In vitro a in vivo metabolizmus extraktu z Cistanche Tubulosa u normálnych a chronických nepredvídateľných depresívnych potkanov vyvolaných stresom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li a kol

ABSTRAKT

Cistanche tubulosa, jeden druh Cistanches Herba, sa nedávno potvrdilo, že má antidepresívnu účinnosť u potkanov s inchronickým nepredvídateľným stresom (CUS) obnovením homeostázy črevnej mikrobioty. V tomto článku sa zameriavame na skúmanie metabolického profilu C. tubulosa u normálnych a CUS-indukovaných depresívnych modelových potkanov in vitro a in vivo. Pomocou UPLC-Q-TOF-MS sa in vitro gastrointestinálny metabolizmusExtrakt z Cistanche tubulosa(CTE) bola hodnotená u normálnych aj CUS potkanov. Súčasne in vivo metabolizmus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)u normálnych a depresívnych potkanov bol tiež skúmaný v moči a výkaloch potkanov. Celkovo bolo charakterizovaných 20 a 26 metabolitov z metabolizmu in vitro a in vivo u normálnych potkanov a potkanov CUS. CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)sa in vitro metabolizoval na aglykóny a produkty degradácie fenyletanoidných glykozidov (PhGs) a iridoidných glykozidov, či už normálnou alebo utlmenou črevnou mikroflórou potkanov. Metabolity fázy II aglykónov a produkty degradácie PhGs a iridoidné glykozidy boli hlavnými metabolitmi v moči a výkaloch potkanov. Okrem toho metabolická schopnosť generovať sekundárne glykozidy a aglykóny v depresívnej črevnej mikroflóre potkanov bola oveľa slabšia ako u normálnej črevnej mikrobioty potkanov, čo sa pripisovalo neusporiadaným glykozidovým hydrolázam produkovaným črevnou mikrobiotou u potkanov s depresiou CUS. Výsledky tejto štúdie položili základ pre pochopenie metabolického procesu a terapeutického mechanizmu antidepresívnej vlastnosti CTE.

Kľúčové slová: Cistanche tubulosa, Metabolizmus depresie, In vitro, In vivo, Črevná mikroflóra

1. Úvod

Cistanches Herba je oficiálne zaznamenaná ako sušené šťavnaté stonky Cistanche deserticola (YC Ma) a C. tubulosa (Schrenk), ktoré sa používajú na liečbu nedostatku obličiek, impotencie, ženskej neplodnosti, morbidleukorey, profúznej metrorágie a stareckej zápchy [1]. Moderné farmakologické štúdie ukázali, že Cistanches Herba má rôzne biologické aktivity, ako sú antineurodegeneračné, imunoregulačné a protizápalové účinky [2,3]. Naše predchádzajúce vyšetrovania to potvrdiliExtrakt z Cistanche tubulosa(CTE), ktoré sa skladajú zo 48,6 percenta fenyletanoidných glykozidov (PhGs), 6,9 percenta iridoidných glykozidov a 20,0 percent celkových sacharidov, by mohli výrazne zmierniť depresívne symptómy depresívnych potkanov vyvolaných chronickým nepredvídateľným stresom (CUS). obnovenie homeostázy črevnej mikroflóry [4]. Nedávne štúdie naznačujú, že zmeny v zložení črevnej mikroflóry boli spojené s rozvojom a progresiou depresie [5,6]. Relatívne zastúpenie mikrobiálnych rodov bolo výrazne narušené u CUSdepresívnych modelových potkanov v porovnaní s normálnymi kontrolami [7]. U depresívnych pacientov bola tiež významne zmenená diverzita a bohatosť črevnej mikrobioty [8]. Okrem toho sa za hlavné zložky Cistanches Herba [2,3] považovali rôzne zlúčeniny vrátane fenyletanoidových glykozidov (PhGs) a iridoidných glykozidov, ktoré sa ľahko metabolizovali na svoje sekundárne glykozidy a aglykóny vrátane hydroxytyrozolu (HT), 3,4-dihydroxyfenetyl glykozid, deglykozylovaná kyselina geniposidová atď. ľudskou črevnou mikrobiotou. Tieto metabolity sa ľahšie vstrebávajú cez črevo a prejavujú biologickú aktivitu v súlade s prototypovou zložkou [9–11]. Preto sa domnievame, že počas výskytu a rozvoja depresie narušenie štruktúry črevnej mikroflóry nevyhnutne ovplyvňuje metabolizmus orálnych tradičných čínskych liekov (TCM) v gastrointestinálnom trakte, okrem ovplyvnenia fyziologického stavu hostiteľa. Väčšina existujúcich metabolických údajov o Cistanches Herba pochádza z metabolických štúdií na zdravých zvieratách[12–15]. Preto by bolo klinicky významnejšie skúmať metabolický profil CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v patologickom stave pri objasňovaní jeho bioaktívnych zložiek a pochopení mechanizmu účinku pre jeho antidepresívnu účinnosť.

V súčasnej štúdii sa zameriavame na charakterizáciu metabolických profilov CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)u zdravých aj u depresívnych potkanov vyvolaných CUS pomocou ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie štvorpólovej hmotnostnej spektrometrie s časom letu (UPLC-Q-TOF-MS). Žalúdočná šťava, črevná tekutina a mikrobiota normálnych a depresívnych patologických potkanov sa použili na simuláciu metabolického procesu CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v gastrointestinálnom trakte in vitro, nezávisle a postupne. In vivo metabolity sú tiež objasnené po perorálnom podaní CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)u normálnych a CUS potkanov. Táto štúdia poskytuje nové poznatky o metabolizme a aktívnych metabolitoch CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)na depresiu.

2. Materiál a metódy

2.1. Materiál

Sušené stonky C. tubulosa boli zozbierané z okresu Hetian (Xinjiang, Čína). Vzorky kupónov boli overené prof. Xiaobo Li a uložené v herbári School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Čína). Metóda extrakcie bola použitá tak, ako je uvedené v našej predchádzajúcej publikácii [4]. TheExtrakt z Cistanche tubulosa(CTE) vzorky sa skladovali pri 4 stupňoch a pred použitím sa znova rozpustili v sterilnej vode. Sterilné vodné roztoky CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)vzorka sa potom prefiltrovala cez 0.22 μm membránu a filtráty sa zhromaždili do sterilných skúmaviek.

Echinakozid poskytlo laboratórium Dr. Pengfei Tu, PekingUniversity (Peking, Čína). Akteozid, izoakteozid, 2'-acetylakteozid a cistanozid A boli zakúpené od Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Čína). Hydroxytyrozol, kyselina kávová, 3,4-dihydroxybenzénpropiónová kyselina, 3-hydroxyfenylpropiónová kyselina a 3-fenylpropiónová kyselina boli zakúpené od Aladdin Industrial Inc. (Šanghaj, Čína). Čistota každej zložky bola stanovená ako > 95 percent pomocou HPLC-UV. Acetonitril v kvalite HPLC bol zakúpený od spoločnosti Merck (Darmstadt, Nemecko). Deionizovaná voda sa pripravila z destilovanej vody pomocou systému na čistenie vody Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Všetky ostatné použité činidlá a chemikálie boli analytickej čistoty.

2.2. Pokusy na zvieratách

Samce potkanov Sprague-Dawley (200 ± 20 g) boli získané od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Peking, Čína) a umiestnené v Laboratórnom zvieracom centre Shanghai JiaoTong University (Shanghai, Čína). Zvieratá boli chované v skupinách pri kontrolovanej izbovej teplote (25 ± 2 stupne, 55 ± 10 percent relatívnej vlhkosti) s cyklom svetlo-tma 12:12 h. Potkanom bol umožnený voľný prístup k bežnej laboratórnej potrave potkanov a vode počas 1 týždňa. Zariadenia a protokoly pre zvieratá boli schválené Výborom pre etiku zvierat Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Čína).

Po týždňovej aklimatizácii bolo dvanásť naivných potkanov náhodne rozdelených do dvoch skupín (n=6), kontrolnej skupiny a skupiny s chronickým nepredvídateľným stresom (CUS). Potkany CUS boli vyvinuté ako v našej predchádzajúcej správe [4], ktoré boli vystavené rôznym stresorom: biely šum (100 dB) počas 1 hodiny, nočné stroboskopické osvetlenie nízkej intenzity (120 zábleskov/min), nedostatok vody počas 24 hodín, prázdny fľaše na vodu na 1 hodinu (po nedostatku vody), nedostatok potravy na 24 hodín, fyzické obmedzenie (1–2 hodiny), nútené plávanie (5 minút), špinavá klietka na 24 hodín (200 ml vody v 100 g podstielky z pilín), privretie chvosta ( 1 min), šok počas 30 min, naklonenie klietky o 45 stupňov počas 24 h a nočné osvetlenie (12 h). Stresory sa aplikovali nepretržite a náhodne počas 4 týždňov, podrobné usporiadanie je popísané v tabuľke S1. Po 4 týždňoch stresu sa uskutočnil sacharosepreferenčný test, test na otvorenom poli a test kŕmenia s potlačením novosti, ako bolo opísané vyššie [4]. Náčrt CUS a behaviorálny test je znázornený na obr. S1. Po behaviorálnych testoch sa od každého potkana získali najmenej 4 fekálne pelety a umiestnili sa do sterilných kónických skúmaviek na in vitro analýzu CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)metabolizmus.

2.3. Gastrointestinálny metabolizmus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)normálnymi a CUS potkanmi in vitro

2.3.1. Metabolizmus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v simulovaných žalúdočných a črevných šťavách

Päťdesiat miligramov CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)sa pridali do 10 ml simulovanej žalúdočnej šťavy, respektíve črevnej šťavy. Potom CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)sa inkuboval pri 37 stupňoch počas 4 hodín v žalúdočnej šťave a 6 hodín v črevnej šťave. Kultivačná zmes (1 ml) sa okamžite ochladila 3 ml n-butanolu nasýteného vodou po 0 a 4 hodinách v žalúdočnej šťave a pri 0 a 6 hodinách v črevnej šťave. Spôsob spracovania použitej vzorky bol taký, ako bolo opísané vyššie [9].

2.3.2. Metabolizmus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)normálnou a CUS črevnou mikroflórou potkanov

Čerstvé normálne a CUS potkanie fekálne vzorky boli najprv zmiešané a homogenizované s 25-násobným objemom GAM bujónu. Sedimenty boli odstránené filtráciou cez tri kusy gázy. Suspenzia sa potom inkubovala pri 37 stupňoch v anaeróbnom inkubátore, v ktorom bol vzduch nahradený zmesou plynov (H2 5 percent, CO2 10 percent, N2 85 percent). Päťdesiat miligramov CTE sa pridalo do 5 ml normálnej a CUS potkanej fekálnej suspenzie oddelene a suspenzia sa inkubovala pri 37 stupňoch počas 48 hodín. Kultivovaná zmes sa odstránila a extrahovala sa vodou nasýteným n-butanolom pri 0, 12, 24 a 48 hodinách. Metóda spracovania vzorky bola opísaná vyššie [9].

2.3.3. Sekvenčný metabolizmus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)žalúdočnou šťavou, črevnou šťavou, normálnou a CUS črevnou mikroflórou potkanov

Po prvé, 100 mg CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)bol pridaný do 1{{10}}} ml simulovanej žalúdočnej šťavy a inkubovaný pri 37 stupňoch počas 4 hodín. Celá reakcia bola ukončená 3-násobným objemom n-butanolu nasýteného vodou a centrifugovaná pri 3000 otáčkach za minútu počas 15 minút, po čom nasledovalo odparenie supernatantu pod prúdom dusíka plyn pri 37 stupňoch. Po druhé, zvyšok sa znova rozpustil v 0,4 ml sterilnej vody, pridal sa k 8 ml simulovanej črevnej šťavy a inkuboval sa pri 37 stupňoch počas 6 hodín. Vzorka so žalúdočnou šťavou bola pripravená rovnakým spôsobom. Nakoniec sa zvyšok znovu rozpustil v 0,3 ml sterilnej vody, pridal sa k 6 ml normálnych a CUS potkaních fekálnych suspenzií a inkuboval sa pri 37 stupňoch počas 48 hodín v anaeróbnom inkubátore. Jeden mililiter reakcie sa okamžite ochladil 3 ml n-butanolu nasýteného vodou o 0 a 4 h v žalúdočnej šťave, 0 a 6 h v črevnej šťave a 0, 12, 24 a 48 h v črevnej mikroflóre potkana . Vzorka bola spracovaná identicky CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)pri simulovanej žalúdočnej šťave.

2.4. Metabolizmus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)normálnym a CUS potkanom in vivo

Každý potkan v dvoch skupinách bol potom umiestnený v individuálnej metabolickej klietke. Po celonočnom hladovaní, ktoré umožňovalo len voľný prístup k vode, boli všetkým potkanom orálne podané 2 ml vody cez agastrickú sondu. Od 0 h do 12 h sa všetkým potkanom odobrali slepé vzorky moču a výkalov. Ďalej CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)(400 mg/kg) bola podaná žalúdočnou sondou. Vzorky moču a stolice sa odoberali od 0 hodín do 24 hodín. Všetky vzorky moču a výkalov sa ihneď skladovali pri -80 stupňoch.

Vzorky moču a stolice od normálnych a CUS potkanov boli vopred ošetrené tak, ako bolo opísané vyššie [12]. Všetky výsledné vzorky sa analyzovali pomocou UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Analytická metóda

UPLC sa uskutočnilo na systéme Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, USA) s kolónou ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm x 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , USA) gradientovou elúciou s použitím {{10}},1 percenta kyseliny mravčej, acetonitrilu (A) a 0,1 percenta kyseliny mravčej vo vode (B) pri prietoku 0,4 ml/min. . Profil gradientu bol: 0 – 5 min (A: 5 – 20 percent), 5 – 7,5 min (A: 20 – 30 percent), 7,5 – 10 min (A: 30 – 70 percent), 10 – 11 min (A : 70–100 percent) a držal sa 1,5 minúty. Gradient sa recykloval späť na 5 percent v priebehu 0,5 minúty a udržiaval sa 2,5 minúty v ďalšom priebehu. Objem injekcie bol 3 ul. Teplota kolónovej pece bola nastavená na 35 stupňov.

Hmotnostná spektrometria sa uskutočnila s použitím hmotnostného spektrometra Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, USA). Ionizácia sa uskutočnila v režime negatívneho elektrospreja (ESI-). Parametre MS boli nasledovné: kapilárne napätie, -2.0 kV; napätie kužeľa, 20 V; teplota zdroja, 120 stupňov ; teplota desolvatácie, 500 stupňov; prietoky plynu kužeľa a desolvatácie 50 a 1000 l/h, v tomto poradí. Na presné meranie hmotnosti sa použil leucín-enkefalín ako zámková hmota na generovanie [M–H]- iónu (m/z 554,2615). Experiment MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) v dvoch skenovacích funkciách sa uskutočnil nasledovne: funkcia 1 (nízka energia): m/z 50–1000, čas skenovania 0,25 s, oneskorenie medzi skenmi 0,02 s, energia kolízie 6 eV; funkcia 2 (vysoká energia): m/z50–1000, čas skenovania 0,25 s, oneskorenie medzi skenmi 0,02 s, kolízna energetická rampa 20–45 eV.

2.6. Spracovanie dát

Údaje boli spracované pomocou softvéru UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, USA) na identifikáciu metabolitov v rámci presných hromadných nespracovaných údajov s úplným skenovaním zozbieraných prostredníctvom MSE. Zlúčeniny boli identifikované na základe presnej hmotnosti, fragmentov vo vysokoenergetickej hmotnostnej spektrometrii. Prah intenzity bol nastavený ako 100,0 impulzov. Identifikácia cieľa, tolerancia zhody fragmentov a ďalšie parametre boli nastavené automaticky.

3. Výsledky

3.1. Zmeny správania u potkanov s depresiou vyvolanou CUS

Potkany s depresívnymi symptómami vyvolanými CUS boli hodnotené behaviorálnymi testami vrátane testu preferencie sacharózy, testu na otvorenom poli a testu potlačenia novosti kŕmenia. Študentov t-test odhalil, že preferencia sacharózy v teste preferencie sacharózy (p < 0,001),="" celková="" vzdialenosť="" prejdená="" v="" teste="" na="" otvorenom="" poli="" (p="">< 0,001)="" a="" latencia="" k="" jedlu="" v="" teste="" potláčania="" novosti="" (p="">< 0,01)="" boli="" významne="" odlišné="" v="" porovnaní="" s="" kontrolnou="" skupinou="" po="" 4-týždňovej="" liečbe="" cus="" (obr.="" 1).="" tieto="" zistenia="" ukázali,="" že="" model="" chronického="" nepredvídateľného="" stresu="" bol="" úspešne="">

3.2. Charakterizácia chemických zložiek CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)

Komplexná analýza prototypových komponentov CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)sa uskutočnilo pomocou UPLC-Q-TOF-MS. Celkovo 27 zložiek z CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)boli detegované a predbežne charakterizované, vrátane 20 PhG, 5 iridoidov a iridoidných glykozidov a 2 oligosacharidov. Podrobné informácie vrátane retenčného času, presných MS a fragmentových iónov MS/MS sú uvedené v podporných informáciách (tabuľka S2), ktoré poskytujú prehľad o štruktúre týchto chemických zložiek. UPLC-Q-TOF-MS celkový iónový chromatogram (TIC) CTE bol znázornený na obr. S2.

3.3. Gastrointestinálny metabolizmus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)normálnymi a CUS potkanmi in vitro

V tejto štúdii sú potenciálne metabolity CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)normálnymi a CUSrats in vitro boli detegované z TIC a identifikované kombináciou elementárnych kompozícií a hmotnostných spektier MS/MS fragmentov po ich porovnaní s kontrolnými vzorkami. Všetky metabolity z CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v simulovaných žalúdočných a črevných šťavách sú normálne a CUS potkanie črevné mikrobioty uvedené v tabuľke 1.

3.3.1. Metabolizmus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v simulovaných žalúdočných a črevných šťavách

Sedem metabolitov CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v simulovanej žalúdočnej šťave boli predbežne identifikované pomocou presnej hmotnosti a informácií o fragmentoch MSE: M1 (m/z315,1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459,1501, C20H28O12, 2,36 min), M5 (m/z,150105,1 2,60 min), M7 (m/z 179,0338, C9H804, 2,85 min), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20, 4,77 min), M16 (m/z 827,2580, C37H480723, M18231, m .1968, C29H36015, 5,81 min). Deglykozylácia, dehydroxylácia, dehydrogenácia a izomerizácia sa považovali za hlavné metabolické dráhy pre CTE v žalúdočnej šťave. Zistilo sa, že M4 a M5 majú molekulovú hmotnosť o 2 Da a 16 Da nižšiu ako ich prototypová zložka, dekafeoylakteozid, a teda boli identifikované ako jeho dehydrogenované a dehydroxylované produkty. M12 bol identifikovaný ako izomér echinakozidu, ktorý produkuje rovnaké ióny ako echinakozid pri m/z 623,2178, 477,1601, 315,1055, 161,0237.

Rovnaké metabolity boli detegované po CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)inkubácia v črevnej šťave. Je pozoruhodné, že kofeoylová skupina v polohe C-6′ vPhGs bola ľahko metabolizovaná tráviacimi enzýmami v črevnej šťave za vzniku jej dekofeylových metabolitov a kyseliny kávovej.

3.3.2. Metabolizmus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)normálnou a CUS črevnou mikroflórou potkanov

Celkovo sa z CTE biotransformovalo 20 metabolitov(extrakt z Cistanche tubulosa)v normálnej potkanej mikroflóre boli detegované a identifikované (obr. 2). Z výsledkov sa zistilo, že PhG boli degradované na aglykón hydroxytyrozol (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min) a kyselinu kávovú (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, potom 2,85 min. sa ďalej metabolizovali na M3 (m/z 163,0390, C9H803, 2,02 min), M6 (m/z 181,0501, C9H1004, 2,76 min), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4, 5,5,12 min), 6m/5125 C9H1003, 4,36 min) prostredníctvom dehydroxylácie, redukcie a metylácie. Okrem toho, centrálne metabolické dráhy, ktoré produkovali priame metabolity PhG prototypových zlúčenín z CTE v normálnej črevnej mikroflóre potkanov, sú redukcia, metoxylácia, deglykozylácia, dekafeoyl, dehydrogenácia a izomerizácia.

Po inkubácii v črevnej mikroflóre potkanov vyvolanej depresiou CTE, CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)sa premenil na 20 metabolitov rovnakými metabolickými cestami ako normálne potkany.

3.3.3. Sekvenčný metabolizmus CTE žalúdočnou šťavou, črevnou šťavou, normálnou a CUS črevnou mikrobiotou potkanov

Po postupnej inkubácii v žalúdočnej šťave, črevnej šťave, normálnej a CUS črevnej mikroflóre potkana, CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)sa metabolizoval na 14 metabolitov (vrátane 8 žalúdočnou šťavou, 7 črevnou šťavou, 11 normálnou a 10 črevnou mikrobiotou potkanov CUS). Medzi nimi M2(HT) a M11 (3-kyselina hydroxyfenylpropiónová, 3-HPP) boli konečnými metabolitmi PhGs po postupnej inkubácii CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v žalúdočnej šťave, črevnej šťave a črevnej mikrobiote. Medzi normálnymi a CUS potkanmi nebol žiadny významný rozdiel v metabolitoch.

M8, M9, M14, M17, M19 a M20 boli detegované iba v nezávislom metabolizme CTE normálnou a CUS intestinálnou mikrobiotou potkanov. Tieto metabolity boli hlavne metabolické medziprodukty, ktoré boli úplne metabolizované na konečné metabolity v štúdii sekvenčného metabolizmu CTE, a preto je ťažké ich detegovať.

3.3.4. Rozdiely medzi rýchlosťou metabolizmu CTE podľa normálnej a CUS potkanej mikroflóry

Na objasnenie rozdielov medzi rýchlosťou metabolizmu CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)pri normálnej črevnej mikroflóre a črevnej mikroflóre potkanov CUS sa relatívny obsah 27 prototypových zlúčenín a 20 metabolitov po inkubácii so žalúdočnou šťavou, črevnou šťavou, normálnou črevnou mikroflórou a črevnou mikroflórou potkanov CUS stanovil samostatne a postupne (tabuľky S3 a S4). Výsledky ukázali, že aj keď medzi CTE neboli žiadne významné rozdiely(extrakt z Cistanche tubulosa)metabolitov normálnych a depresívnych potkanov, bol pozorovaný významný rozdiel v ich rýchlostiach metabolizmu. Napríklad C2 a C5 boli identifikované ako 8-epiloganová kyselina alebo jej izomér. Boli úplne metabolizované v normálnych vzorkách do 12 hodín inkubácie. V patologicky zníženej črevnej mikroflóre potkanov však boli dôkladne metabolizované po 48 hodinách inkubácie. Bolo zrejmé, že rýchlosť metabolizmu u normálnych potkanov bola rýchlejšia ako u potkanov CUS. Podobné výsledky boli objavené z C18 (izoakteozid). Okrem toho je pozoruhodné, že plocha píku M12 (izomerizácia echinakozidu) a M16 (izomerizácia tubulozidu A) v normálnych vzorkách bola oveľa väčšia ako vo vzorkách CUS, čo naznačuje, že izomerizačná reakcia CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)bola častejšia u normálnej črevnej mikrobioty potkanov ako u depresie črevnej mikrobioty potkanov.

3.4. Metabolizmus CTE normálnym a CUS potkanom in vivo

Porovnaním biologických vzoriek skupiny liečenej CTE s prázdnymi biologickými vzorkami sa zistilo celkom 26 metabolitov (zlúčenina 1–26) CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)boli detegované normálne a CUS potkany (tabuľka 2). Typické UPLC chromatogramy vzoriek moču normálnych a CUS potkanov sú uvedené na obr.

3.4.1. Charakterizácia metabolitov CTE v normálnom a CUS raturíne

Celkom 18 in vivo metabolitov CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)vo vzorkách normálneho potkanieho moču boli predbežne identifikované. Degradačné metabolity PhG vrátane HT a CA a ich ďalšia sulfatácia (zlúčenina 1, 2, 3, 5, 8 a 16), metylácia (6, 21, 22 a 24) a metoxylačné (13 a 14) metabolity boli hlavné metabolity v normálnom moči potkanov. Iridoidné glykozidy sa ľahko metabolizovali na aglykóny (23, 25 a 26) prostredníctvom deglykozylácie. Je pozoruhodné, že vo vzorke moču normálnych potkanov nebola zistená žiadna prototypová zložka.

Vo vzorke depresívneho moču potkanov 22 metabolitov CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)boli zistené a charakterizované. Jeden prototyp zlúčeniny, kyselina 8-epiloganová, bola zistená v moči patologických potkanov. Ostatné metabolity boli v súlade s tými, ktoré sa našli v moči normálnych potkanov, vrátane sulfátovaných metabolitov (1, 2, 3, 8, 10 a 16), metylovaných metabolitov (6, 11, 19 a 22), metoxylovaných metabolitov (13 a 14) HT a CA a aglykóny iridoidných glykozidov (25 a 26).

3.4.2. Charakterizácia metabolitov CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v normálnych a CUS ratfeces

V tejto štúdii bol iba jeden metabolit (zlúčenina 20, 3-HPP) CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)bol identifikovaný v normálnych potkaních výkaloch. Väčšina PhG bola najskôr degradovaná na CA a následne prešla ďalším metabolizmom na svoj hlavný mikrobiálny metabolit, 3-HPP. Vo vzorke výkalov od potkana CUS boli predbežne charakterizované 3 metabolity, vrátane sulfátovaného 3-HPP (zlúčenina 16) a sulfátovaného HT (zlúčeniny 2 a 3).

3.4.3. Rozdiely medzi in vivo metabolitmi CTE u normálnych potkanov a potkanov CUS

Po perorálnom podaní CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)metabolity in vivo vykazovali zjavné rozdiely u zdravých a depresívnych modelových potkanov. 21 metabolitov (zlúčenina 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 a 19–26) sa zistilo vo vzorkách zdravých potkanov a potkanov CUS. Zlúčenina 23 (deglykozylovaná kyselina geniposidová) bola identifikovaná len vo vzorkách zdravých potkanov, zatiaľ čo zlúčeniny 4 (HT), 7 (8-epiloganová kyselina), 15 (3, 4-dihydroxybenzénpropiónová kyselina) a 18 ({{ 19}}HPP glukuronidová konjugácia) boli detegované len vo vzorkách potkanov modelu CUS. Stručne povedané, prototypové zložky boli detegované iba u potkanov CUS, zatiaľ čo metabolity viacfázy II boli objavené u normálnych potkanov.

4. Diskusia

V tejto štúdii sa nezávisle a postupne použili tri inkubačné modely vrátane žalúdočnej šťavy, črevnej šťavy, normálnej črevnej mikroflóry potkanov a CUS na skúmanie gastrointestinálneho metabolického profilu CTE.(extrakt z Cistanche tubulosa)in vitro. Zistilo sa, že PhGsand iridoidné glykozidy v CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)sa ľahko metabolizovali na svoje sekundárne glykozidy a aglykóny pomocou CUS-indukovanej depresívnej črevnej mikroflóry potkana. Potom in vivo metabolizmus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)u normálnych a CUS potkanov bol tiež overený. Navrhované metabolické dráhy pre CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)u zdravých a CUS-indukovaných depresívnych potkanov sú znázornené na obr. 4. PhG, ako je echinakozid a akteozid, boli metabolizované na HT a CA a CA podstúpil ďalší metabolizmus na svoj hlavný mikrobiálny metabolit, 3-HPP. HT, CA a 3-HPP sa potom metabolizovali na ich sulfátované, metylované a metoxylované metabolity. Iridoidné glykozidy vrátane kyseliny geniposidovej, kankanozidu A a kankanozidu N sa metabolizovali na svoje aglykóny prostredníctvom deglykozylácie. Tieto ďalej ukázali, že PhG a iridoidné glykozidy v CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)sa u potkanov CUS ľahko metabolizovali na sekundárne glykozidy a aglykóny. Tieto metabolity zvyčajne vykazujú lepšiu intestinálnu absorpciu a biologickú dostupnosť, aby sa ďalej absorbovali do krvi, aby prejavili biologickú aktivitu [16–18]. Stojí za zmienku, že izomerizácia prevládala pre PhG v gastrointestinálnom trakte, relevantné metabolity boli identifikované po porovnaní s retenčným časom UPLC ich prototypových zlúčenín na základe optimalizovaného ideálneho gradientového profilu UPLC.

Kyselina kávová bola primárnym degradačným produktom CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)depresívnou patologickou črevnou mikrobiotou potkanov. Predchádzajúce publikácie uvádzali, že kyselina kávová má antidepresívne účinky v teste núteného plávania u myší. Hladina mRNA neurotrofického faktora (BDNF) odvodeného z mozgu vo frontálnom kortexe a hladina mRNA TrkB v amygdale bola po teste núteného plávania významne znížená a prvé zníženie bolo významne inhibované kyselinou kávovou [19]. Hydroxytyrozol bol aglykón PhG, ktorý chráni neurogenézu a kognitívne funkcie tým, že bráni stresom indukovanej downregulácii nervového proteínu BDNF [20]. Preto je potrebné venovať väčšiu pozornosť niektorým bioaktívnym metabolitom (tj HT a CA) transformovaným črevnou mikrobiotou po perorálnom podaní.

Okrem toho súčasné zistenia poskytujú dôkaz, že u depresívnej črevnej mikroflóry bola metabolická schopnosť vytvárať sekundárne glykozidy a aglykóny výrazne slabšia ako u normálnej črevnej mikroflóry potkanov. Dôvodom sú pravdepodobne štrukturálne zmeny črevnej mikroflóry vyvolané depresiou, čo vedie k zníženej aktivite metabolických enzýmov produkovaných črevnou mikroflórou [21]. Je zaujímavé, že predchádzajúca štúdia ukázala, že kmeň Bacteroidetes kóduje najhojnejšie gény glykozidovej hydrolázy a polysacharidovej lyázy pre hydrolýzu glykozidov a štiepenie komplexných sacharidov s eliminačným mechanizmom [22]. Konkrétne Bacteroides spp. vrátane B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. inneris, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis a B. xylanisolvens vykazovali dominantný celkový počet génov kódujúcich GH a PL. Rovnaké vlastnosti má aj Parabacteroides distasonis [22]. Naše predchádzajúce štúdie potvrdili, že 28-denná chronická nepredvídateľná stresová stimulácia znížila relatívnu abundanciu rodov Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas a Weissella, zatiaľ čo zvýšila počet ruminokokov a deinokokov u potkanov [4]. Je pozoruhodné, že Bacteroides a Parabacteroides boli dva najpočetnejšie mikrobiálne taxóny, ktoré predstavovali približne 20 percent relatívneho zastúpenia u normálnych potkanov. Po liečbe CUS sa relatívne množstvo Bacteroides a Parabacteroides prudko znížilo na približne 5 percent u depresívnych modelov potkanov. Preto to nevyhnutne povedie k redukcii celkového počtu GH a PL enzýmov u CUS potkanov a ďalej narúša deglykozylovanú reakciu CUS depresívnou črevnou mikroflórou po perorálnom podaní CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)u modelových potkanov.

5. Záver

V tejto štúdii bola zavedená a aplikovaná technika UPLC-Q-TOF-MS na skríning a identifikáciu metabolitovCistanche tubulosaextractu normálnych a CUS depresívnych potkanov in vitro a in vivo. Výsledky ukázali, že CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)sa metabolizoval na aglykóny a produkty degradácie PhGs a iridoidné glykozidy zdravou aj depresívnou črevnou mikrobiotou. Po perorálnom podaní CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)metabolity aglykónov fázy II a produkty degradácie PhGs a iridoidglykozidov sa nachádzali prevažne v moči potkanov. Metabolická schopnosť vytvárať sekundárne glykozidy a aglykóny u depresívnej črevnej mikroflóry potkana bola oveľa slabšia ako u normálnej črevnej mikroflóry potkana, čo sa pripisovalo neusporiadaným glykozidhydrolázam produkovaným črevnou mikroflórou u potkanov s depresiou CUS. Táto štúdia poskytuje novú perspektívu pre neskoršie vývoj CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)ako potenciálne antidepresívum.

Poďakovanie

Táto práca bola podporená grantmi z Národného kľúčového výskumného a vývojového programu Číny (2017YFC1702400).

Príloha A. Doplňujúce údaje

Doplňujúce údaje k tomuto článku možno nájsť online na adrese HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Z: ' In vitro a in vivo metabolizmusExtrakt z Cistanche tubulosau normálnych a chronických nepredvídateľných depresívnych potkanov vyvolaných stresomYang Li a kol

--Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

Referencie

[1] Komisia pre čínsky liekopis, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 ed., China Medical Science Press, Peking, Čína, 2015, s. 135 Časť I.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Analýza chemických zložiek v druhoch Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: prehľad jeho chémie, farmakológie a farmakokinetických vlastností, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Antidepresívne účinkyExtrakt z Cistanche tubulosana potkanoch s chronickým nepredvídateľným stresom prostredníctvom obnovy homeostázy črevnej mikroflóry, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, črevo-mozgová os: ako mikrobióm ovplyvňuje úzkosť a depresiu, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Nedávny vývoj v chápaní úlohy črevnej mikroflóry v zdraví a chorobách mozgu, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variácie črevnej mikrobioty a fekálneho metabolického fenotypu spojeného s depresiou sekvenovaním génu 16S rRNA a LC/ Metabolomika založená na MS, J. Pharm. Biomed. Anal. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transfering the blues: Depresia-associated gut microbiota indukuje neurobehaviorálne zmeny u potkana, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Ľudský gastrointestinálny metabolizmus vodného extraktu Cistanches Herba in vitro: objasnenie metabolického profilu na základe komplexnej identifikácie metabolitov v žalúdočnej šťave, črevách šťavy, ľudské črevné baktérie a črevné mikrozómy, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Identifikácia metabolitov echinakozidov produkovaných ľudskými črevnými baktériami pomocou ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie/kvadrupólovej hmotnostnej spektrometrie s časom letu, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Skríning a identifikácia troch typických metabolitov fenyletanoidných glykozidov z Cistanches Herba ľudskými črevnými baktériami pomocou UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. Anal. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Rýchly skríning a identifikácia rozdielov medzi metabolitmi Cistanche deserticola a vodným extraktom C. tubulosa u potkanov pomocou UPLC- Q-TOF-MS kombinovaná analýza rozpoznávania vzorov, J. Pharm. Biomed. Anal. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Systematicky charakterizujte metabolity echinakozidu a akteozidu z Cistanche tubulosa v potkanej plazme, žlči, moči a výkaloch na základe UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406 – 1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Prístup k identifikácii sekvenčných metabolitov typický fenyletanoidový glykozid, echinakozid, založený na kvapalinovej chromatografii a dobe zachytávania iónov
analýza letovej hmotnostnej spektrometrie, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolizmus echinakozidu, dobrého antioxidantu, u potkanov: izolácia a identifikácia jeho biliárnych metabolitov, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 431-438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Pochopenie molekulárnych mechanizmov súhry medzi rastlinnými liekmi a črevnou mikroflórou, Med. Res. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Absorpcia a likvidácia ginsenosidov po perorálnom podaní podávanie extraktu Panax notoginseng potkanom, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interakcie črevnej mikrobioty s funkčnými zložkami potravy a nutraceutikami, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219-225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Kyselina kávová tlmí pokles expresie kortikálnej BDNF mRNA vyvolaný vystavením núteným plávanie stres u myší, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115-121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Materské podávanie hydroxytyrozolu zlepšuje neurogenézu a kognitívne funkcie u prenatálne stresovaných potomstvo, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Vplyv črevnej mikrobioty na metabolizmus a toxicitu liečiv, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, The abundance and variety of sacharidov-aktívnych enzýmov v ľudskej črevnej mikrobiote, Nat. Microbiol. 11 (2013) 497-504.