In Silico dizajn promiskuitnej chimérickej multiepitopovej vakcíny proti Mycobacterium tuberculosis časť 1

Abstraktné

Tuberkulóza (TBC) je celosvetovou hrozbou pre zdravie a každý rok zabíja približne 1,5 milióna ľudí. Eradikácia Mycobacterium tuberculosis, hlavného pôvodcu TBC, je čoraz náročnejšia v dôsledku objavenia sa rozsiahlych kmeňov odolných voči liekom. Očkovanie sa považuje za účinný spôsob ochrany hostiteľa pred patogénmi, ale jediná klinicky schválená vakcína proti TBC, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), má u dospelých obmedzenú ochranu. Zistilo sa, že multiepitopové vakcíny zvyšujú imunitu voči chorobám selektívnym kombinovaním epitopov z niekoľkých kandidátskych proteínov.

Tuberkulóza je infekčné ochorenie spôsobené baktériou Mycobacterium tuberculosis, ktoré postihuje najmä pľúca, ale môže postihnúť aj iné orgány. Imunita hrá dôležitú úlohu pri rozvoji a liečbe TBC.

V prípade nedostatočnej imunity môže Mycobacterium tuberculosis ľahko napadnúť ľudský organizmus a rozvinúť sa v tuberkulózu. Napríklad oslabený imunitný systém v dôsledku určitých chorôb alebo liečebných postupov zvyšuje riziko infekcie TBC. Okrem toho faktory ako podvýživa, nízka kvalita života a nadmerný stres môžu oslabiť imunitu, čo vedie k rozvoju TBC.

Pre prevenciu tuberkulózy je preto veľmi dôležité udržanie dobrého zdravia a posilnenie imunity. Imunitu je možné posilniť zdravou stravou, pravidelným životným štýlom, správnym cvičením a dostatkom spánku, čím sa dá účinne znížiť riziko nakazenia sa rôznymi chorobami vrátane tuberkulózy.

Imunita je dôležitá aj pre liečbu a zotavenie, keď sa už TBC vyskytla. Čím silnejší je imunitný systém, tým účinnejšie sa telo dokáže brániť napadnutiu bacilom TBC a produkovať dostatok protilátok na boj s chorobou. Preto udržiavanie primeranej výživy, správne cvičenie a pozitívny prístup môžu zlepšiť imunitu a podporiť zotavenie.

Na záver, medzi imunitou a TBC existuje silný vzťah. Udržanie dobrého zdravia a posilnenie imunity je jedným z dôležitých spôsobov prevencie a liečby tuberkulózy. Postavme sa k životu pozitívne, udržujme si zdravý životný štýl a vyhýbajme sa chorobám. Z tohto hľadiska si musíme zlepšiť imunitu. Cistanche môže výrazne zlepšiť imunitu, pretože mäsový popol obsahuje rôzne biologicky aktívne zložky, ako sú polysacharidy, dve huby, Huang Li atď. Tieto zložky dokážu stimulovať imunitný systém Rôzne typy buniek v systéme, zvyšujú ich imunitnú aktivitu.

Kliknite na zdravotné prínosy cistanche

Cieľom tejto štúdie bolo navrhnúť multiepitopovú vakcínu proti TBC s použitím imunoinformatického prístupu. Prostredníctvom funkčného obohatenia sme identifikovali osem proteínov vylučovaných M. tuberculosis, ktoré sú buď potrebné pre patogenézu, secernované do extracelulárneho priestoru, alebo oboje. Potom sme analyzovali epitopy týchto proteínov a vybrali sme 16 pomocných T lymfocytových epitopov s aktivitou indukujúcou interferón, 15 cytotoxických T lymfocytových epitopov a 10 lineárnych Bcell epitopov a konjugovali sme ich s adjuvans a Pan HLA DR-viažucim epitopom (PADRE) s použitím vhodných linkery.

Okrem toho sme predpovedali terciárnu štruktúru tejto vakcíny, jej potenciálnu interakciu s Toll-Like Receptor-4 (TLR4) a imunitnú odpoveď, ktorú by mohla vyvolať. Výsledky ukázali, že táto vakcína mala silnú afinitu k TLR4, ktorý by mohol významne stimulovať bunky CD4 plus a CD8 plus k sekrécii imunitných faktorov a B lymfocytov k sekrécii imunoglobulínov, aby sa získala dobrá humorálna a bunková imunita. Celkovo sa predpokladalo, že tento multiepitopový proteín je stabilný, bezpečný, vysoko antigénny a vysoko imunogénny, čo má potenciál slúžiť ako globálna vakcína proti TBC.

1. Úvod

Tuberkulóza (TBC), vysoko nákazlivé ochorenie spôsobené Mycobacterium tuberculosis, je Svetovou zdravotníckou organizáciou (WHO) hodnotená ako najčastejšia príčina úmrtia na jeden infekčný agens [1–3]. V roku 2021 dosiahol odhadovaný počet úmrtí na TBC 1,6 milióna a nových prípadov 10,6 milióna [4]. V súčasnosti je klinická liečba TBC relatívne vzácna a používa sa najmä kombinácia viacerých antimikrobiálnych liekov.
Tento cyklus chemoterapie je veľmi dlhý, zvyčajne trvá deväť až dvanásť mesiacov alebo aj dlhšie [5], čo zvyšuje riziko liekovo-rezistentných mutácií u M. tuberculosis [6,7]. V posledných rokoch sa chemoterapia stala menej účinnou v dôsledku objavenia sa a zvyšujúceho sa podielu M. tuberculosis, ktorý je značne rezistentný na lieky [6]. Prevencia rozvoja TBC môže byť účinnejšia ako jej liečba. Očkovanie je dobre známe ako účinný spôsob ochrany hostiteľa pred patogénnymi baktériami [8].

V súčasnosti je Bacillus Calmette-Guérin (BCG), vyvinutý pred viac ako 100 rokmi, jedinou klinicky schválenou vakcínou proti TBC [9]. Bohužiaľ, BCG chráni iba novorodencov a dojčatá a je do značnej miery neúčinný proti dospievajúcim a dospelým [2,10], hoci WHO uvádza, že 89 percent prípadov TBC v roku 2021 boli dospelí [4]. Preto existuje naliehavá potreba vyvinúť novú a účinnú vakcínu proti TBC, najmä pre dospievajúcich a dospelých.

Vývoj vakcíny proti TBC je komplikovaný mnohými vlastnosťami mykobaktérií, ako je latentná infekcia, perzistencia a únik imunity [11–13]. Ideálna vakcína proti TBC by mala byť navrhnutá tak, aby sa zamerala na proteíny/cesty zodpovedné za tieto vlastnosti u M. tuberculosis a aby bola schopná účinne indukovať imunitné reakcie sprostredkované CD4 plus a CD8 plus T bunkami [14].

Okrem toho by sa účinná vakcína mala zamerať aj na hlavné histokompatibilné komplexy hostiteľa (MHC), ktoré sú vysoko polymorfné [15]. Tieto vlastnosti kladú veľmi vysoké požiadavky na všestrannosť vakcíny, ktorú samozrejme nemožno dosiahnuť jediným prírodným proteínom. Multiepitopová vakcína, rekombinantný proteín pozostávajúci zo série prekrývajúcich sa epitopov (peptidov) [16], je novým typom kandidátskej vakcíny, ktorá môže riešiť vyššie uvedené problémy.

V posledných rokoch priťahujú multiepitopové vakcíny veľkú pozornosť vďaka ich výhodám vyššej imunity a nižšej alergénnosti ako konvenčné vakcíny [17,18]. V súčasnosti boli vyvinuté multiepitopové vakcíny proti mnohým patogénnym mikroorganizmom, vrátane Shigella spp. [19], vírus slintačky a krívačky [20], Helicobacter pylori [21,22], vírus hepatitídy B [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], vírus Nipah [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28] a vírus leukózy [29].

Najmä výskyt pandémie COVID{0}} posilnil používanie tejto technológie [16,30–32]. Pokiaľ ide o TBC, niekoľko multiepitopových vakcín bolo navrhnutých tak, aby boli zamerané na inherentne aktívnu TBC [33–39] a latentnú TBC [40,41]. Spomedzi nich boli traja kandidáti na vakcínu navrhnutí vo forme DNA [34,36,40] a dvaja z nich začlenili epitopy do proteínových skeletov na vytvorenie rekombinantných vakcín [34,36].

Treba poznamenať, že kandidátne proteíny pre niektoré z vyššie uvedených multiepitopových vakcín sú vybrané náhodne a pokrytie populácie týmito vakcínami vyžaduje ďalšie štúdie.

Okrem toho boli navrhnuté dva multiepitopové kandidátske vakcíny proti TBC so širokým pokrytím populácie, jeden epitop bol vybraný z imunogénnych exozómových vezikulových proteínov s patogénnymi vlastnosťami [39] a druhý sa nezameriava na kandidátne proteíny, ale priamo vyberá vysoko konzervované a experimentálne overené epitopy z databázy imunitných epitopov (IEDB) [38]. Týmto kandidátskym proteínom však chýba funkčné obohatenie a schopnosť kandidátov vakcíny indukovať sekréciu interferónu (IFN-) je potrebné zlepšiť.

Predchádzajúca štúdia dospela k záveru, že racionálnu optimalizáciu epitopov možno dosiahnuť kombináciou väzbovej kapacity MHC a schopnosti epitopu reagovať s receptormi T buniek [42]. Okrem toho predpovedali, že vakcíny s cytotoxickými T lymfocytmi (CTL) viažucimi epitopmi A1, A2, A3, A24 a B7 budú mať pokrytie takmer 100 percent v hlavných etnických skupinách (Černoši, Ázijci, Hispánci a Kaukazčania).

Doteraz však neexistoval podobný prístup k návrhu vakcíny proti TBC. V tejto štúdii sme navrhli vysoko promiskuitnú multiepitopovú vakcínu proti TBC s použitím rôznych antigénnych vlastností ôsmich proteínov obohatených o funkciu. Kandidát na chimerickú vakcínu má 15 CTL epitopov, 16 pomocných T lymfocytových (HTL) epitopov s IFN{4}}indukčnými vlastnosťami a 10 lineárnych B-bunkových epitopov. Imunoinformatická analýza preukázala, že tento kandidát na vakcínu je „všezahŕňajúci“, čo z neho robí potenciálny základný kameň na dosiahnutie „stratégie konca TB“.

2. Materiály a metóda

2.1. Výber proteínov a vyhľadávanie sekvencií

Na konštrukciu multiepitopovej vakcíny proti TBC sme najskôr vybrali proteíny komplexu M. tuberculosis, ktoré sú uložené v databáze IEDB [43] a boli validované ako väzbové epitopy MHC triedy I a II. Aminokyselinové sekvencie (primárna štruktúra) proteínov z kmeňa M. tuberculosis H37Rv boli získané z databázy UniProt [44]. Predpovede perspektívnych antigénov nezávislé od zarovnania na základe fyzikálno-chemických vlastností boli získané zo servera VaxiJen 2.0 [45], ktorý prešiel automatickou a krížovou kovariančnou (ACC) transformáciou proteínových sekvencií na jednotný vektor hlavnej aminokyseliny vlastnosti, pričom prah antigenicity je nastavený na 0.4 pre každý bakteriálny proteín [45,46].

Funkčná anotácia proteínov bola hodnotená pomocou databázy pre anotáciu, vizualizáciu a integrovaný objav (DAVID) 6.8 [47]. Sekretované proteíny boli ďalej obohatené pomocou dvoch kategórií: extracelulárny priestor a patogenéza prostredníctvom databáz DAVID a BioCyc [48]. Proteóm Homo sapiens GRCh38.p13 bol stiahnutý vo formáte FASTA z databázy National Center for Biotechnology Information (NCBI) [49]. BLASTp sa použil na predpovedanie homológie (E-hodnota =1e-5) medzi vylučovanými proteínmi a proteínmi H. sapiens.

2.2. Predikcia epitopu T-buniek

Predikcia a výber epitopov sú rozhodujúce kroky pri konštrukcii multiepitopových vakcín. Molekuly MHC I viažu krátke peptidy (9–11 aminokyselín), pretože peptidová väzbová štrbina molekúl MHC I pozostávajúca z jedného reťazca je uzavretá [50]. Voľne dostupný NetMHCpan-4.1 [51] sa použil na predikciu epitopov CTL, ktorý využíva NAlign{8}}MA na generovanie percentuálneho poradia (percentuálne poradie) na základe kombinácie väzbových afinit k MHC I a eluovaných ligandov .

"Percentuálne hodnotenie" dotazovanej sekvencie sa určilo porovnaním jej predikčného skóre s distribúciou predikčných skóre pre relevantné MHC vypočítané s použitím súboru náhodne vybraných natívnych peptidov. Epitopy s percentuálnym hodnotením < 0,5 percenta sa považovali za silné väzbové látky, zatiaľ čo epitopy s percentuálnym hodnotením < 2 percentá sa považovali za slabé väzbové látky [51].

Hoci na serveri možno predpovedať až 12 epitopov supertypu MHC triedy I, použili sme iba A1, A2, A3, A24 a B7, pretože týchto päť supertypov pokrýva 100 percent hlavných ľudských rás [42] . Vybrali sme silné väzbové látky a predpovedali ich antigenicitu pomocou VaxiJen2.0 [45], potom sme predpovedali imunogenicitu triedy I pomocou Medzinárodnej epitopovej databázy (IEDB) [52], ktorá využíva 3-násobnú krížovú validáciu.

Nakoniec sme usporiadali epitopy, ktoré boli antigénne aj imunogénne podľa percentuálneho hodnotenia a vybrali sme 15 epitopov s nízkym skóre, tri pre každý supertyp a aspoň jeden pre každý kandidátsky proteín, s výnimkou kandidátskeho proteínu, ktorý nemohol mať silný epitop viažuci CTL. ktorý je antigénny a imunogénny. Nakoniec, hodnoty IC50 pre každý epitop CTL boli predpovedané z NetMHC-4.0 [53].
Molekuly MHC triedy II sa viažu na antigénne peptidy a výsledný komplex môže byť rozpoznaný HTL. Typicky sa dĺžka antigénnych peptidov pohybuje od 12 do 20 aminokyselinových zvyškov, ale často sa pozorujú peptidy s dĺžkou medzi 13 a 16 zvyškami [54].

{{0}}méry boli najrozšírenejšími epitopmi MHC II pre M. tuberculosis a boli uložené v IEDB. V dôsledku toho sme použili NetMHCIIpan-4.0 [51,55] na predpovedanie väzby 15-mer peptidov na ľudský leukocytový antigén-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP, a alela H-2–1. Predpoveď bola tiež založená na NNAalign{11}}MA s percentuálnym hodnotením < 2 percentá a < 10 percent považovaných za silné a slabé spojivá [51].

Tiež sme predpovedali 15-merné IFN indukujúce epitopy pre kandidátske proteíny pomocou servera IFNepitope [56], ktorý využíva hybridný prístup podporného vektorového stroja, ktorý umožňuje virtuálny skríning IFN- -indukujúceho peptidu/epitopu v peptide knižnica pozostávajúca z IFN- -indukovateľných a neindukovateľných MHC II väzbových prvkov, ktoré aktivujú T-helper bunky. Potom sme predpovedali antigenicitu epitopov indukujúcich IFN [45] a nakoniec sme vybrali 16 najpromiskuitnejších epitopov, ktoré sa silne viažu na MHC-II, indukujú IFN a sú antigénne.

Je dôležité poznamenať, že signálne peptidy boli odstránené z kandidátskych proteínov pred predikciou epitopu. V tejto štúdii boli signálne peptidy skrínované pomocou SignalP 5.0 [57] a TargetP2.0 [58].

2.3. Predikcia lineárneho B-bunkového epitopu

Lineárne B-bunkové epitopy (16-méry) boli predpovedané pomocou ABCpred [59,60] s predvoleným prahom 0,51. Okrem toho sme na zvýšenie spoľahlivosti výsledkov predikcie použili aj BepiPred 2.{11}} [61] na predpovedanie lineárnych epitopov B-buniek. Epitopy získané z týchto dvoch softvérov boli ďalej podrobené predikcii antigenicity pomocou VaxiJen2.0 [45]. Nakoniec sme vybrali desať lineárnych B-bunkových epitopov na základe vysokého skóre ABCpred a antigenicity, pričom pre každý kandidátsky proteín bol vybraný aspoň jeden epitop.

2.4. Konštrukcia kandidáta na multiepitopovú vakcínu s chimérickými vlastnosťami

Navrhnutá multiepitopová vakcína obsahuje jedno adjuvans HBHA (hemaglutinín viažuci heparín), jeden Pan HLA DR-viažuci epitop (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 lineárnych B-bunkových epitopov a jeden Hisx 6 tag (obr. 3). Linkery sa použili na spojenie epitopov, zabránenie produkcie spojovacích epitopov a na zlepšenie procesu a regenerácie jednotlivých epitopov v chimérických vakcínach [62].

Na konštrukciu tohto kandidáta na vakcínu bolo adjuvans HBHA (UniProt ID: P9WIP9) lokalizované na N-konci a pripojené k downstream PADRE cez EAAAK linker. Potom boli HTL epitopy spojené GPGPG linkermi spojené s PADRE. Okrem toho, CTL epitopy spojené AAY linkerom boli spojené s HTL epitopmi cez HEYGAEALERAG linker, ktorý tiež spájal CTL epitopovú jednotku s lineárnymi B-bunkovými epitopmi spojenými pomocou KK linkerov. Nakoniec sa na C-koniec chimérického proteínu pripojil Hisx6 tag.

2.5. Antigenicita, alergénnosť a fyzikálno-chemické vlastnosti

Antigenicita viacepitopovej vakcíny a osemzložkových proteínov bola predpovedaná serverom VaxiJen 2.0 [45], zatiaľ čo alergénnosť týchto proteínov bola predpovedaná serverom AllerTOP 2.0 [ 63]. AllerTOP 2.0 používa aminokyselinové E-deskriptory, ACC transformáciu proteínových sekvencií a k-najbližších susedov (kNN) na klasifikáciu alergénov.

Metóda dosiahla 85,3 percentnú presnosť s 5-násobným krížovým overením. Na predikciu fyzikálno-chemických vlastností, ako je polčas rozpadu, izoelektrický bod, index nestability, alifatický index a veľký priemer hydropatie (GRAVY) tejto vakcíny s viacerými epitopmi, sa použil server ExPASy ProtParam [64].
Ďalej, rozpustnosť multiepitopového vakcínového peptidu bola hodnotená pomocou servera proteinSol (PROSO II) [65] na základe klasifikátora využívajúceho jemné rozdiely medzi dobre známymi nerozpustnými proteínmi z TargetDB a rozpustnými proteínmi z TargetDB aj PDB [ 66]. Pri hodnotení pomocou 10-násobnej krížovej validácie sa dosiahla presnosť 71.0 percent (plocha pod krivkou ROC=0,785).

2.6. Imunitná simulácia

Na charakterizáciu profilu imunitnej odpovede a imunogenicity vakcíny sa vykonali simulácie imunity in silico pomocou servera C-ImmSim [67]. C-ImmSim predpovedá imunitné interakcie pomocou pozične špecifických skórovacích matríc odvodených z techník strojového učenia na predikciu peptidov.
Súbežne simuluje tri kompartmenty reprezentujúce tri samostatné anatomické oblasti nájdené u cicavcov: (i) kostnú dreň, kde sa simulovali hematopoetické kmeňové bunky na produkciu nových lymfocytov a myeloidných buniek; (ii) týmus, kde boli vybrané naivné T bunky, aby sa zabránilo autoimunite; a (iii) lymfatický orgán, ako sú lymfatické uzliny.

Aby sme mohli vakcínu efektívne pripraviť a posilniť, nasledovali sme prístup [68], kde boli podané dve injekcie s odstupom štyroch týždňov. Všetky parametre simulácie boli nastavené na predvolené hodnoty s časovými krokmi nastavenými na 10 a 94 (každý časový krok je osem hodín).

2.7. Predikcia neusporiadanej oblasti

Vnútorne neusporiadané oblasti (IDR) sú prítomné v mnohých proteínoch. Neusporiadaná oblasť bola predpovedaná pomocou DISOPRED3 [69], ktorý využíva DISOPRED2 a dva ďalšie moduly založené na strojovom učení trénované na veľkých IDR na identifikáciu neusporiadaných zvyškov. Boli vtedy anno

2.8. Predikcia sekundárnej a terciárnej štruktúry

Sekundárna štruktúra navrhnutej vakcíny bola predpovedaná serverom PSIPRED 4.0 [70], ktorý ako prvý používa PSI-BLAST na identifikáciu sekvencií úzko súvisiacich s dopytovaným proteínom. Terciárna štruktúra tejto vakcíny bola predpovedaná pomocou servera Iterative Threading Assembly Refinement (I-TASSER) [71].

V modelovaní ITASSER existujú štyri kľúčové kroky; a) identifikácia šablóny závitu; b) iteračná simulácia zostavy štruktúry; c) výber a zdokonalenie modelu; a d) funkčná anotácia založená na štruktúre [72,73].

I-TASSER vygeneroval päť modelov, ktoré sa skrínovali pomocou ProSA-webu [74] a na ďalšie spresnenie sa vybral model s najnižším Z-skóre. ProSA-web porovnáva modelové skóre získané z experimentálne overených štruktúr uložených v PDB. Lokálny graf skóre kvality pomáha identifikovať problematické oblasti v modeli a rovnaké skóre bolo znázornené pomocou farebného kódu na prezentácii 3D štruktúry. To je užitočné pre skoré štrukturálne určenie a spresnenie.

2.9. Spresnenie terciárnej štruktúry

"Hrubý" 3D model kandidáta na vakcínu získaný spoločnosťou ITASSER bol upravený v dvoch krokoch pomocou dvoch serverov; najprv s ModRefiner [75] a potom GalaxyRefine [76]. ModRefiner používa stopy C na ovplyvnenie konštrukcie a zjemnenia proteínov získaných dvojstupňovou minimalizáciou energie na atómovej úrovni.

Najprv sa stopy C použili na konštrukciu hlavného reťazca, potom nasledovalo zjemnenie rotamérov bočného reťazca a atómov hlavného reťazca pomocou zložených silových polí založených na fyzike a znalostiach. GalaxyRefine využíva viacero šablón na generovanie spoľahlivých základných štruktúr, zatiaľ čo nespoľahlivé slučky alebo terminály boli generované modelovaním na základe optimalizácie.

2.10. Validácia terciárnej štruktúry

Vylepšená štruktúra kandidáta na vakcínu bola potvrdená pomocou Ramachandranových grafov vytvorených z databáz PROCHECK [77] a MolProbity [78]. Ramachandranove grafy hodnotia konformáciu hlavného reťazca proteínov rozdelením aminokyselinových zvyškov na dve oblasti: povolené a nepovolené. PROCHECK využíva stereochémiu na posúdenie čistej kvality proteínových štruktúr ich porovnaním s rafinovanými štruktúrami v rovnakom rozlíšení a potom prezentovaním oblastí vyžadujúcich ďalšiu analýzu.

Molprobity validuje lokálne a globálne modely makromolekúl (proteíny a nukleové kyseliny) kombináciou röntgenových, NMR, výpočtových a kryoEM kritérií [79]. Výkon a citlivosť na optimalizáciu umiestnenia vodíka a analýza všetkých atómov sa široko používajú v aktualizovanej verzii kritérií kovalentnej geometrie a torzného uhla [80].

2.11. Diskontinuálne B-bunkové epitopy

Diskontinuálne B-bunkové epitopy v natívnej proteínovej štruktúre boli predpovedané pomocou ElliPro [81]. ElliPro implementuje tri algoritmy na aproximáciu tvaru proteínu ako elipsoidu, vypočíta index protrúzie zvyškov (PI) a zoskupí susedné zvyšky na základe ich hodnôt PI. ElliPro poskytuje každému výstupnému epitopu skóre opísané ako priemerná hodnota PI pre zvyšok epitopu. Elipsoid s hodnotou PI 0.9 pozostáva z 90 percent obsiahnutých proteínových zvyškov, zatiaľ čo zvyšných 10 percent zvyškov leží mimo elipsoidu. Pre každý epitopový zvyšok sa hodnota PI vypočíta z ťažiska zvyšku ležiaceho mimo najväčšieho možného elipsoidu.

2.12. Molekulárne dokovanie chimérických proteínov

Molekulárne dokovanie navrhnutej vakcíny (ligandu) s imunitným receptorom Toll-Like Receptor-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) sa uskutočnilo pomocou Patchdocku [82]. Top 10 modelov bolo potom vylepšených pomocou FireDock [83]. PatchDock nahrádza povrchovú reprezentáciu molekúl podľa Connollyho bodkami konkávnymi, konvexnými a plochými záplatami.

Modely boli potom hodnotené na základe geometrického prispôsobenia a atómovej desolvatácie. [82]. FireDock optimalizuje konformácie bočného reťazca a orientáciu tuhého telesa a generuje výstup 3D rafinovaného komplexu na základe väzbovej energie [83]. Ako dokovací komplex sme vybrali prvý model Firedocku založený na globálnej energii. Nakoniec bola pomocou servera PRODIGY predpovedaná väzbová energia a disociačný obsah v dokovacom komplexe [84].

2.13. Simulácia molekulárnej dynamiky

Molekulárne dynamické simulácie sa uskutočnili na proteínoch pomocou rýchleho a voľne dostupného webového servera, interného servera na analýzu normálneho režimu (iMODS) [85] a konzistentné a optimálne výsledky dokovania sa získali zo servera PatchDock-FireDock. Vo vnútorných súradniciach generuje analýza normálneho režimu (NMA) kolektívne pohyby kritické pre makromolekulárnu funkciu. iMODS predstavuje mechanizmy na skúmanie týchto režimov, ako je analýza vibrácií, animácie pohybu a trajektórie morfovania, ktoré boli vykonávané takmer interaktívne pri rôznych rozlíšeniach [85].

2.14. Reverzná translácia, optimalizácia kodónov a in silico klonovanie vakcíny

Na efektívnu expresiu kandidátnej vakcíny v bunkách Escherichia coli bola cDNA vytvorená in silico optimalizáciou kodónov a reverznou transláciou pomocou Java Codon Adaptation Tool (JCAT) [86].

Optimalizácia zahŕňala (i) vyhýbanie sa rho-nezávislým transkripčným terminátorom, ii) vyhýbanie sa väzbovým miestam prokaryotických ribozómov, (iii) vyhýbanie sa miestu štiepenia reštrikčných enzýmov Ncol a Xhol, ktoré slúžia ako N-koncové a C-koncové reštrikčné miesta na inzerciu cDNA šablónu vakcíny a (iv) iba čiastočnú optimalizáciu na aplikáciu miestne cielenej mutagenézy. Kodonový adaptačný index (CAI) a obsah GC predpovedali kvalitu cDNA s opálovým stop kodónom (TGA) vloženým za Hisx 6 tag. Potom sa optimalizovaný fragment DNA kandidátskej chimérickej vakcíny integroval do reverzného vlákna pET-28a(plus) pomocou nástroja SnapGene [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com