Poškodená autofágia závislá od ATG16L podporuje renálnu intersticiálnu fibrózu pri chronickej dysfunkcii obličkového štepu prostredníctvom indukcie EndMT prostredníctvom NF-kB signálnej dráhy

Zeping Gui^1,2†, Chuanjian Suo^1†, Zijie Wang ^1†, Ming Zheng¹, Shuang Fei¹, Hao Chen¹, Li Sun¹, Zhijian Han¹, Jun Tao¹, Xiaobin Ju¹, Haiwei Yang¹, Min Gu^2*a Ruoyun Tan^1*

Chronickýobličkovédysfunkcia štepu (CAD) je spôsobená viacerými faktormi, vrátane glomerulárnej sklerózy, zápalu, intersticiálnej fibrózy a tubulárnej atrofie (IF/TA). Najvýraznejšie prvky všakCADsú IF/TA. Naše štúdie potvrdili, že endotelovo-mezenchymálny prechod (EndMT) je dôležitým zdrojom aloštepu IF/TA. Charakteristika EndMT je strata endotelového markera a získanie mezenchymálnych alebo fibroblastických fenotypov. Autofágia je intracelulárna degradačná dráha, ktorá je regulovaná proteínmi súvisiacimi s autofágiou a hrá dôležitú úlohu pri mnohých fibrotických stavoch. Či však autofágia prispieva alebo neprispieva k fibrózeobličkovéaloštepu a ako k takémuto mechanizmu dochádza, zostáva stále nejasné. Gén podobný autofágii 16 (ATG16L) je kritický gén súvisiaci s autofágiou (ARG) potrebný na tvorbu autofagozómov. Tu sme najprv analyzovali tkanivá pacientov po transplantácii obličky zo súborov údajov Gene Expression Omnibus (GEO) a 60 pacientov po transplantácii z nášho centra. Príjemcovia so stabilnou funkciou obličiek boli definovaní akoCADskupiny a všetkých pacientov vCADskupine boli histopatologicky diagnostikovanéCAD. Výsledky ukázali, že ATG16L, ako jeden významný diferenciálny ARG, bol menej exprimovaný vCADskupine v porovnaní so skupinou bez CAD. Ďalej sme zistili, že v transplantovaných obličkách bolo menej autofagozómov a autolyzozómovCADpacientov a downregulácia autofágie je zlým prognostickým faktorom. In vitro sme zistili, že knockdown ATG16L zvýšil proces EndMT u ľudíobličkovéglomerulárne endotelové bunky (HRGEC). In vivo sa potom u potkanov detegovali zmeny EndMT a autofagický tokobličkovétransplantačné modelyCAD. Preukázali sme výskyt EndMT a naznačili sme, že množstvo ATG16L bolo sprevádzané dynamickou zmenou autofagického toku v rôznych štádiách transplantácie obličiek. Mechanicky knockdown ATG16L, konkrétne v endotelových bunkách, znížil degradáciu NF-kB a vylúčil zápalové cytokíny (IL-1b, IL-6 a TNF-a), čo by mohlo uľahčiť EndMT. Záverom možno povedať, že autofagický tok závislý od ATG16L spôsobený transplantáciou vykazoval progresívny nárast straty v priebehu času.

Zápalové cytokíny z tohto procesu podporovali EndMT, čo viedlo k progresiiCAD. ATG16L slúžil ako negatívny regulátor EndMT a vývojobličkovéfibróza štepu a autofágia môžu byť skúmané ako potenciálny terapeutický cieľ pre chronickú dysfunkciu obličkového štepu.

Kľúčové slová:chronická dysfunkcia obličkového štepu, obličkovéintersticiálna fibróza, ATG16L, autofágia, EndMT, zápalové cytokíny

Ďalšie informácie:{0}}

ÚVOD

Obličkytransplantáciaje jednou z optimálnych liečebných metód pre pacientov s urémiou, pretože výrazne zlepšuje kvalitu ich života (1). Existuje však relatívne vysoký počet dysfunkcií renálneho aloštepu po transplantácii v dôsledku chronického progresívneho zhoršovania renálnych funkcií, čo je kľúčový faktor ovplyvňujúci dlhodobé prežívanie transplantovaných obličiek (2). Chronická renálna dysfunkcia štepu (CAD), predtým známa ako chronická aloštepová nefropatia, je multifaktoriálny stav spojený s progresívnou renálnou intersticiálnou fibrózou. Je známe, že k strate funkcie renálneho aloštepu prispievajú rôzne faktory, vrátane, ale nie výlučne, akútneho a chronického odmietnutia, ischémie a reperfúzneho zápalu a procesu obnovy tkaniva a nefrotoxicity súvisiacej s liekmi (3).

CADje morfologicky charakterizovaná zápalom, progresívnou intersticiálnou fibrózou a tubulárnou atrofiou (IF/TA) a glomerulárnou sklerózou (4). Spomedzi nich je kľúčovým faktorom určujúcim funkciu renálneho aloštepu IF/TA, ale mechanizmy, ktorými k nemu dochádza, sú stále neznáme. Bolo identifikovaných niekoľko faktorov, ktoré prispievajú k vysokému podielu straty renálneho aloštepu. V našej predchádzajúcej štúdii sme tiež potvrdili, že hlavným patologickým procesom CAD bol renálny aloštep IF/TA, ktorý je charakterizovaný nadmerným ukladaním extracelulárnej matrice v transplantovanom renálnom tubulárnom a intersticiálnom tkanive (5). Štúdie potvrdili, že kolagény sú vylučované hlavne myofibroblastmi a sekrécia kolagénov vedie k sedimentácii extracelulárnej matrice a následne k transplantácii obličky IF/TA. Na tvorbe myofibroblastov sa podieľajú štyri hlavné bunky: epitelové bunky, endotelové bunky, fibroblasty odvodené od kostnej drene a mikrovaskulárne pericyty (6, 7). Zohrávajú kľúčovú úlohu pri oprave a ochrane integrity obličkového tkaniva. Medzi nimi vonkajšie stimuly umožňujú diferenciáciu vnútorných obličkových buniek, ako sú epiteliálne bunky, na myofibroblasty, ktoré môžu produkovať extracelulárnu matricu. Tento proces sa nazýva epitelový-mezenchymálny prechod (EMT). EMT zvyčajne zahŕňala tri typy: (I) embryogenézu, (II) opravu tkaniva a fibrózu, (III) metastázy (8). Bolo vykonaných niekoľko štúdií na objasnenie molekulárnych a bunkových mechanizmov EMT typu II pri fibróze orgánov (9, 10), avšak úlohy EMT v rôznych primárnych procesoch generujúcich fibroblasty počas progresie CAD stále zostávajú nepresvedčivé.

Pri transplantácii obličky vždy existuje zvýšená pravdepodobnosť poškodenia makro- a mikrovaskulatúry aloštepu v dôsledku fyzického umiestnenia endotelu aloštepu, čo z neho robí počiatočný cieľ voľby pri poranení aloštepu (11). Aloštepy pôsobia ako potenciálne ciele pre imunitnú odpoveď sprostredkovanú veľkým počtom sérových zápalových cytokínov. Štúdie ukázali, že mnohé zápalové cytokíny sa podieľajú naCADprocesu (12) a endotelové bunky v miestach renálnych aloimplantátov boli nielen účastníkmi zápalu, ale aj regulátormi zápalu (11). Náš predchádzajúci výskum ukázal, že TNF‐a je viac exprimovaný vCADnež skupina bez CAD. TNF‐a tiež uľahčil proces EMT v ľudských proximálnych tubulárnych bunkách (HK2) (13). Vzhľadom na tesný kontakt medzi endotelovými bunkami a krvou, cirkulujúce zápalové bunky a cytokíny najskôr napadnú endotel aloštepu. Chronická stimulácia zápalovými cytokínmi vedie k tomu, že endotelové bunky podliehajú poruchám bunkovej štruktúry a vnútorného prostredia, čo vedie k poškodeniu endotelu. Nové štúdie naznačujú, že poškodenie endotelu prispieva k ukladaniu extracelulárnej matrice a hrá kľúčovú úlohu pri ochoreniach fibrózy orgánov. Nedávno sa endotelový-mezenchymálny prechod (EndMT) považuje za hlavnú príčinu poškodenia endotelu a podporuje progresiu IF/TA počas renálnej fibrózy (5, 9). EndMT je charakteristický typ EMT. Je charakterizovaná bunkami, ktoré postupne strácajú endotelové markery, ako sú CD31 a CD34, a získavajú mezenchymálny alebo myofibroblastický fenotyp, ako je a-hladký svalový aktín (a-SMA), kolagén I a fibronektín (FN). Regulačný mechanizmus pre EndMT zostáva zložitým problémom. Výskyt EndMT môže byť ovplyvnený mnohými faktormi, ako je oxidačný stres, hypoxický stav a rôzne zranenia (14, 15). Ale takmer všetky tieto regulačné faktory sa nakoniec spoja do jedného priameho účinku, ktorým sú zápalové cytokíny. V našich predchádzajúcich štúdiách sme ukázali, že EndMT bol dôležitým faktorom v patogenéze IF/TA a CAD prostredníctvom signálnych dráh TGF-b/Smad (5). Okrem toho ďalší vedci navrhli, že expresia TGF-b bola up-regulovaná TNF‐a (16). Zápalové cytokíny, ako je TNF-a, teda môžu byť tiež dôležitým patogénnym faktorom pri poškodení vaskulárneho endotelu, ktorý charakterizuje progresiu CAD. Hoci počiatočné faktory EndMT boli v rôznych mikroprostrediach odlišné, konečný výsledok bol rovnaký. Preto stačilo predpokladať, že musí existovať centrálny regulačný mechanizmus v produkcii zápalových cytokínov a progresii EndMT.

Autofágia je bunková dráha zodpovedná za degradáciu proteínov a organel (17). Proces autofágie je známy aj ako autofagický tok a sila tohto procesu často predstavuje stupeň aktivácie autofágie. Autofágia sa podieľa na rôznych renálnych patofyziologických procesoch, vrátane glomerulosklerózy, diabetickej nefropatie a cystického ochorenia obličiek (18). Niektoré štúdie uviedli, že autofágia bola cytoprotektívnym procesom. Klasická obrana tohto predpokladu je pozorovaná u myší s deléciou ATG5 proximálneho tubulu, kde delécia podporovala závažnejšiu renálnu fibrózu v dôsledku zhoršenej autofágie (19). Iné štúdie tiež zistili, že podmienený knockdown buniek epitelu proximálnych tubulov ATG5 zhoršil akútne poškodenie obličiek v ranom štádiu, ale spomalil progresiu fibrózy obličiek v procese obnovy alebo opravy (20). Špecifická interakcia medzi autofágiou a EMT alebo EndMT na fibróze však stále zostáva kontroverzná. Niekoľko štúdií naznačilo, že autofágová inhibícia by mohla indukovať EMT a fibrózu ovplyvnením aberantného presluchu epitelu a fibroblastov pri idiopatickej pľúcnej fibróze (21). Iní ukázali, že Rapamycín podporuje EndMT prostredníctvom aktivácie autofágie počas predčasného starnutia (22). Gén ATG16L zahŕňa hlavne ATG16L1 a ATG16L2. ATG16L2 homo- a hetero-oligomerizuje s ATG16L1. Ale ATG16L2 je menej spojený s autofágiou (23). ATG16L1 bol identifikovaný ako dôležitý gén súvisiaci s autofágiou, podporuje tvorbu autofagozómov na plazmatickej membráne a hrá rozhodujúcu úlohu v lipidovanej forme LC3 (23). Tu je ATG16L1 súhrnne označovaný ako ATG16L. Ako kľúčový faktor v autofágii bol raz hlásený ATG16L, ktorý súvisí s patogenézou niekoľkých zápalových ochorení. Napríklad mutácia ATG16L poskytla silnú predispozíciu k rozvoju Crohnovej choroby (24). Mechanizmus účinku a autofágie ATG16L však ešte nebol dobre študovaný v cielenom prístupe, ako je napríklad manažment a prognóza transplantácie obličiek. Takže dynamická úloha autofagického toku a autofágie závislej od ATG16L musí byť stredobodom výskumu potenciálnych terapeutík v progresii CAD.

V tejto štúdii sme skúmali potenciálnu úlohu autofágie závislej od ATG16L v progresii CAD. Zistili sme, že strata ATG16L a autofágia boli spojené s výskytom EndMT u klinických pacientov s CAD a potkanov s transplantovanou obličkou. Potom sme zistili, že hladiny EndMT a intersticiálnej fibrózy renálneho aloštepu sa zvýšili po zmene autofágovej aktivity potlačením génu ATG16L. Okrem toho sa pomocou sekvenovania RNA skúmali aj potenciálne základné mechanizmy, zistili sme, že poškodenie ATG16L prispelo k aktivácii dráhy jadrového faktora-kB (NF-kB) a sekrécii zápalových cytokínov, a potom podporilo progresiu EndMT.

MATERIÁLY A METÓDY

Etické vyhlásenie

Protokoly štúdie boli v súlade s Helsinskou a Istanbulskou deklaráciou. Štúdie na ľuďoch boli preskúmané a schválené miestnou etickou komisiou Prvej pridruženej nemocnice lekárskej univerzity Nanjing (ID: IACUC-2010020). Informovaný súhlas bol získaný od všetkých príjemcov transplantátu, ako aj od pacientov s nefrektómiou, ktorí boli zahrnutí do tohto výskumu.

Štúdie zahŕňajúce potkany preskúmala a schválila miestna etická komisia Prvej pridruženej nemocnice lekárskej univerzity Nanjing (ID: IACUC-2010020). Majitelia dávajú písomný informovaný súhlas s účasťou ich zvierat na tomto výskume.

Zbierka vzoriek

Sixty of adults who had received living or deceased donor kidney transplants started to be followed up from January 2010 to December 2017 at First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. Patients with serum creatinine level consistently < 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least 12 months after kidney transplantation and no other complications such as episodes of significant rejection, drug toxicity injury, and infection were assigned to the non-CAD group. Patients in the CAD group were defined as elevated serum creatinine greater than or equal to 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least three months, and they were diagnosed by two independent pathology experts combined with biopsy results, laboratory indexes, and imaging features. Adjacent normal kidney tissues were obtained from regions outside the tumor margin (>5 cm) u pacientov po operáciách radikálnej nefrektómie. Vzorky krvi sa odoberali po tom, čo pacienti dali informovaný súhlas. Na konkrétny krok sa môžeme odvolávať v našich predchádzajúcich štúdiách (5). Základné charakteristiky pacientov v skupine s CAD a v skupine bez CAD boli uvedené v tabuľke 1.

Modely potkanov a zvierat

Dospelé samce potkanov F344 a Lewis (hmotnosť 250 ± 10,3 g) boli získané z laboratórií Charles River Laboratories (Peking, Čína) a riadili sa pokynmi Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na Nanjing Medical University. So zvieratami sa zaobchádzalo v súlade s normami lekárskej univerzity v Nanjing a usmerneniami publikovanými americkým Národným inštitútom zdravia.

Všetky tieto zvieratá prekonali ortotopickú transplantáciu ľavej obličky. Potkany Lewis boli použité ako príjemcovia a syngénni darcovia (skupina Syn), potkany F344 ako alogénni darcovia (skupina Allo). Súčasne bola vyrezaná pravá oblička. Priemerná doba studenej ischémie bola menej ako 20 minút a teplá ischémia bola menej ako 35 minút. Cyklosporín A (5 mg/kg, QD, IP; Neoral, Novartis, Švajčiarsko) sa používal počas 14 dní, aby sa predišlo akútnemu odmietnutiu,

Farmaceutická liečba a zber tkanív

Transplantované obličky z potkanov boli odobraté v 4., 8., 12. a 16. týždni po operácii. Vzorky tkaniva obličkového aloštepu zaliateho vo formalíne fixovaného v parafíne (10 percent neutrálneho formalínu) sa získali na histologické a IHC/IF farbenie. Zostávajúce obličky uložené v chladničke pri teplote -80 stupňov na detekciu RNA a proteínu.

HE a Masson Trichrome Staining Assay

Protokoly testu farbenia HE a Masson trichrómom možno uviesť v našich predchádzajúcich štúdiách (5). Na identifikáciu závažnosti CAD a rozsahu fibrotickej oblasti sa oblasť fibrózy renálneho aloštepu kvantifikovala farbením trichrómom podľa Massona. Pre každý rez bolo vybraných päť náhodných vizuálnych polí pod x 400 mikroskopmi. Plochu pozitívnu na Massonov trichróm merali dvaja patológovia zaslepení experimentálnym dizajnom pomocou Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD).

Imunohistochemický test farbenia

Obličkové tkanivá fixované formalínom boli narezané na parafínové rezy s hrúbkou 3 mm. Proces deparafinizácie, hydratácie a získania antigénu bol v súlade s našimi predchádzajúcimi štúdiami (5). Protilátky [anti‐ATG16L (1:100; Abcam, USA), anti‐a‐ SMA (1:200; Abcam, USA), anti‐Fibronektín (1:100; Abcam, USA) a anti-CD31 (1:100; CST, USA)] boli inkubované cez noc pri 4 stupňoch po sekciách blokovaných 10-percentným normálnym somárskym sérom. Ďalšie kroky sa tiež uskutočnili, ako je opísané vyššie, s biotinylovaným kozím anti-myším/králičím IgG (0,5 mg/ml;

Abcam) a substrát 3-amino{1}}etylkarbazol alebo 3,3′

diaminobenzidín (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Zafarbené sklíčka boli fotografované pomocou mikroskopu Nikon Eclipse 80i vybaveného digitálnym fotoaparátom (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, Čína).

Skúška nepriameho imunofluorescenčného farbenia

Po fixácii 4-percentným roztokom formaldehydu boli rezy obličkového aloštepu a bunkové lezecké rezy penetrované 0,1% Tritonom X-100 počas 1 hodiny, potom blokované 5-percentným kozím sérom počas 1 hodiny. Potom boli rezy a rezy na šplhanie po bunkách inkubované s anti‐ NF-kB p65 (1:200; Abcam, USA) pri 4 stupňoch cez noc. Podmienky inkubácie sekundárnej protilátky Dapi sa môžu odvolávať na naše predchádzajúce štúdie (5). Sklíčka boli prezerané fluorescenčným mikroskopom Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, Čína).

Detekcia autofagického toku

AAV-mRFP-GFP-LC3 (Hanbio, Shanghai, Čína) bol stereotakticky injikovaný do ľavej obličky potkanov Lewis (3 ml) 14 dní pred transplantáciou. Oblička bola odstránená 4, 8, 12, 16 týždňov po transplantácii a fixovaná 4 percentným paraformaldehydom počas 24 hodín. Sklíčka (30 mm) boli prezerané fluorescenčným mikroskopom Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, Čína). Žlté škvrny označujú autofagozómy a červené škvrny označujú autolyzozómy. Keď je červený signál silnejší ako žltý signál, ktorý predstavuje autofagický tok, aktivuje sa. Keď viac žltých signálov ako červených signálov predstavuje autofagický tok, je narušený.

Elektrónová mikroskopia

Vzorky boli fixované ľadovo studeným glutaraldehydom (3 percentá v 0,1 M kakodylátovom pufri, pH 7,4) a ďalej spracované v Core Facility (Service, Wuhan, Čína). Pozorovanie sa uskutočnilo na JEOL JEM-2100 transmisnom elektrónovom mikroskope.

Detekcia funkcie obličiek

Na zistenie koncentrácií kreatinínu v krvi potkanov a močovinového dusíka podľa pokynov výrobcu sme použili súpravu QuantiChrom Creatinine Assay Kit a súpravu QuantiChrom Urea Assay Kit (Jiancheng, Peking, Čína).

Detekcia proteínu Uria

Vzorky moču za 24 hodín sa odoberali pomocou metabolických klietok a vylučovanie proteínov močom sa testovalo pomocou komerčnej súpravy (Mlbio, Shanghai, Čína) podľa pokynov výrobcu.

Hodnotenie PCR v reálnom čase

Stručne, celková RNA sa purifikovala z HRGEC pomocou súprav na extrakciu RNA (TIANGEN, Peking, Čína). cDNA (cDNA) bola syntetizovaná tak, ako bolo opísané vyššie (5). Génová expresia sa merala testom PCR v reálnom čase (Vazyme) a systémom DNA Engine Opticon 2 (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Sekvencie primérov boli opísané nasledovne:

IL-1 b: 5′‐ TTCCTGTTGTCTACACCAATGC‐3′ (F) 5′‐CGGGCTTTAAGTGAGTAGGAGA‐3′ (R);

IL-6: 5′‐TCCTCTCCGCAAGAGACTTCCA‐3′ (F)

5′‐ ATACTGGTCTGTTGTGGGTGG‐3′ (R);

TNF-a: 5′‐ CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG‐3′ (F) 5′‐ GAGGACCTGGGAGTAGATGAG ‐3′ (R);

Aktín: 5′‐ TGACGTGGACATCCGCAAAG‐3′ (F) 5′‐ CTGGAAGGTGGACAGCGAGG‐3′ (R);

Western Blot a Elisa Assay

Stručne povedané, proteíny z buniek a tkanív boli extrahované v RIPA pufri (Thermo ScientificTM, Chelmsford, MA, USA) obsahujúcom fosfatázy a koktaily inhibítorov proteáz (Sigma, St Louis, MO, USA). Proteíny (20 mg) sa preniesli na PVDF membránu (Millipore, IPVH00010, Massachusetts, USA) po SDS-PAGE. Sklíčka sa inkubovali v blokovacom roztoku (5 percent odtučnené mlieko) počas 60 minút a potom sa membrána PVDF inkubovala s primárnou protilátkou bez umývania v chladnej miestnosti cez noc. Potom bol proces premytia PVDF membrány tris pufrovaným fyziologickým roztokom-tween (TBST), inkubovaný sekundárnou protilátkou, ECL tabletovanie a exponovaný v súlade s našimi predchádzajúcimi štúdiami (5). Primárne protilátky boli uvedené nasledovne: anti‐GAPDH (1:1000; CST, USA), anti‐CD31 (1:1000; CST, USA), anti‐a‐SMA (1:1000;

Abcam, USA), anti-fibronektín (1:1000; BD Biosciences, USA),

anti‐LC3 (1:1000; CST, USA), anti-ATG16L (1:1000; CST, USA),

anti‐NF-kB p65 (1:1000; CST, USA), anti‐ Phospho-NF-kB p65 (1:1000; CST, USA). Kvantifikácia sa uskutočnila meraním intenzity signálov pomocou softvéru na analýzu obrazu NIH. MAP1LC3 sa detegoval pomocou súpravy ELISA (ml000829, Mlbio, Čína) podľa pokynov výrobcu.

Bunková kultúra, liečba a transfekcia shRNA

Ľudské renálne glomerulárne endotelové bunky (HRGEC) sa kultivovali v médiu pre endotelové bunky (ECM, ScienCell Research Laboratories Carlsbad, CA, USA) obsahujúcom 5 percent fetálneho hovädzieho séra. Nastavenie zariadenia Inkubátor CO2 Kultivujte HRGEC vo vlhkej atmosfére obsahujúcej 5 percent CO2 pri 37 stupňoch. Endotelové bunky sa uchovávali v médiu bez séra cez noc a potom sa ošetrili s IL-1b, IL-6 a TNF‐a počas rôznych hodín alebo rôznych koncentrácií.

Stabilná ATG16L-knockdown a ATG16L-overexpresia HRGEC boli skonštruované pomocou lentivírusu (Jikai, Shanghai, Čína). HRGEC boli najprv transfekované lipofektamínom 2000, potom transfekované 1,5 ml ATG16L shRNA vírusov alebo 2,0 ml ATG16L nadmerne exprimujúcich vírusov podľa protokolu výrobcu. Endotelové bunky sa potom preniesli do ECM obsahujúceho 2,0 ml polybrénu a inkubovali sa ďalších 6 hodín. Mieru infekcie vírusmi sme zistili pomocou fluorescenčného mikroskopu Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, Čína). Puromycín (2 ug/ml; Gibco, Thermo Fisher Scientific) sa použil na selekciu stabilných buniek infikovaných vírusom. Potom sa zhromaždili HRGEC na ďalšie experimenty.

Štatistická analýza

Na štatistickú analýzu bol použitý GraphPad Prism 5.{1}} (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Výsledky boli vyjadrené ako priemer ± SD (priemer ± SD) z aspoň troch nezávislých experimentov. Porovnanie medzi viacerými skupinami a v rámci nich sa uskutočnilo pomocou jednosmernej analýzy rozptylu, po ktorej nasledoval Student-Newman-Keulsov test. P hodnoty<0.05 were="" considered="">

VÝSLEDKY

Zmeny histomorfológie a patológie v obličkových tkanivách u pacientov bez CAD a CAD

V tejto štúdii histologické vyšetrenie hematoxylín-eozínom (HE) a Massonovým trichrómovým farbením preukázalo významný renálny aloštep IF/TA v tkanivách pacientov s CAD (n=4) v porovnaní s pacientmi s transplantovanou obličkou so stabilnou funkciou obličiek z nášho centra ( non-CAD skupina, n=4) (obrázky 1A, B). Vzorová zbierka materiálov a metód a Tabuľka 1 popisuje podrobné informácie o zoskupení pre pôvodné prvky. Imunohistochemické farbenie (IHC) vzoriek ľudskej renálnej biopsie preukázalo vyššiu expresiu a-SMA a fibronektínu (FN) a výrazne nižšiu expresiu CD31 v skupine CAD (obrázky 1C–H). CD31 je markerový proteín endotelových buniek a endotelové bunky stratili svoju vlastnosť CD31, ale získali mezenchymálne vlastnosti, ako je a-SMA, FN, keď dôjde k EndMT. Tieto výsledky ukázali, že expresie EndMT markerov boli výrazne vyššie v skupinách CAD v porovnaní so skupinou bez CAD.

ATG16L sa zvýšil po transplantácii obličky, ale ATG16L bol znížený u pacientov s CAD v porovnaní s pacientmi bez CAD

RNA-seq a klinické údaje z 25 vzoriek CAD a 21 vzoriek tkaniva obličkových biopsií pacientov bez CAD boli stiahnuté z GSE9493. Informácie o pacientoch v databáze boli zaznamenané v Novartis Institutes for BioMedical Research vo Švajčiarsku a spracované na histopatológiu. Histologická diagnóza a klasifikácia biopsie na základe kritérií Banff '05. Demografické a klinické údaje sú uvedené v databáze GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc= GSE9493). Schematický diagram toku analýz bol znázornený na obrázku 2A. S P-hodnotou bolo extrahovaných 1463 významných diferenciálnych génov<0.05. using="" the="" criteria="" for="" [log2="" fold="" change="" (log2fc)]=""> 1, we selected 92 up-regulated and 115 down-regulated differential genes from the CAD group compared to the non-CAD group (Figure 2B). Then we searched genes associated with autophagy in the GeneCards database. A total of 149 ARGs with a relevance score >Vybraných bolo 7. V ARG pacientov s CAD a non-CAD bolo zahrnutých 14 ARG. Medzi nimi sme zistili, že ATG16L, ktorý získal najvyššie skóre relevantnosti, bol downregulovaný vo vzorkách CAD (obrázok 2C).

Aby sme sa vyhli efektu šarže a rozdielom v populácii, vykonali sme sériu experimentov s použitím ľudských vzoriek z nášho centra, aby sme potvrdili výsledky verejnej databázy. V prvom súbore sme zafarbili rezy normálnych, non-CAD a CAD obličkových vzoriek protilátkou anti-ATG16L a preukázali sme, že expresia ATG16L bola významne znížená u pacientov s CAD v porovnaní so skupinou bez CAD (obrázok 2E) . Rovnaký záver bol dosiahnutý testom Western blot (WB). Nárast FN predstavoval zhoršenú úroveň fibrózy transplantovaných obličiek a jeden z indikátorov ICHS. Tendencia WB ATG16L bola zhodná s výsledkami nášho overenia farbenia IHC a konzistentná s výsledkami v GEO (obrázok 2D). To naznačuje, že expresia ATG16L bola namiesto toho znížená s progresiou CAD. Pri vykonávaní Pearsonovej korelačnej analýzy sme zistili, že ATG16L mal silnú negatívnu koreláciu vo vzorci expresie a-SMA, FN proteínov a pozitívnu koreláciu s expresiou CD31. „r“ predstavuje hodnotu Pearsonovej korelácie a hodnoty P označujú významnosť korelácie (obrázky 2F–I).

Autofágia bola downregulovaná u pacientov s CAD a downregulácia MAP1LC3 predpokladala zlú prognózu u pacientov s CAD

V predchádzajúcom experimente bolo z databázy GEO identifikovaných niekoľko ARG, ktoré regulujú autofágiu. Medzi nimi je ATG16L zapojený do skorého kroku autofágie, špekulujeme o možnosti, že autofágia by sa mohla podieľať na CAD. Na preskúmanie hladín autofágie v tkanivách ľudského obličkového aloštepu sme najprv našli menej autofagických vakuol v skupine CAD prostredníctvom transmisného elektrónového mikroskopu (TEM) v porovnaní so skupinou bez CAD (obrázky 3A, B). Okrem zlatého štandardu TEM na monitorovanie autofágie, znížené hladiny SQSTM1 a zvýšenie expresie LC3-II odzrkadľujú zvýšenie autofágie. Podobné trendy hladín proteínovej expresie LC3-I (nelipidácia LC3), LC3-II (lipidácia LC3) a SQSTM1 v skupine CAD boli overené testom WB, ako je znázornené na obrázkoch 3C, D. P62/SQSTM1 (SQSTM1) je selektívny autofágový receptor a je degradovaný autofágiou. Autofagozómy sú spojené s lipidáciou cytosolickej formy LC3 a tvorbou LC3-II. Výsledky WB teda tiež naznačujú, že dochádza k autofágii.

Niektoré štúdie ukázali, že existujú rozdiely v ARG v sére pacientov po transplantácii obličky; hladina LC3 v sére bola pravdepodobne prognostickým ukazovateľom korelujúcim so závažnosťou ochorenia (25, 26). Aby sme ďalej preskúmali úlohu autofágie v procese CAD, skúmali sme koncentráciu LC3 v sére 30 pacientov bez CAD a 30 pacientov s CAD pomocou enzýmového imunosorbentného testu (ELISA). Demografické údaje predstavujúce základné črty pacientov boli v tabuľke 1. Distribúcia počtu prípadov, pohlavia pacienta, veku pacienta, panelových reaktívnych protilátok (PRA), imunosupresívneho režimu, renálnych funkcií v skupinách bez CAD a CAD boli uvedené v tabuľke 1. Pohlavie, vek a PRA nevykazovali žiadne veľké rozdiely. Medzi týmito dvoma skupinami bol významný rozdiel v sérovom kreatiníne a dusíku močoviny v krvi (BUN). Potom sme sa pokúsili určiť prognostickú hodnotu autofágie u pacientov s CAD. Prostredníctvom výsledkov sérovej ELISA sme zistili, že expresia LC3 bola nižšia v skupine CAD. Vyskytla sa tiež progresívna CAD a súčasný pokles hladiny LC3 (obrázok 3E). Okrem toho sme rozdelili LC3 na skupiny s vysokou a nízkou expresiou na základe mediánu, analýzy prežitia, výsledky odhalili, že skupina s nízkou expresiou LC3 mala kratší čas dysfunkcie aloštepu (obrázok 3F). Celkovo sme špekulovali, že nedostatok autofágie má významnú súvislosť s progresiou CAD.

Downregulácia ATG16L znížila autofágiu a podporila progresiu EndMT

Aby sme určili, či sa ATG16L podieľa na zmene autofágie, najprv sme transfekovali HRGEC s ATG16L krátkou vlásenkovou RNA (shRNA). TEM sa použil na priamu demonštráciu tvorby autofagických vakuol a zistili sme, že v bunkách transfekovaných ATG16L shRNA je menej autofagických vakuol v porovnaní s tými, ktoré boli transfekované scramble shNC (obrázky 4A, B). Expresia proteínu ATG16L aj aktivita autofágy boli tiež znížené pri znižovaní skupiny ATG16L v porovnaní so skupinou shNC (obrázok 4C).

Potom sa skúmala úloha autofágie závislej od ATG16L v progresii EndMT. HRGEC boli transfekované ATG16L shRNA alebo shNC. Obrázok 4D ukázal, že transfekcia ATG16L shRNA by mohla výrazne uľahčiť expresiu FN a a-SMA a znížiť expresiu CD31 v porovnaní s HRGEC transfekovanými shNC. Na rozdiel od toho, keď bol ATG16L nadmerne exprimovaný v HRGEC, progresia EndMT sa významne nepodporovala (obrázok 4E). Výsledky farbenia IHC tiež potvrdili trendy WB pre expresiu CD31 a a-SMA v HRGEC (obrázok 4F).

Zmeny renálnej intersticiálnej fibrózy, proteínov v moči, renálnej funkcie a časovo závislé zvýšenia EndMT v modeli potkanov s chronickou rejekciou

Ďalej sme skúmali zmeny v renálnej intersticiálnej fibróze, proteínu v moči, renálnej funkcii a EndMT in vivo. Modely chronickej rejekcie s transplantovanou obličkou u potkanov sa vytvorili transplantáciou obličky od potkanov F344 potkanom Lewis. Renálne aloštepy sa odobrali v 8., 12. a 16. týždni po transplantácii obličky. Testy farbenia HE a Massonovho farbenia ukázali rôzne stupne infiltrácie zápalových buniek, glomerulosklerózu, tubulárnu atrofiu a intersticiálnu fibrózu po transplantácii obličky. Výsledky farbenia podľa Massona tiež ukázali veľké množstvo modro sfarbených kolagénových vlákien v glomerulárnom a renálnom interstíciu v 8., 12., 16. týždni po transplantácii obličky v porovnaní so skupinou syn (obrázky 5A–C). Aby sa otestovala funkcia obličiek potkanov s alogénnym transplantátom, pôvodné pravé obličky sa počas transplantácie obličky exstirpovali. Štyri týždne po resekcii pravej obličky sa 24-hodinový močový proteín a renálne funkcie vrátane sérového kreatinínu a BUN postupne zhoršovali vo všetkých skupinách až do ich smrti (obrázok 5D). Výsledky testu IHC odhalili vysoké expresie FN a a-SMA, zatiaľ čo expresia CD31 sa znížila vo všetkých skupinách po 16 týždňoch (obrázok 5E). Western blot test potvrdil výsledky imunohistochemického testu a ukázal, že progresia EndMT sa zintenzívnila s predĺžením času po transplantácii obličky (obrázok 5F).

Transplantácia obličiek aktivovaná autofágia, ale narušený autofagický tok v neskorom štádiu modelu potkana s chronickou rejekciou

LC3, ktorý sa považuje za definovaný marker pre autofágiu, je rozhodujúci pre tvorbu autofagozómov a aktiváciu autofagického toku. Adeno-asociovaný vírus (AAV)-mRFP-GFP-LC3 bol injikovaný do obličkového aloštepu potkana in vivo stereotakticky. Vytvárame model mRFP-GFP-LC3 s cieľom monitorovať autofagickú aktivitu pri transplantácii obličky. AAV- mRFP-GFP-LC3 sa zvyčajne používa na monitorovanie autofagického toku in vivo. GFP signál má vyššiu citlivosť na kyslé podmienky lyzozomálneho lúmenu ako mRFP. Autofagozómy teda vykazovali žltú fluorescenciu kvôli spoločnému umiestneniu fluorescencie GFP a mRFP a autolyzozómy vykazovali červenú fluorescenciu. Zvýšenie červenej fluorescencie naznačovalo akumuláciu autolyzozómov a aktiváciu autofágie v obličkách. Pozitívne oblasti červenej fluorescencie sa významne zvýšili v týždňoch 4, 8, 12 a 16 v skupine allo v porovnaní so skupinou syn. Červená bodka však po dosiahnutí vrcholu v 8. a 12. týždni rýchlo zoslabla. Zmeny v úrovni autofágie sa pozorovali hlavne v glomerulárnych a periférnych malých cievach, a nie v distálnych tubuloch alebo zbernom kanáli (obrázky 6A, B). Tieto výsledky odhalili, že autofágia bola aktivovaná v skorých štádiách transplantácie obličky, ale nie v neskorých štádiách, a autofagozómový klírens bol narušený po približne 8 týždňoch. Imunohistochemický test preukázal, že expresia ATG16L bola vyššia za 8 týždňov ako za 16 týždňov (obrázok 6C). Výsledky Western blot tiež ukázali, že hladiny LC3-II a ATG16L dosiahli vrchol po 8 týždňoch a potom postupne klesali až do 16. týždňa v aloštepových obličkách potkanov po transplantácii (obrázok 6D).

Cesta NF-kB bola aktivovaná a propagovaná EndMT po vyradení expresie ATG16L

Vo svetle asociácie medzi downreguláciou ATG16L a EndMT v modeli chronickej rejekcie potkanov a ochorením CAD sme predpokladali, že strata ATG16L by mohla priamo viesť k progresii EndMT. Aby sme ďalej preskúmali potenciálny mechanizmus, ktorým k tejto progresii dochádza, najprv sme vykonali úplné transkriptómové sekvenovanie (RNA-seq) v HRGEC s ShNC alebo ShATG16L. Celkovo sa medzi týmito dvoma skupinami získalo 453 diferenciálnych génov (DEG). Medzi nimi bolo 358 stupňov up-regulovaných a 95 bolo down-regulovaných (obrázok 7A). Potom sa pomocou KEGG obohatenia významne vybralo 20 ciest. Zistili sme, že dráha NF-kB bola jednou z dráh, ktoré boli významne aktivované (obrázok 7B). Upregulácia génov dráhy NF-kB bola tiež potvrdená analýzou obohatenia génovej sady (GSEA) (obrázok 7C).

NF-kB je jedným z rozhodujúcich transkripčných faktorov pre zápalové signálne dráhy a NF-kB sa po aktivácii premiestni z cytoplazmy do jadra. Aby sme potvrdili aktiváciu NF-kB a jadrovú translokáciu, vykonali sme test imunofluorescenčného farbenia s použitím protilátky anti-p65 a zistili sme, že p65 a jadrové farbivo boli kolokalizované, čo indikovalo jadrovú translokáciu (obrázok 7D). Okrem toho sme zistili, že QNZ, inhibítor signálnej dráhy NF-kB, významne inhiboval expresiu NF-kB v jadre a zvrátil expresiu proteínov súvisiacich s EndMT indukovanú knockdownom ATG16L (obrázok 7E).

Uskutočnil sa aj WB test na overenie špecifického mechanizmu aktivácie NF-kB dráhy. Detegovali sme kvantifikáciu p65 (celkový NF-kB) a p-p65 (fosforylovaný NF-kB) v HRGEC. Výsledky WB ukázali, že hladina p65 bola zvýšená v skupine ShATG16L v porovnaní so skupinou ShNC, zatiaľ čo p-p65 sledoval podobný rastúci trend (obrázok 7F). Zvýšenie hladiny p-p65 v HRGEC po knockdown ATG16L bolo sprevádzané zvýšením celkovej expresie proteínu p65, čo pravdepodobne odrážalo ďalší účinok na expresiu p65 v HRGEC. Aby sa zistilo, či je stabilizácia NF-kB spôsobená zníženou degradáciou alebo zvýšenou syntézou, k bunkám sa pridal inhibítor syntézy proteínov cykloheximid (CHX) na inhibíciu syntézy proteínov a analyzovala sa hladina proteínu NF-kB. Výsledky Western blotu ukázali, že v prítomnosti CHX je pokračujúca expresia proteínu p65 (obrázok 7G). Medzitým hladiny NF-kB mRNA ešte neboli významne zmenené pomocou ShATG16L. Kvantitatívne údaje pre hladiny NF-kB mRNA sú graficky znázornené na obrázku 7H. To naznačuje, že jadrová translokácia NF-kB bola spôsobená zníženou degradáciou, nie zvýšenou syntézou po knockdown ATG16L v HRGEC. Aby sme ďalej potvrdili expresiu NF-kB v ľudskom tkanive, vykonali sme imunofluorescenčný farbiaci test na tkanivách ľudského obličkového aloimplantátu a zistili sme, že hladina expresie p65 je signifikantne zvýšená v obličkových aloimplantátoch pacienta s CAD (obrázky 7I, J).

Sekrécia cytokínov indukovaná aktiváciou NF-kB dráhy, medzi nimi IL-1b, IL-6 a TNF‐a by mohli stimulovať progresiu EndMT v HRGEC

Signalizácia NF-kB je hlavným regulátorom zápalovej odpovede. Potom sme skúmali rozpustné faktory zodpovedné za EndMT indukovaný shATG16L pomocou RT-PCR. Medzi niekoľkými cytokínmi, ktoré sú relevantné pre autofágové defekty a zápalovú odpoveď, boli IL-1b, IL-6 a TNF-a, typické downstreamové zápalové faktory indukované dráhou NF-kB, významne zvýšené v porovnaní s HRGEC transfekovanými shNC počas narušenia autofágovej aktivity (obrázok 8A). To je v súlade s našimi predchádzajúcimi zisteniami zápalových faktorov, ako je TNF-a, zvýšenie séra potkanov s chronickou rejekciou (27).

Aby sme preskúmali patogenézu EndMT stimulovaného IL{{0}}b, IL-6 a TNF-a, ošetrili sme HRGEC rôznymi koncentráciami IL-1}b ({{ 7}}~20 ng/ml), IL-6 (0~200 ng/ml) a

TNF‐a ({{0}}~20 ng/ml) počas 24 hodín. Všetky IL-1b, IL-6 a TNF-a by mohli zvýšiť hladinu proteínu FN a a-SMA so súčasným poklesom markerov endotelových buniek CD31 v závislosti od dávky. Tieto účinky boli najvyššie, keď boli HRGEC liečené 10 ng/ml IL{9}}b, 200 ng/ml IL{11}} alebo 10 ng/ml TNF‐a (obrázok 8B). Uskutočnili sa aj experimenty s časovými závislosťami, aby sa potvrdili súvisiace výrazy EndMT. Ako je znázornené na obrázku 8B, liečba IL-1b, IL-6 alebo TNF-a počas 0~48 hodín mohla pozoruhodne indukovať expresiu FN a a-SMA a viedla k strate CD31 v HRGEC ako stimulačný čas sa zvyšuje. Aby sa otestovali účinky IL-1b, IL-6 a TNF-a na EndMT, liečba Anakinrou, Tocilizumabom a Infliximabom bola zahájená, keď sa zrazil ATG16L. Anakinra je antagonista receptora interleukínu-1 (IL-1R). Tocilizumab je IL-6R neutralizačná protilátka, ktorá blokuje väzbu IL-6 na IL-6R. Infliximab je monoklonálna protilátka IgG1, ktorá sa viaže špecificky na TNF-a a je inhibítorom TNF-a, ktorý sa úspešne používa pri liečbe zápalového ochorenia čriev. Výsledky WB ukázali, že Anakinra a Infliximab mohli výraznejšie znížiť EndMT (obrázok 8C). Tieto výsledky naznačujú, že strata ATG16L bola nielen znížená autofágovou aktivitou, ale tiež podporila sekréciu zápalových cytokínov IL-1b, IL-6 a TNF-a potlačením degradácie p65 na aktiváciu NF- kB dráha (obrázok 8D).

DISKUSIA

V tejto štúdii sme ukázali, že transplantácia obličiek narušila autofagický tok, ktorý bol spojený so zvýšením zápalovej odpovede, EndMT, a závažnosťou intersticiálnej fibrózy obličkových aloimplantátov. Hoci autofagická aktivita bola dočasne zvýšená v skorých štádiách transplantácie aloštepu, postupne sa znižovala v dôsledku straty ATG16L. Autofágia závislá od ATG16L by ako cytoprotektívny proces mohla zoslabiť intersticiálnu fibrózu transplantovanej obličky prostredníctvom regulácie EndMT indukovanej IL-1b, IL-6 a TNF-a. Podľa našich najlepších vedomostí je to prvá štúdia, ktorá objasňuje úlohu a dynamickú zmenu autofagického toku pri transplantácii obličky. V tejto štúdii sme tiež skúmali molekulárne patofyziologické detaily, ktoré sú základom spôsobu, akým poškodenie autofagického toku vedie k EndMT a intersticiálnej fibróze renálneho aloštepu.

Hoci mnoho typov výskumu uvádza, že autofágia sa podieľa na tvorbe a progresii renálnej intersticiálnej fibrózy, ARG neboli komplexne analyzované, aby sa preskúmala ich klinická hodnota pri progresii chronického odmietnutia obličkového štepu. S procesom autofágie sú spojené stovky proteínov. Vzhľadom na dôležitosť autofágie pri transplantácii obličiek je rozumné špekulovať, že ARG sú veľkým prísľubom v prognostickej predikcii a terapeutických cieľoch. Aby sme preskúmali pôvodné patogenetické faktory CAD, profilovali sme expresie mRNA 149 ARG v kohorte GSE9493 a dôrazne analyzovali 14 ARG, ktoré boli najviac spojené s autofágiou medzi pacientmi s CAD a pacientmi bez CAD. Medzi downregulovanými ARG v skupine CAD boli v skupine CAD downregulované autofágne negatívne regulačné gény, ako sú Raptor a MAPK3 (28, 29). Na druhej strane, ATG16L ako up-regulovaný ARG bol skafoldom pre lipidáciu LC3 dynamickou lokalizáciou do predpokladaných zdrojových membrán a podporou tvorby autofagických vakuol (30). Niektoré štúdie však ukázali, že ATG16L nebol potrebný na predĺženie izolačnej membrány (23). Preto sa študovala súvislosť medzi úlohou ATG16L a EndMT nezávislou od autofágy alebo závislou od autofágy.

Aby sme preskúmali súvislosť medzi ATG16L, autofágiou a EndMT v transplantovaných obličkách, zrazili sme ATG16L pomocou shRNA v HRGEC. Naše zistenia odhalili, že shATG16L by mohol znížiť hladiny autofágie a vyvolať EndMT. Podobne výskum in vivo a klinické vzorky tiež odhalili, že aktivácia ATG16L a autofagický tok v ranom štádiu transplantácie obličky, autofagický tok klesal v dynamickom rozsahu, keď sa fibrotické zmeny zvýšili. Možno dospieť k záveru, že dôvod progresie EndMT je pravdepodobne spôsobený znížením autofagického toku a autofágia závislá od ATG16L hrá ochrannú úlohu pri progresii EndMT a intersticiálnej fibrózy renálneho aloštepu. Niektoré zistenia však ukázali, že autofágia vyvolaná rapamycínom viedla k aktivácii EndMT v HCAEC za anoxických podmienok (22). Zdá sa, že sú odlišné od našich výsledkov. Domnievame sa, že úloha autofágie môže byť odlišná v rôznych typoch buniek. Mohlo by to byť závislé od bunkového kontextu a od regulačných faktorov. Vzhľadom na to, že autofágia závislá od ATG16L je prostriedkom vlastnej ochrany, keď sa EndMT vyskytuje v CAD, je zmysluplné určiť špecifický mechanizmus EndMT indukovaného shATG16L.

Vykonali sme sekvenovanie ďalšej generácie zo skupiny knockdown a kontrolnej skupiny ATG16L v HRGEC. KEGG dráhy a analýza GSEA odhalili, že dráha NF-kB bola jednou z najvýraznejšie obohatených dráh. NF-kB sa normálne viaže na IkB, čo stabilizuje NF-kB v cytoplazme. Keď je aktivovaná NF-kB dráha, NF-kB heterodimér p65 sa premiestni do jadra a viaže sa na svoj špecifický promótor (31). Jednou z kanonických (klasických) ciest pre nukleárnu translokáciu NF-kB je fosforylácia p65. Avšak pri rôznych chorobách bol zaznamenaný nárast počtu nekanonických ciest. Tiež sa uvádza, že potlačená selektívna autofágia sprostredkovaná p62/SQSTM{13}} by mohla znížiť lyzozomálnu degradáciu dráhy NF-kB (32), autofágový defekt tiež vedie k aktivácii NF-kB v dôsledku trvalej expresie SQSTM1, čo zase podporuje tumorigenéza u myších modelov (33). V našej štúdii sme pozorovali zvýšenie hladín proteínov p65 a p-p65, zatiaľ čo hladiny mRNA zostali nezmenené. V prítomnosti inhibítora syntézy proteínov CHX akumulácia proteínu p65 stále pokračuje v porovnaní s absenciou inhibítora. Preto sme špekulovali, že aktivácia NF-kB indukovaná knockdownom ATG16L je výsledkom zníženej degradácie proteínov a tento proces môže byť autofagicky závislá supresia degradácie.

Zápaly sú na klinickej a terapeutickej úrovni úzko prepojené s dôležitými následkami transplantácie obličiek (34). NF-kB p65 je najdôležitejším transkripčným faktorom v regulácii bunkových zápalových faktorov. V tejto štúdii sme tiež zistili, že zníženie ATG16L zvýšilo cytokín IL-1b, IL-6 a TNF-a prostredníctvom NF-kB dráhy. Toto a ďalšie zistenia súhlasia s mnohými ďalšími štúdiami, ako sú tie, ktoré dospeli k záveru, že strata ATG16L zvýšila produkciu IL{10}}b indukovanú endotoxínom (35) a TNFAIP3/A20 viaže ATG16L1 na kontrolu autofagickej reakcie, NF-kB aktivácia (36). Okrem toho v niektorých skorších štúdiách bola hlásená úloha zápalových cytokínov na EndMT. Napriek tomu je pravdepodobné, že tieto zápalové cytokíny hrajú rôznorodú úlohu v závislosti od základnej patológie a jej okolitých hladín. V myšom modeli obezity vyvolanej stravou spôsobil endoteliálny autofágový deficit EndMT závislý od IL (37). Pri vaskulárnom kalcifikačnom ochorení indukovali IL-1b a TNF-a EndMT v ľudských primárnych endotelových bunkách aorty (38). Naše výsledky skrínovali a identifikovali IL-1b, IL-6 a TNF-a ako podporujúce endMT zápalové cytokíny v patologických prostrediach CAD. Týmto sa skúmali vzájomné vzťahy medzi stratou ATG16L a zápalovými cytokínmi, aby sa zdôraznili možné terapeutické ciele na kontrolu straty ATG16L pri progresii CAD.

Náš výskum má niekoľko obmedzení. Súčasná validácia účinkov ATG16L na EndMT a progresiu fibrózy sa uskutočnila iba v modeli knockdown bunkovej línie, zložitosť autofágových zmien in vivo a vo vývoji CAD sa dá len ťažko napodobniť a zdôrazňuje potrebu endotelových myší s podmieneným knockoutom ATG16L . Vytvoríme model transplantácie obličky ATG16L knockout myší pre ďalšiu štúdiu mechanizmu. Naše výsledky ukázali, že strata ATG16L a autofágia podporili EndMT, QNZ inhiboval aktiváciu NF-kB a IL-1b, monoklonálna protilátka TNF-a antagonizovala špecifické receptory, čím spomalila fibrotický proces aloštepu, ale nemohla úplne zvrátiť tento výsledok. Či iné mechanizmy zohrávali podobnú úlohu, zostáva neznáme. Navyše, okrem endotelových buniek, zdroj myofibroblastov pozostáva z rôznych buniek, vrátane epitelových, fibroblastov a pericytov (39). Či strata ATG16L a autofágny deficit ovplyvňujú tieto bunky, je stále nepresvedčivé.

Na záver, súčasné štúdie preukázali, že knockdown ATG16L bol životne dôležitý pre poškodenie autofagického toku a tvorby EndMT indukovanej IL-1b, IL-6 a TNF‐a pri progresii transplantovanej renálnej intersticiálnej fibrózy . Táto funkcia bola sprostredkovaná NF-kB redukujúcim degradáciu a aktiváciu dráhy. Stručne povedané, výsledky našej štúdie poskytujú nový pohľad na dynamický vzťah autofagického toku a EndMT. Prevencia straty ATG16L a inhibícia autofágového toku by mohla byť novou možnosťou liečby a prevencie progresie renálnej intersticiálnej fibrózy a CAD u príjemcov s transplantovanou obličkou.

Stonka Cistanche zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

VYHLÁSENIE O DOSTUPNOSTI ÚDAJOV

Nespracované údaje podporujúce závery tohto článku budú sprístupnené autormi bez zbytočných výhrad.

ETICKÉ VYHLÁSENIE

Štúdie zahŕňajúce ľudských účastníkov preskúmala a schválila miestna etická komisia Prvej pridruženej nemocnice lekárskej univerzity Nanjing. Pacienti/účastníci poskytli svoj písomný informovaný súhlas s účasťou na tejto štúdii. Štúdia na zvieratách bola preskúmaná a schválená miestnou etickou komisiou Prvej pridruženej nemocnice lekárskej univerzity Nanjing. Od majiteľov sa získal písomný informovaný súhlas s účasťou ich zvierat v tejto štúdii.

AUTORSKÉ PRÍSPEVKY

RT a MG projekt dohliadali a koncipovali. ZG, CS a ZW navrhli a vykonali väčšinu experimentov. MZ a SF odobrali vzorky potkanov. LS, HC, ZH, JT, XJ a HY analyzovali údaje. ZG a ZW vytvorili čísla. ZG a RT tento dokument vypracovali a zrevidovali. Všetci autori prispeli k článku a schválili predloženú verziu.

FINANCOVANIE

Túto prácu podporila Národná nadácia pre prírodné vedy Číny [čísla grantov 82070769, 81870512, 81770751, 81570676, 81470981, 81100532].

LITERATÚRA

1. Carney EF. Transplantácia: Prínos prežitia z prijatia obličky od mŕtveho darcu diabetika. Nat Rev Nephrol (2017) 13(8):444. DOI: 10.1038/nrneph.2017.88

2. El-Husseini A, Aghil A, Ramirez J, Sawaya B, Rajagopalan N, Baz M a kol. Výsledok transplantácie obličky pri primárnej, opakovanej a obličke po nerenálnej transplantácii solídnych orgánov: 15-ročná analýza nedávnej databázy UNOS. Clin Transplant (2017) 31 (11). DOI: 10.1111/ctr.13108

3. Schinstock CA, Stegall M, Cosio F. Nové poznatky týkajúce sa chronického odmietnutia sprostredkovaného protilátkou a jeho progresie k transplantačnej glomerulopatii. Curr Opin Nephrol Hypertens (2014) 23 (6): 611–8. doi: 10,1097/MNH. 0000000000000070

4. Goldberg RJ, Weng FL, Kandula P. Akútna a chronická dysfunkcia aloštepu u príjemcov transplantácie obličky. Med Clin North Am (2016) 100 (3): 487-503. doi: 10.1016/j.mcna.2016.01.002

5. Wang Z, Han Z, Tao J, Wang J, Liu X, Zhou W a kol. Úloha endotelového-mezenchymálneho prechodu indukovaného TGF-beta1 pri intersticiálnej fibróze transplantovanej obličky. J Cell Mol Med (2017) 21 (10): 2359-69. doi: 10.1111/ skok.13157

6. An C, Jia L, Wen J, Wang Y. Zacielenie na fibroblasty získané z kostnej drene pre fibrózu obličiek. Adv Exp Med Biol (2019) 1165:305–22. doi: 10.1007/978-981- 13-8871-2_14

7. Cruz-Solbes AS, Youker K. Prechod z epitelu na mezenchym (EMT) a prechod z endotelu do mezenchymu (EndMT): Úloha a dôsledky pri fibróze obličiek. Výsledky Probl Cell Differ (2017) 60:345–72. doi: 10.1007/978- 3-319-51436-9_13

8. Yang J, Antin P, Berx G, Blanpain C, Brabletz T, Bronner M a kol. Pokyny a definície pre výskum epitelovo-mezenchymálneho prechodu. Nat Rev Mol Cell Biol (2020) 21 (6): 341–52. doi: 10,1038/s41580-020-0237-9

9. Zeisberg EM, Potenta SE, Sugimoto H, Zeisberg M, Kalluri R. Fibroblasty pri fibróze obličiek vznikajú prechodom z endotelu na mezenchým. J Am Soc Nephrol (2008) 19 (12): 2282–7. doi: 10.1681/ASN.2008050513

10. Di Gregorio J, Robuffo I, Spalletta S, Giambuzzi G, De Iuliis V, Toniato E a kol. Epitelový-mezenchymálny prechod ako možný terapeutický cieľ pri fibrotických poruchách. Front Cell Dev Biol (2020) 8:607483. doi: 10.3389/ padol.2020.607483

11. Kardinál H, Dieude M, Hebert MJ. Endoteliálna dysfunkcia pri transplantácii obličiek. Front Immunol (2018) 9:1130. DOI: 10.3389/fimmu.2018. 01130

12. Zhao Y, Cooper DKC, Wang H, Chen P, He C, Cai Z a kol. Potenciálna patologická úloha prozápalových cytokínov (IL-6, TNF-alfa a IL-17) pri xenotransplantácii. Xenotransplantácia (2019) 26(3):e12502. doi: 10.1111/Xen.12502

13. Zhao C, Xu Z, Wang Z, Suo C, Tao J, Han Z a kol. Úloha tumor nekrotizujúceho faktora alfa pri prechode epitelu na mezenchym v transplantovaných obličkových bunkách u príjemcov s chronickou dysfunkciou aloštepu. Gene (2018) 642:483–90. DOI: 10.1016/j.gene.2017.11.059

14. Zhang B, Niu W, Dong HY, Liu ML, Luo Y, Li ZC. Hypoxia indukuje endoteliálny mezenchymálny prechod pri prestavbe pľúcnych ciev. Int J Mol Med (2018) 42 (1): 270-8. doi: 10.3892/ijmm.2018.3584

15. Li J, Zhang Q, Ren C, Wu X, Zhang Y, Bai X a kol. Nízkointenzívny pulzný ultrazvuk zabraňuje oxidačným stresom indukovaným endotelovo-mezenchymálnym prechodom v endotelových bunkách ľudskej aorty. Cell Physiol Biochem (2018) 45 (4): 1350–65. doi: 10.1159/000487561

16. Guan Q, Nguan CY, Du C. Expresia transformujúceho rastového faktora-beta1 obmedzuje renálne ischemicko-reperfúzne poškodenie. Transplantácia (2010) 89(11):1320– 7. doi: 10.1097/TP.0b013e3181d8e9dc

17. Levine B, Kroemer G. Biologické funkcie autofágových génov: perspektíva chorôb. Bunka (2019) 176(1-2):11–42. DOI: 10.1016/j.cell.2018.09.048

18. De Rechter S, Decuypere JP, Ivanova E, van den Heuvel LP, De Smedt H,

Levtchenko E, a kol. Autofágia pri ochoreniach obličiek. Pediatr Nephrol (2016) 31 (5): 737–52. doi: 10,1007/s00467-015-3134-2

19. Li H, Peng X, Wang Y, Cao S, Xiong L, Fan J a kol. Atg5-sprostredkovaný autofágový deficit v proximálnych tubuloch podporuje zastavenie G2/M bunkového cyklu a renálnu fibrózu. Autofágia (2016) 12(9):1472–86. doi: 10.1080/ 15548627.2016.1190071

Baisantry A, Bhayana S, Rong S, Ermeling E, Wrede C, Hermann J a kol. Autofágia indukuje prosenescentné zmeny v proximálnych tubulárnych segmentoch S3. J Am Soc Nephrol (2016) 27 (6): 1609–16. doi: 10.1681/ASN.2014111059