 a IFN (Servicebio, Wuhan, Čína) cez noc pri 4 °C a potom sa inkubovali so sekundárnou protilátkou (označená HRP, Servicebio, Wuhan, Čína) pri teplote miestnosti počas 50 minút. po dvoch premytiach PBS. Nakoniec boli rezy vizualizované pod mikroskopom (Nikon, E100, Tokio, Japonsko) po reakcii s DAB chromogénnym činidlom.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

3.11. Hodnotenie biologickej bezpečnosti CILP

Na konci štúdie inhibície nádoru sa všetky nádory zhromaždili a zmerala sa hmotnosť týchto nádorov. Biochemické parametre, vrátane alanín transaminázy (ALT), aspartát transaminázy (AST), kreatinínu (CREA) a močoviny (UREA), boli zistené v krvi myší. Čerstvé nádorové tkanivá a hlavné orgány sa fixovali 4% paraformaldehydom a zaliali sa do parafínu pomocou zalievacieho stroja (Wuhan Junjie Electronics, JB-P5, Wuhan, Čína). Tkanivové rezy s hrúbkou 5 um sa narezali cez mikrotóm (Leica Instrument, RM2016, Shanghai, Čína) a potom sa zafarbili hematoxylínom a eozínom (H&E) podľa protokolu. Následne boli zafarbené rezy pozorované pod mikroskopom (Nikon, E100, Tokio, Japonsko).

3.12. Štatistická analýza

Všetky údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD. Hladina významnosti medzi skupinami bola testovaná jednosmernou ANOVA s použitím Graphpad Prism 8.0.2. p < 0,05 bolo definované ako významný rozdiel.

3.13. Etika zvierat

Všetky postupy a odporúčania týkajúce sa zvierat boli schválené Osobitným výborom pre etiku vedeckého výskumu Univerzity Liaocheng v súlade s národnými usmerneniami pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat (kód schválenia: 2022111010; dátum schválenia: 1. novembra 2022).

cistanche rastlina zvyšujúca imunitný systém

4. Závery

Stručne povedané, v imikvimode zapuzdrené CD47-cielené lipozómy boli úspešne vyvinuté a výsledky in vitro preukázali, že CILPs mali lepšie predĺžené uvoľňovanie a špecifický cieľový účinok. Výsledky in vivo ukázali, že prípravok by mohol byť účinne absorbovaný nádorovými bunkami a že vykazoval vynikajúcu účinnosť liečby nádoru a biologickú bezpečnosť v dôsledku dvojitej funkcie imunitnej odpovede a vrodenej blokády kontrolných bodov imunity. Preto sa zdá, že lipozómy zapuzdrené v imikvimode spojené s Fc-CV1 sú sľubnou novou nanomedicínou na zlepšenie liečby nádorov s expresiou CD47. Imunoterapia založená na vrodenej imunite môže v budúcnosti slúžiť ako všeobecná stratégia proti rastu nádoru pre synergické kombinácie s ICB.

Referencie

1. Sung, H.; Ferlay, J.; Siegel, RL; Laversanne, M.; Soerjomataram, I.; Jemal, A.; Bray, F. Global Cancer Statistics 2020: Globocan Odhady incidencie a úmrtnosti na celom svete pre 36 druhov rakoviny v 185 krajinách. CA Cancer J. Clin. 2021, 71, 209–249. [CrossRef] [PubMed]

2. Carlson, RD; Flickinger, JC, Jr.; Snook, AE Talkin' Toxins: Od Coleys k modernej imunoterapii rakoviny. Toxíny 2020, 12, 241. [CrossRef] [PubMed]

3. Barbari, C.; Fontaine, T.; Parajuli, P.; Lamichhane, N.; Jakubski, S.; Lamichhane, P.; Deshmukh, RR Imunoterapie a kombinované stratégie pre imuno-onkológiu. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5009. [CrossRef]

4. Hegde, PS; Chen, DS Top 10 výziev v imunoterapii rakoviny. Imunita 2020, 52, 17–35. [CrossRef]

5. Jain, KK Personalizovaná imuno-onkológia. Med. Princ. Prax. 2021, 30, 1–16. [CrossRef]

6. Sanmamed, MF; Chen, L. Paradigm Shift in Cancer Imunotherapy: From Enhancement to Normalization. Cela 2018, 175, 313–326. [CrossRef]

7. Hussein, WM; Liu, TY; Skwarczynski, M.; Toth, I. Toll-Like Receptor Agonists: A Patent Review (2011–2013). Expert Opin. Ther. Pat. 2014, 24, 453–470. [CrossRef]

8. Chi, H.; Li, C.; Zhao, FS; Zhang, L.; Ng, TB; Jin, G.; Sha, O. Protinádorová aktivita agonistov Toll-like Receptor 7. Predné. Pharmacol. 2017, 8, 304. [CrossRef] [PubMed]

9. Wang, Y.; Zhang, S.; Li, H.; Wang, H.; Zhang, T.; Hutchinson, MR; Yin, H.; Wang, X. Small-Molecule Modulators of Toll-like Receptors. Prísl. Chem. Res. 2020, 53, 1046–1055. [CrossRef] [PubMed]

10. Le Mercier, I.; Poujol, D.; Sanlaville, A.; Sisirák, V.; Gobert, M.; Durand, I.; Dubois, B.; Treilleux, I.; Marvel, J.; Vlach, J.; a kol. Propagácia nádoru intratumorálnymi plazmocytoidnými dendritickými bunkami je zvrátená liečbou ligandom Tlr7. Cancer Res. 2013, 73, 4629–4640. [CrossRef]

11. Ma, F.; Zhang, J.; Zhang, J.; Zhang, C. Agonisti Tlr7 Imiquimod a Gardiquimod zlepšujú imunoterapiu na báze DC pre melanóm u myší. Bunka. Mol. Immunol. 2010, 7, 381–388. [CrossRef]

12. Billan, S.; Kaidar-Person, O.; Gil, Z. Liečba po progresii v ére imunoterapie. Lancet Oncol. 2020, 21, e463–e476. [CrossRef] [PubMed]

13. Darvin, P.; Toor, SM; Sasidharan Nair, V.; Elkord, E. Immune Checkpoint Inhibitors: Recent Progress and Potential Biomarkers. Exp. Mol. Med. 2018, 50, 1–11. [CrossRef] [PubMed]

14. Li, B.; Chan, HL; Chen, P. Immune Checkpoint Inhibitors: Basics and Challenges. Curr. Med. Chem. 2019, 26, 3009–3025. [CrossRef] [PubMed]

15. Jia, X.; Yan, B.; Tian, ​​X.; Liu, Q.; Jin, J.; Shi, J.; Hou, Y. Cd47/Sirpalpha Pathway Mediates Cancer Immune Escape and Imunotherapy. Int. J. Biol. Sci. 2021, 17, 3281–3287. [CrossRef]

16. Swoboda, DM; Sallman, DA Prísľub inhibítorov kontrolných bodov riadených makrofágmi pri myeloidných malignitách. Najlepšia prax a výskum. Clin. Haematol. 2020, 33, 101221.

17. Lentz, RW; Colton, MD; Mitra, SS; Messersmith, WA Vrodené inhibítory imunitného kontrolného bodu: Ďalší prelom v lekárskej onkológii? Mol. Cancer Ther. 2021, 20, 961–974. [CrossRef]

18. Jiang, P.; Lagenaur, CF; Narayanan, V. Proteín spojený s integrínom je ligand pre molekulu neurálnej adhézie P84. J. Biol. Chem. 1999, 274, 559-562. [CrossRef]

19. Seiffert, M.; Cant, C.; Chen, Z.; Rappold, I.; Brugger, W.; Kanz, L.; Brown, EJ; Ullrich, A.; Buhring, HJ ľudský signálno-regulačný proteín je exprimovaný na normálnych, ale nie na podskupinách leukemických myeloidných buniek a sprostredkúva bunkovú adhéziu zahŕňajúcu jeho protireceptor Cd47. Blood 1999, 94, 3633–3643. [CrossRef]

20. Matlung, HL; Szilagyi, K.; Barclay, NA; van den Berg, TK The Cd47-Sirpalpha Signaling Axis as Innate Immune Checkpoint in Cancer. Immunol. Rev. 2017, 276, 145–164. [CrossRef] [PubMed]

21. Oldenborg, PA; Zheleznyak, A.; Fang, YF; Lagenaur, CF; Gresham, HD; Lindberg, FP Úloha Cd47 ako markera seba na červených krvinkách. Science 2000, 288, 2051–2054. [CrossRef]

22. Li, Z.; Li, Y.; Gao, J.; Fu, Y.; Hua, P.; Jing, Y.; Cai, M.; Wang, H.; Tong, T. The Role of Cd47-Sirpalpha Immune Checkpoint in Tumor Immune Evasion and Innate Imunotherapy. Life Sci. 2021, 273, 119150. [CrossRef]

23. Hayat, SMG; Bianconi, V.; Pirro, M.; Jaafari, MR; Hatamipour, M.; Sahebkar, A. Cd47: Úloha v imunitnom systéme a aplikácia na terapiu rakoviny. Bunka. Oncol. 2020, 43, 19–30. [CrossRef]

24. Huang, Y.; Smieť.; Gao, P.; Yao, Z. Targeting Cd47: The Achievements and Concerns of Current Studies on Cancer Imunotherapy. J. Thorac. Dis. 2017, 9, E168–E174. [CrossRef]

25. Zhang, W.; Huang, Q.; Xiao, W.; Zhao, Y.; Pi, J.; Xu, H.; Zhao, H.; Xu, J.; Evans, CE; Jin, H. Pokroky v protinádorovej liečbe zameranej na os Cd47/Sirpalpha. Predné. Immunol. 2020, 11, 18. [CrossRef] [PubMed]

26. Liu, X.; Pu, Y.; Cron, K.; Deng, L.; Kline, J.; Frazier, WA; Xu, H.; Peng, H.; Fu, YX; Xu, MM Cd47 blokáda spúšťa deštrukciu imunogénnych nádorov sprostredkovanú T bunkami. Nat. Med. 2015, 21, 1209–1215. [CrossRef] [PubMed]

27. Weiskopf, K.; Ring, AM; Ho, CC; Volkmer, JP; Levin, AM; Volkmer, AK; Ozkan, E.; Fernhoff, NB; van de Rijn, M.; Weissman, IL; a kol. Skonštruované varianty Sirpalpha ako imunoterapeutické adjuvans k protirakovinovým protilátkam. Veda 2013, 341, 88–91. [CrossRef]

28. Xiong, Z.; Ohlfest, JR Topical Imiquimod má terapeutické a imunomodulačné účinky proti intrakraniálnym nádorom. J. Immunother. 2011, 34, 264–269. [CrossRef]

29. Kamath, P.; Darwin, E.; Arora, H.; Nouri, K. Prehľad o terapii imikvimodom a diskusia o optimálnom manažmente bazocelulárnych karcinómov. Clin. Drug Investig. 2018, 38, 883–899. [CrossRef]

30. Liu, Y.; Castro Bravo, KM; Liu, J. Targeted Liposomal Drug Delivery: A Nanoveda and Biophysical Perspective. Nanoškála Horiz. 2021, 6, 78–94. [CrossRef] [PubMed]

31. Farjadian, F.; Ghasemi, A.; Gohari, O.; Roointan, A.; Karimi, M.; Hamblin, MR nanofarmaceutiká a nanomedicína, ktoré sú v súčasnosti na trhu: výzvy a príležitosti. Nanomedicína 2019, 14, 93–126. [CrossRef]

32. Zhou, X.; Jiao, L.; Qian, Y.; Dong, Q.; Sun, Y.; Zheng, W.; Zhao, W.; Zhai, W.; Qiu, L.; Wu, Y.; a kol. Zmena polohy azelnidipínu ako duálneho inhibítora zacieleného na cesty Cd47/Sirpalpha a Tigit/Pvr pre imunoterapiu rakoviny. Biomolecules 2021, 11, 706. [CrossRef]

33. Ni, K.; Luo, T.; Culbert, A.; Kaufmann, M.; Jiang, X.; Lin, W. Nanoscale Metal-Organic Framework Co-Delivers Tlr{3}} agonists and Anti-Cd47 Antibodies to Modulate Macrophages and Orchestrate Cancer Imunotherapy. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 12579–12584. [CrossRef]

34. Chen, Q.; Xu, L.; Liang, C.; Wang, C.; Peng, R.; Liu, Z. Fototermálna terapia s imunoadjuvantnými nanočasticami spolu s blokádou kontrolného bodu pre účinnú imunoterapiu rakoviny. Nat. komun. 2016, 7, 13193. [CrossRef] [PubMed]

35. Wei, J.; Long, Y.; Guo, R.; Liu, X.; Tang, X.; Rao, J.; Yin, S.; Zhang, Z.; Li, M.; He, Q. Multifunkčná polymérna micela založená chemo-imunoterapia s blokádou imunitného kontrolného bodu na efektívnu liečbu ortotopického a metastatického karcinómu prsníka. Acta Pharm. Sin. B 2019, 9, 819–831. [CrossRef]

36. Huang, JZ; Wang, ST; Chang, SH; Chuang, KC; Wang, HY; Kao, JK; Liang, SM; Wu, CY; Kao, SH; Chen, YJ; a kol. Imichimod vykazuje protinádorové účinky indukciou imunogénnej bunkovej smrti a je posilnený glykolytickým inhibítorom 2-deoxyglukózou. J. Investig. Dermatol. 2020, 140, 1771–1783.e6. [CrossRef] [PubMed]

37. Wang, B.; On, X.; Zhang, Z.; Zhao, Y.; Feng, W. Metabolizmus nanomateriálov in vivo: Krvný obeh a klírens orgánov. Prísl. Chem. Res. 2013, 46, 761–769. [CrossRef]

38. Akhtari, J.; Rezayat, SM; Teymouri, M.; Alavizadeh, SH; Gheybi, F.; Badiee, A.; Jaafari, MR zacielenie, biodistribúcia a inhibícia rastu nádorov charakterizácia naviazania anti-Her2 Affibody na lipozomálny doxorubicín s použitím tubo nádorov u myší Balb/C. Int. J. Pharm. 2016, 505, 89–95. [CrossRef]

39. Woodle, MC; Papahadjopoulos, D. Príprava lipozómov a charakterizácia veľkosti. Metódy Enzymol. 1989, 171, 193-217. [PubMed]