In vitro aktivity proti starnutiu etanolových extraktov z ružového rambutanu (Nephelium Lappaceum Linn.) na kožné aplikácie, časť 1

abstraktné

Starnutie pokožky je charakterizované znakmi, ako sú vrásky, strata elasticity, laxnosť, drsný vzhľad, melazma a pehy. Niekoľko typov výskumov sa zameralo na prevenciu a liečbu starnutia pokožky pomocou mnohých prírodných zložiek. Táto štúdia sa zamerala na posúdenie anti-agingových aktivít proti starnutiu pokožky etanolových extraktov ružového rambutanu (PR) (Nephelium lappaceum Linn.) z listov (L), konárov (B), semien (S) a šupiek z zrelé (R) a mladé (Y) ovocie. Výťažky extrakcie všetkého ružového rambutanu (PR) extrahovaného Maceráciou (M) a Soxhletovou extrakciou (Sox) s použitím 95 percentného etanolu ako rozpúšťadla sa pohybovali od 10,62 percenta do 30 .63 percent . Flavonoidy boli nájdené ako hlavné fytochemikálie takmer vo všetkých PR extraktoch. Extrakty PR-YM a PR-Y-Sox poskytli najvyšší celkový obsah fenolov podľa Folin-Ciocalteuovho testu 67,60 ± 4,38 mgGAE/g a celkový obsah flavonoidov podľa kolorimetrického testu modifikovaného chloridu hlinitého 678,72 ± 23,59 mgQE/g. PR-LM extrakty vykazovali tri najvyššie antioxidačné aktivity; zachytávanie voľných radikálov (SC50 z 0.320 ± 0.{{40}}70 mg/ml) inhibícia peroxidácie lipidov (LC50 0,274 ± 0,029 mg/ml) a chelatačná aktivita kovov (MC50 0,203 ± 0,021 mg/ml). Všetky PR extrakty pri 0,01 a 0,1 mg/ml nevykazovali žiadnu cytotoxicitu na bunky B16F10 a fibroblasty ľudskej kože, v danom poradí. Podobne extrakt PR-R-Sox vykazoval najvyššiu antimelanogenézu na bunkách B16F10 (52,7 ± 0,9 percenta) a aktivitu inhibície tyrozinázy húb (IC50 0,04 ± 0,02 mg/ml), ktorá bola významne porovnateľná s kyselina kojová (p < 0,05). Extrakt PR-Y-Sox ukázal biosyntézu kolagénu metódou Sirius Red a stimuláciu génov proti starnutiu (Sirt1 a Foxo1) na fibroblastoch ľudskej kože metódou RT-PCR, ktorá bola podobná štandardom ʟ-askorbovej a resveratrol, resp. Táto štúdia naznačuje, že extrakty PR-R-Sox a PR-Y-Sox možno ďalej rozvíjať ako prírodné činidlá proti starnutiu na bielenie a proti vráskam v kozmetickom, kozmeceutickom a farmaceutickom priemysle. 2023 Autor(i). Vydal Elsevier BV v mene Univerzity kráľa Sauda.

Glykozid cistanche môže tiež zvýšiť aktivitu SOD v tkanivách srdca a pečene a výrazne znížiť obsah lipofuscínu a MDA v každom tkanive, účinne zachytáva rôzne reaktívne kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atď.) a chráni pred spôsobeným poškodením DNA. OH-radikálmi. Cystanche fenyletanoidové glykozidy majú silnú schopnosť zachytávať voľné radikály, vyššiu redukčnú schopnosť ako vitamín C, zlepšujú aktivitu SOD v suspenzii spermií, znižujú obsah MDA a majú určitý ochranný účinok na funkciu membrány spermií. Polysacharidy Cistanche môžu zvýšiť aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytoch a pľúcnych tkanivách experimentálne starnúcich myší spôsobenú D-galaktózou, ako aj znížiť obsah MDA a kolagénu v pľúcach a plazme a zvýšiť obsah elastínu. dobrý čistiaci účinok na DPPH, predĺženie doby hypoxie u starnúcich myší, zlepšenie aktivity SOD v sére a oddialenie fyziologickej degenerácie pľúc u experimentálne starnúcich myší Experimenty ukázali, že pri bunkovej morfologickej degenerácii má Cistanche dobrú antioxidačnú schopnosť a má potenciál byť liekom na prevenciu a liečbu chorôb starnutia kože. Zároveň má echinakozid v Cistanche významnú schopnosť vychytávať voľné radikály DPPH a má schopnosť vychytávať reaktívne formy kyslíka a zabraňovať degradácii kolagénu vyvolanej voľnými radikálmi a má tiež dobrý reparačný účinok na poškodenie aniónom voľných radikálov tymínu.

Kliknite na Kde môžem kúpiť Cistanche

【Ďalšie informácie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

1. Úvod

Globálne starnúca populácia na svete rastie rýchlejšie ako všetky ostatné vekové skupiny. Svetová zdravotnícka organizácia odhaduje, že svetová populácia nad 60 rokov a viac bude v roku 2050 2,1 miliardy a bude čeliť bežným chorobám vrátane osteoartritídy, cukrovky, straty sluchu, Alzheimerovej choroby, chronickej obštrukčnej choroby pľúc (CHOCHP), depresie a demencie. , rakoviny a neurologických a kardiovaskulárnych ochorení (Darawsha et al., 2021, WHO, 2021). Koža je jedným z najviditeľnejších orgánov počas procesu starnutia. Starnutie pleti súvisí so sociálnou komunikáciou, pretože dobrý vzhľad pôsobí priaznivo a zvyšuje sebavedomie. Starnutie pokožky je ovplyvnené environmentálnymi alebo vonkajšími faktormi, ako sú látky znečisťujúce ovzdušie, xenobiotiká, UV žiarenie a fajčenie, a vnútornými faktormi, ako sú genetika, bunkový metabolizmus, hormóny a metabolické procesy (Darawsha et al., 2021). Mnoho nedávnych typov výskumu sa zameralo na udržanie zdravej pokožky oddialením, prevenciou a liečbou starnutia s cieľom zlepšiť vzhľad pokožky regeneráciou a stimuláciou prirodzených fyziologických procesov na ochranu pokožky pred starnutím.

Reaktívne formy kyslíka (ROS) z bunkového oxidačného stresu môžu spôsobiť indukciu apoptotickej bunkovej smrti aktiváciou zápalových procesov a ich signálnych dráh, zvýšením hladín metaloproteináz (MMP), degradáciou nenasýtených lipidov a zmenou štruktúry fibrilárnych buniek. proteíny vrátane kolagénov a elastínu, ktoré sú spôsobené starnutím pokožky (Miastkowska a Sikora, 2018, Darawsha et al., 2021). Po melanogenéze je melanín polyfenolový pigment produkovaný v melanozómoch melanocytov, ktoré sa nachádzajú v očiach, vlasoch a koži zvierat a môže chrániť kožu poškodenú ultrafialovým žiarením (Ali a Naaz, 2018). Tyrozináza je enzým obsahujúci meď, ktorý dokáže transformovať L-tyrozín na L-dopa a L-dopa na odopachinón-H plus hydroxylačnými a oxidačnými reakciami a potom prechádza cez medziprodukty nakoniec na melanín (Solano, 2018). ROS tiež hrá významnú úlohu pri regulácii bunkového oxidačného stresu v melanocytoch, čo sú dendritické bunky, ktoré sa nachádzajú v bazálnej vrstve epidermis v koži. Zápalové mediátory v koži, ako je interleukín (IL), prostaglandín E2, tumor nekrotizujúci faktor a interferón-gama, ktoré sú vylučované hlavne Th bunkami, lymfocytmi, dendritickými bunkami a monocytmi, regulujú stimulujúcu aktivitu tyrozinázy a upregulujú TYRP{11 }} a TYRP{12}} expresia a podpora proliferácie melanocytov, ktorá súvisí s produkciou melanínu (Fu et al., 2020). Nadprodukcia a vysoká akumulácia melanínu však spôsobuje starnutie pokožky, ako je melazma, pehy, tmavé škvrny, lentigo a hyperpigmentačné poruchy, ktoré môžu byť esteticky nežiaduce (Ali a Naaz, 2018).

Sirtuíny sú nukleárny nikotínamid adenín dinukleotid (NAD plus)-závislá histón deacetyláza triedy III, ktorá reguluje starnutie buniek a apoptózu a bunkový rast riadením p53, forkhead transkripčných faktorov (FOXO) a receptora gama aktivovaného peroxizómovým proliferátorom (PPAR-c). regulácie metabolizmu, diferenciácie buniek, prežívania a starnutia. (Son a kol., 2021). SIRT1, SIRT6 a zriedkavo SIRT7 v rodine sirtuínov boli regulované pre dermatologické problémy, vrátane zápalu kože, kožných infekcií, rakoviny, autoimunitných ochorení, dedičných dermatologických ochorení, najmä starnutia kože (Son et al., 2021). FOXO1 je tiež transkripčný faktor, ktorý sa nachádza v cytoplazme. SIRT1 deacetyluje FOXO1 a aktivuje transkripciu FoxO1 vo viacerých dráhach, ako je MAPK (mitogénom aktivovaná proteínkináza), proteínkináza (AKT) a pankreatický a duodenálny homeobox-1 (Pdx1) dráhy (Sin et al., 2015) . Zvýšenie expresie Sirt1 a Foxo1 mRNA reguluje metabolizmus glukózy, opravu DNA, neuroprotekciu, diferenciáciu, vaskulárnu ochranu a sekréciu inzulínu; a znižuje starnutie a choroby súvisiace s vekom, ako je oxidačný stres, starnutie buniek, neurodegenerácia, zápal, inzulínová rezistencia, kardiovaskulárne choroby, adipozita a steatóza pečene, ako aj starnutie kože (Son et al., 2021).

Zákon o liekoch (drogy) a kozmetike z roku 1940 definuje liek ako „všetky lieky na vnútorné alebo vonkajšie použitie ľuďmi alebo zvieratami a všetky látky určené na použitie na diagnostiku, liečbu, zmiernenie alebo prevenciu akúkoľvek chorobu alebo poruchu u ľudí alebo zvierat." Kozmetika je akýkoľvek výrobok určený na trenie, nalievanie, kropenie alebo sprejovanie, zavádzanie alebo aplikovanie na akúkoľvek časť ľudského tela s cieľom očistiť, skrášliť, podporiť príťažlivosť alebo zmeniť vzhľad a zahŕňa akýkoľvek výrobok určený na použitie ako súčasť kozmetiky. Kozmeceutiká sú kozmeticko-farmaceutické hybridy určené na zlepšenie zdravia a krásy prostredníctvom zložiek, ktoré ovplyvňujú biologické textúry a funkcie pokožky (Joshi a Pawar, 2015). V súčasnosti kozmetika, kozmeceutiká a liečivá obsahujú aktívne zlúčeniny, ktoré neutralizujú voľné radikály, ako je vitamín E, vitamín C, glutatión a koenzým Q10; a spomaľujú starnutie pokožky v dôsledku vrások a melazmy, ako sú nukleové kyseliny, hydrolyzáty bielkovín, extrakty z rias, rastlinné oleje, fytohormóny , cytokíny a neuropeptidy (Kim et al., 2015, Miastkowska a Sikora, 2018), ako aj polyfenoly a flavonoidy z rôznych prírodných rastlinných extraktov, ako sú extrakty z Vigna subterranean, Stichopus japonicus, Citrus aurantifolia, Ananus a Manihososus esculenta (Chutoprapat a kol., 2020; Ding a kol., 2020 Boonpisuttinant a kol., 2022, Jampa a kol., 2022).

Ružový rambutan alebo Ngo See Chom Pu (Nephelium lappaceum L.) je rastlina z čeľade Sapindaceae, čo je pôvodná rastlina v okrese Klung, provincia Chanthaburi, vo východnej časti Thajska. Plody ružového rambutanu (PR) sú sladké a majú dobrú chuť. Majú tenkú šupku so žltkastoružovou kôrou a svetloružový chrbát so svetlozelenou špičkou, ktorý sa líši od ostatných druhov, ako sú Ngo Rongrien a Ngo Nasarn, ktoré majú kôru a tŕne svetločervené. Hlavné fytochemikálie nachádzajúce sa v rastlinách rambutanu sú kyselina ellagová, korilagín, geraniín, kvercetín a rutín (Phuong a kol., 2019, Phuong a kol., 2020). Už skôr bolo hlásené, že šupky rambutanu z iných druhov majú vysokú hladinu fenolových zlúčenín a majú mnoho biologických aktivít, ako je zachytávanie radikálov DPPH, protizápalové, antivírusové, protirakovinové a antibakteriálne (Chingsuwanrote et al. ., 2016; Hernández-Hernández a kol., 2019; Rohman, 2017; Sukmandari a kol., 2017; Thitilertdecha a Rakariyatham, 2011). Výťažky z ružového rambutanu však nemajú žiadnu vedeckú správu o biologických účinkoch, najmä o činnosti proti starnutiu pre zdravie pokožky a estetické účely. Preto sa súčasná štúdia zamerala na posúdenie a vyhodnotenie potenciálu PR extraktov v kožných aplikáciách v kozmetike, kozmeceutikách a farmaceutických výrobkoch. Skúmanie biologických aktivít in vitro proti starnutiu vrátane inhibície tyrozinázy a antimelanogenézy, biosyntézy kolagénu a stimulácie expresie mRNA Sirt1 a Foxo1 a troch antioxidačných aktivít, ako aj cytotoxicity na ľudských dermálnych fibroblastoch, naznačuje účinnosť a bezpečnosť PR extraktov, ktoré môžu byť ďalej vyvinuté na prírodné produkty starostlivosti o pleť.

2. Materiály a metódy

2.1. Príprava a extrakcia

Päť častí ružového rambutanu (PR) vrátane listov (L), konárov (B), semien (S) a šupiek zo zrelých (R) a mladých (Y) plodov bolo zozbieraných z okresu Klung, Chantaburi, Thajsko od júna do August 2017. Vzorky poukazov boli identifikované botanikom v Forest Herbarium v ​​Thajsku a zaregistrované v herbári (Kód: RSPG-RMUTT-0102) Innovative Natural Products od Thai Wisdom Research Unit, Fakulty integratívnej medicíny, RMUTT , Pathum Thani, Thajsko. Všetky časti ružového rambutanu boli narezané, umyté vodou z vodovodu, vysušené pri 60 stupňoch v teplovzdušnej sušiarni a rozomleté ​​na prášok pomocou mlynčeka. Všetky časti ružových rambutanov boli extrahované Maceráciou a Soxhletovou extrakciou s použitím 95 percentného etanolu ako rozpúšťadla, ktorý sa najčastejšie používa na extrakciu liečivých rastlín, pretože je bezpečný a ekonomický. Stručne, 10 g každého z PR práškov sa extrahovalo pomocou (1): Macerácia (M) v 100 ml 95 percentného (obj./obj.) etanolu (Bangkok Alcohol Industrial, Thajsko) s trepaním pri 200 ot./min. pri teplote miestnosti. (25 ± 2 stupne) počas 48 hodín; a (2): Soxhletova extrakcia (Sox) so 100 ml 95 % (v/v) etanolu pri 80 ± 5 °C počas 24 hodín. Potom sa extrakty najprv prefiltrovali cez vatu a potom prešli cez filtračný papier pripojený k vákuovej pumpe. Filtráty sa zhromaždili, spojili a vysušili na rotačnej odparke. Surové extrakty PR boli uchovávané v sklenených fľašiach a skladované pri 4 stupňoch v chladničke až do použitia. Výťažky extrakcie sa uskutočňovali na báze suchej hmotnosti. 95 % etanol sa použil ako rozpúšťadlo na rozpustenie PR extraktov pred experimentmi.

2.2. Fytochemikálie, celkové fenoly a flavonoidy a obsah kvercetínu

Fytochemikálie, ako sú antrachinóny, alkaloidy, karotenoidy, glykozidy, flavonoidy, taníny a xantóny extraktov PR, boli skúmané, ako už bolo opísané (Boonpisuttinant et al., 2022). Kvalitatívne výsledky sú vyjadrené ako (plus) pre prítomnosť a (-) pre neprítomnosť fytochemikálií. Celkový fenolový obsah (TPC) bol testovaný Folin-Ciocalteu testom, ako už bolo opísané (Boonpisuttinant et al., 2022). Stručne, 50 ul PR extraktov, 75 1 Folin-Ciocalteuovho činidla (Sigma-Aldrich, USA) a 75 1 7,5 percenta (w/v) Na2C03 (Loba Chemie, India) sa pridalo do {{13} } mikroplatnička, jemne premiešajte a potom inkubujte pri izbovej teplote na tmavom mieste počas 90 minút. Potom sa pomocou čítačky mikrodoštičiek zmerali absorbancie pri vlnovej dĺžke 725 nm. Obsah fenolu sa vypočítal zo štandardnej krivky kyseliny galovej (Sigma-Aldrich, USA). Výsledky boli vyjadrené ako mg ekvivalentov kyseliny galovej (GAE)/g extraktu.

Celkový obsah flavonoidov (TFC) modifikovanou metódou chloridu hlinitého sa testoval podľa Shraim et al. (2021). Stručne, 50 ul PR extraktov, 25 ul 10 percentného AlCl3 (BDH Prolabo Chemicals, Belgicko) a 100 ul 5 percentného NaN02 (Loba Chemie, India) sa pridalo do 96-jamkovej mikroplatničky. Po 5 minútach inkubácie sa do doštičiek pridalo 25 ul 1 M NaOH (BDH Prolabo Chemicals, Belgicko). Reakcia sa nechala inkubovať pri teplote miestnosti počas 10 minút. Potom sa pomocou čítačky mikrodoštičiek zmerali absorbancie pri vlnovej dĺžke 450 nm. Obsah flavonoidov sa vypočítal zo štandardnej krivky kvercetínu (Sigma-Aldrich, USA). Výsledky boli vyjadrené ako mg ekvivalentov kvercetínu (QE)/g extraktu.

Obsah kvercetínu v PR extraktoch sa skúmal metódou HPLC (Shaikh a Jain, 20}18). V stručnosti, presne odvážené množstvo štandardného kvercetínu sa rozpustilo v metanole v 100 ml odmernej banke, čím sa získal zásobný roztok 1,000 lg/ml. Štandardné roztoky sa následne 2-násobne sériovo zriedili na 3,125 mg/ml. Na prípravu vzorky sa 2,5 g extraktov rozpustilo v 25 ml metanolu v 25 ml odmernej banky, čím sa získala koncentrácia 1,000 mg/ml. Všetky analýzy sa uskutočňovali na systéme Agilent 1260 infinity HPLC (Waters, Milford, MA, USA) vybavenom detektorom s fotodiódovým poľom. Použitou analytickou kolónou bola predĺžená kolóna Agilent Zorbax C18 (5 1 x 100 mm x 4,6 mm) s mobilnou fázou metanol: 0,1 % kyselina ortofosforečná (75:25) pri prietokovej rýchlosti 0,6 ml/min. Teplota kolóny sa udržiavala na 25 stupňoch a detekčná vlnová dĺžka sa nastavila na 370 nm. Všetky roztoky a rozpúšťadlá sa prefiltrovali cez 0,22 um filter a odplynili sa. Objem vstreku vzorky bol 10 ul a doba spracovania bola 8 minút.

2.3. Antioxidačná aktivita

2.3.1. Aktivita zachytávania voľných radikálov

Aktivita zachytávania voľných radikálov PR extraktov bola testovaná 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylovou (DPPH) metódou od Boonpisuttinanta a kol. (2019). Množstvo 100 l PR extraktov alebo kyseliny ʟ-askorbovej (Sigma-Aldrich, USA) ako pozitívnej kontroly a 100 l 0,1 mg/ml roztoku DPPH (Sigma-Aldrich, USA) v absolútnom etanole sa pridalo do 96-jamková mikroplatnička. Po inkubácii pri teplote miestnosti na tmavom mieste počas 30 minút sa merali absorbancie pri vlnovej dĺžke 515 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek. Percento aktivity zachytávania radikálov DPPH sa vypočítalo podľa nasledujúceho vzorca:

percento aktivity zachytávania radikálov DPPH {{0}}[A0 -A1/A0]×100 (1)

Kde A0 je absorbancia kontroly a A1 je absorbancia vzoriek. Koncentrácie poskytujúce 50 percent vychytávania (SC50) sa potom vypočítali z grafu vyneseného medzi percentom vychytávania voľných radikálov a koncentráciami vzorky.

2.3.2. Inhibícia peroxidácie lipidov

Inhibícia peroxidácie lipidov v PR extraktoch bola testovaná železito-tiokyanátovou metódou Boonpisuttinant et al. (2019). Množstvo 50 l PR extraktov alebo a-tokoferol (Sigma-Aldrich, USA) ako pozitívna kontrola a 50 l kyseliny linolovej v 50 % (v/v) DMSO (Sigma-Aldrich, USA) sa pridalo do 96-jamková mikroplatnička. Reakcia sa iniciovala pridaním 50 ul 5 mM NH4- SCN a 50 ul 2 mM FeCl2. Po inkubácii pri 37 stupňoch na tmavom mieste počas 60 minút sa pomocou čítačky mikrodoštičiek zmerali absorbancie pri vlnovej dĺžke 490 nm. Percento inhibície peroxidácie lipidov sa vypočítalo podľa nasledujúceho vzorca:

Kde A0 je absorbancia kontroly a A1 je absorbancia vzoriek. Koncentrácie poskytujúce 50 percent inhibície peroxidácie lipidov (LC50) sa vypočítali z grafu vyneseného medzi percentom inhibície peroxidácie lipidov a koncentráciami vzorky.

2.3.3. Chelatácia kovov

Kovová chelatácia PR extraktov bola testovaná metódou chelatácie železnatých iónov (FIC) od Boonpisuttinanta a kol. (2019). Množstvo 50 l PR extraktov alebo EDTA (Loba Chemie, India) ako pozitívna kontrola, 1 mg/ml FeCl2 a 50 l 1 mg/ml ferozínu v 1 % HCl (TCI, USA) sa pridalo do 96-jamková mikroplatnička. Po inkubácii pri teplote miestnosti na tmavom mieste počas 60 minút sa pomocou čítačky mikrodoštičiek merali absorbancie pri vlnovej dĺžke 570 nm. Percentá chelatácie kovov sa vypočítali podľa nasledujúceho vzorca:

Kde A0 je absorbancia kontroly a A1 je absorbancia vzoriek. Koncentrácie poskytujúce 50 percent chelatácie kovu (MC50) sa vypočítali z grafu vyneseného medzi percentom chelatácie kovu a koncentráciami vzorky.

2.4. Inhibícia hubovej tyrozinázy

Inhibičná aktivita tyrozinázy húb PR extraktov bola testovaná modifikovanou dopachrómovou metódou (Boonpisuttinant et al., 2022). Množstvo 50 l PR extraktov alebo kyseliny kojovej (Sisco Research Laboratories (SRL), India) ako pozitívna kontrola, 50 l 0,1 mg/ml L-tyrozínu (Sigma- Aldrich, USA), 50 ul 0,1 mM fosfátového pufra a 50 ul 0,1 mg/ml hubovej tyrozinázy (Sigma-Aldrich, USA) sa pridalo do 96-jamkovej mikroplatničky. Pred a po inkubácii pri 37 °C na tmavom mieste počas 60 minút sa pomocou čítačky mikrodoštičiek merali absorbancie pri vlnovej dĺžke 450 nm. Percento inhibície hubovej tyrozinázy sa vypočítalo podľa nasledujúceho vzorca:

percento inhibície hubovej tyrozinázy=[(A – B)-(C – D)]/=(A – B)×100 (4)

Kde A je absorbancia slepej vzorky po inkubácii, B je absorbancia slepej vzorky pred inkubáciou, C je absorbancia vzoriek po inkubácii a D je absorbancia vzoriek pred inkubáciou. Koncentrácie poskytujúce 50 percentnú inhibíciu tyrozinázy (IC50 mg/ml) sa vypočítali z grafu vyneseného medzi percentom inhibície tyrozinázy a koncentráciami vzorky.

2.5. In vitro aktivity proti starnutiu na bunkových kultúrach

2.5.1. Bunkové kultúry

Myšie melanómy (B16F10) a fibroblasty ľudskej kože sa použili na skúmanie anti-melanogenézy, biosyntézy kolagénu a anti-starnutia expresie Sirt1 a Foxo1 mRNA. Tieto dve bunky boli získané z American Type Culture Collection (ATCC), Virginia, USA. Bunky boli kultivované v Dulbeccovom modifikovanom Eagle médiu (DMEM) (Sigma-Aldrich Biotechnology, St. Louis, MO, USA) doplnenom 10 percentami fetálneho bovinného séra (FBS) (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA ), 100 IU/ml penicilínu a 100 mg/ml streptomycínu (Gibco BRL, Gaithersburg, USA) za štandardných podmienok pri 37 °C v 5% CO2 inkubátore pred experimentmi.

2.5.2. Test cytotoxicity na fibroblastoch ľudskej kože

Rôzne koncentrácie extraktov PR boli skúmané na cytotoxicitu na myšacie melanómy (B16F10) a fibroblasty ľudskej kože pomocou 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl) )-2,5-difenyltetrazoliumbromidový (MTT) test ako už skôr opísaný Boonpisuttinant a kol. (2022). Fibroblasty ľudskej kože v hustote 1 x 104 buniek na jamku sa umiestnili na 96-jamkové platne, objem sa upravil na 180 ul pomocou DMEM a inkubovali sa pri 37 stupňoch pod atmosférou 5 percent CO2 počas 24 hodín. Potom sa pridali extrakty v rôznych koncentráciách. Bunky sa inkubovali pri teplote 37 °C v atmosfére 5 percent CO2 počas 24 hodín. Potom sa bunky trikrát premyli 10 mM PBS pri pH 6,8 a pridal sa 1 ml 0,5 mg/ml roztoku MTT (Sigma-Aldrich, USA). Po inkubácii pri teplote miestnosti počas 3 hodín sa MTT roztok odstránil a do každej jamky sa pridalo 100 ul dimetylsulfoxidu (DMSO). Doštičky sa jemne pretrepávali pri 200 ot./min. počas 15 minút. Absorbancie roztokov pri vlnovej dĺžke 570 nm sa merali pomocou čítačky mikrodoštičiek. Percentá životaschopnosti buniek sa vypočítali podľa nasledujúceho vzorca:

Kde Acontrol je absorbancia kontroly a A vzorka je absorbancia vzoriek.

2.5.3. Anti-melanogenéza na bunkách B16F10

Anti-melanogenéza na B16F10 bunkách PR extraktov bola skúmaná s použitím skôr opísanej metódy od Boonpisuttinant et al. (2022). Bunky B16F10 v hustote 2,5 x 105 buniek na jamku boli nasadené na 6-jamkové platne a inkubované pri 37 stupňoch pod atmosférou 5 percent CO2 cez noc. Potom sa pridali extrakty v koncentrácii 0,01 mg/ml. Kyselina kojová sa použila ako pozitívna kontrola. Bunky sa inkubovali pri 37 stupňoch pod atmosférou 5 percent CO2 počas 72 hodín. Potom sa supernatanty zhromaždili v čistých mikrocentrifugačných skúmavkách, zatiaľ čo bunky sa trikrát premyli 10 mM fosfátovým pufrom (PBS) pri pH 6,8, rozpustili sa v 200 1 10% NaOH a inkubovali sa pri 60 stupňoch 1 hodinu. . Absorbancie pri vlnovej dĺžke 450 nm supernatantov a bunkových lyzátov sa merali pomocou čítačky mikrodoštičiek. Percento obsahu melanínu sa vypočítalo podľa nasledujúceho vzorca:

2.5.4. Biosyntéza kolagénu na fibroblastoch ľudskej kože

Biosyntéza kolagénu PR extraktov bola skúmaná ako skôr opísaná metóda v Boonpisuttinant et al. (2022). Fibroblasty ľudskej kože s hustotou 5 x 105 buniek na jamku sa naočkovali do 6-jamkových platní a inkubovali sa pri 37 stupňoch pod atmosférou 5 percent CO2 cez noc. Potom sa pridali extrakty v koncentrácii 0,1 mg/ml. Kyselina askorbová bola použitá ako pozitívna kontrola. Bunky sa inkubovali pri 37 stupňoch pod atmosférou 5 percent CO2 počas 24 hodín. Potom sa bunky trikrát premyli 10 mM PBS pri pH 6,8, pridal sa 1 ml 0,1 % (w/v) roztoku Sirius red (Sigma-Aldrich, USA) v nasýtenej kyseline pikrovej (Sisco Research Laboratories (SRL ), India) a potom sa inkubovali pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Farbivo sa odstránilo a doštičky sa 5-krát premyli 1 ml 10 mM HCl (Merck Millipore, Nemecko). Potom sa bunky rozpustili pridaním 1 ml 0,1 M NaOH. Absorbancie pri vlnovej dĺžke 450 nm supernatantov a bunkových lyzátov sa merali pomocou čítačky mikrodoštičiek. Percentá množstva kolagénu sa vypočítali podľa nasledujúceho vzorca:

Kde Csample bol obsah kolagénu vo vzorkách a Ccontrol bol obsah kolagénu kontroly.

2.5.5. Stimulácia génov proti starnutiu na fibroblastoch ľudskej kože

Stimulácia génov proti starnutiu (Foxo1 a Sirt1) extraktov PR bola stanovená pomocou RT-PCR, ako už bolo opísané Polouliakhom a kol. (2020). Fibroblasty ľudskej kože v hustote 5 x 105 buniek na jamku sa naočkovali do 6-jamkových doštičiek inkubovaných pri 37 °C v atmosfére 5 percent CO2 cez noc. Potom sa pridali extrakty v koncentrácii 0,01 mg/ml. Po inkubácii počas 24 hodín sa celková RNA extrahovala pomocou NucleoSpin RNA Plus (Macherey Nagel, Dueren, Nemecko) podľa pokynov výrobcu. Množstvo celkovej RNA sa kvantifikovalo fluorometrom Qubit 2.0 (Invitrogen, Massachusetts, USA). Špecifické priméry pre RT-PCR vrátane Foxo1, Sirt1 a b-aktínu boli zakúpené od Macrogen Oceania, Austrália. Sledovali sa sekvencie špecifických primerov; Foxo1: 5′-GAC GCC GTG CTA CTC GTT-3′(dopredu) a 5′-CGG TTC ATA CCC GAG GTG-3′(späť); Sirt1: 5′ -TAG CCT TGT CAG ATA AGG AAG GA-3′(Dopredu), 5′ -ACA GCT TCA CAG TCA ACT TTG T-3′ (Reverse); a b-aktín: 5′ TCA TGC AGT GTG ACG TTG ACA TCC GT-3′ (dopredu), 5′-CCT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TG -3′ (spätne). Zmesi PCR obsahovali 1x SuperScriptTM III One-Step RT-PCR System s PlatinumTM Taq DNA polymerázovým supermixom (Invitrogen, Massachusetts, USA), 250 nM špecifických primérov a 2 lg RNA. Všetky reakcie RT-PCR sa uskutočňovali na TProfessional Basic Gradient 070–601 (Biometra GmbH, Göttingen, Nemecko) za podmienok amplifikácie: 60 °C 30 minút pre reverznú transkripciu; potom 40 cyklov pri 94 stupňoch počas 15 s denaturácie, 55 stupňoch C počas 30 s žíhania a 68 stupňoch počas 30 s predlžovania; a nakoniec pri 68 stupňoch C počas 5 minút. Po procesoch RT-PCR sa produkty PCR separovali na 1,5 percentnom agarózovom géli zmiešanom s Novel Juice 6x DNA Loading Buffer (GeneDireXTM, Čína), prezerali sa pomocou transiluminátora a potom sa fotografovali pomocou Quantity One 4.6.8 (základné). (Bio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornia). Následne sa hustota pásov kvantifikovala pomocou obrázku J (verzia 1.47, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) a normalizovala sa na housekeeping gén, b-aktín.

2.6. Štatistická analýza

Všetky experimenty boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD) nezávislých experimentov (n {{0}}). Štatistické rozdiely boli analyzované pomocou ANOVA s Tukeyho testom (p < 0,05). Vzťahy medzi bioaktivitami boli testované pomocou Pearsonovho korelačného koeficientu.

3. Výsledky

3.1. Výťažky extrakcie, fyzikálne vlastnosti a fytochemický obsah PR extraktov

Výťažky extrakcie, fyzikálne charakteristiky a fytochemické obsahy PR extraktov sú uvedené v tabuľke 1. Výťažky extrakcie PR extraktov sa pohybovali od 10,62 percenta do 30,63 percenta. Hlavnými fytochemickými zložkami PR extraktov boli flavonoidy. Výnimočné je, že extrakty ružového rambutanu zo semien (PR-SM a PR-S-Sox) neobsahovali flavonoidy, ale ako svoje fytochemikálie vykazovali iba glykozidy. Len PR extrakty zo zrelých a mladých šupiek Maceráciou (M) preukázali prítomnosť xantónov, čo je tepelne labilný polyfenol. Okrem toho sa výťažky extrakcie PR extraktov Soxhletovou extrakciou (Sox) zdali byť vyššie ako Macerácia (M).

3.2. Celkový obsah fenolov (TPC), flavonoidov (TFC) a kvercetínu v PR extraktoch

PR extrakt zo šupiek mladých plodov Maceráciou (PRY-M) poskytol najvyšší celkový obsah fenolov podľa FolinCiocalteu testu 67,60 ± 4,38 mgGAE/g, zatiaľ čo PR extrakt zo šupiek mladého ovocia od Soxhletova extrakcia (PR-Y-Sox) poskytla najvyšší celkový obsah flavonoidov podľa modifikovaného kolorimetrického testu chloridu hlinitého 678,72 ± 23,59 mgQE/g (obr. 1) (p < 0,05). Extrakty PR-BM, PR-SM a PR-S-Sox však nevykazovali žiadny fenolický obsah. Zistilo sa, že všetky PR extrakty vykazovali obsah kvercetínu stanovený pomocou HPLC analýzy. Okrem toho PR extrakt zo šupiek zrelého ovocia Maceráciou (PR-RM) poskytol najvyšší obsah kvercetínu 190,10 ± 0,28 lg/ml. (obr. 2).

3.3. Antioxidačné a hubové tyrozinázové inhibičné aktivity extraktov PR

Tabuľka 2 demonštruje tri antioxidačné aktivity, vrátane aktivity zachytávania voľných radikálov metódou DPPH, inhibície peroxidácie lipidov metódou železito-tiokyanátovej; chelatácia kovu metódou FIC; a inhibíciu hubovej tyrozinázy PR extraktov. Väčšina extraktov PR okrem extraktov PR-LM, PR-BM a PR-S-Sox vykazovala vynikajúcu aktivitu zachytávania voľných radikálov s rozsahom SC5{{10}} 0.{101} {18}}23 – {{20}}.045 mg/ml, čo bolo porovnateľné so štandardnou kyselinou ʟ-askorbovou (SC50 z 0. 036 ± 0.{{40}}03 mg/ml) pri p < 0.05. Okrem toho extrakt PR-LM vykazoval najvyššiu inhibíciu peroxidácie lipidov s LC50 0,274 ± 0,029 mg/ml a aktivitu chelatácie kovov s MC50 0,203 ± 0,021 mg/ml, čo bolo porovnateľné so štandardným a-tokoferolom (LC50 0,122 ± 0,015 mg/ml) a EDTA (MC50 0,518 ± 0,034 mg/ml), v tomto poradí (p < 0,05). Všetky extrakty PR vykazovali aktivitu inhibície tyrozinázy húb, zatiaľ čo extrakt PR-R-Sox vykazoval najvyššiu aktivitu s IC50 0,04 ± 0,02 mg/ml, čo bolo porovnateľné so štandardnou kyselinou kojovou (IC50 0,02 ± 0,01 mg /ml) (p < 0,05).

3.4. Cytotoxicita PR extraktov

Fig. 3 showed the cytotoxicity on the B16F10 cells (A) human skin fibroblasts by the MTT assay of the PR extracts. All of the PR  extracts at the concentrations of 0.01 and 0.1 mg/mL had no cytotoxicity on the B16F10 cells and human skin fibroblasts, respectively since they gave>80 percent relatívnej životaschopnosti v porovnaní s neliečenou skupinou. Napriek tomu sa vyššie koncentrácie všetkých PR extraktov považovali za cytotoxické na tieto bunky. Vyššia koncentrácia ako 1 mg/ml nebola testovaná, pretože sa nemohla úplne rozpustiť v rozpúšťadle.

3.5. Anti-melanogenéza PR extraktov

In this study, there is a screening method from many samples,  therefore we highlight only the highest concentration that had no cytotoxicity on both cells and might have the highest anti-melanogenesis activity. This concentration is the highest concentration that showed no cytotoxicity on the B16F10 cells after being treated with the PR extracts and kojic acid (>80 percent životaschopnosti buniek) (údaje nie sú zobrazené). Obr. 4 ukazuje anti-melanogenézu na myších melanómových (B16F10) bunkách PR extraktov v koncentrácii 0,01 mg/ml. Všetky PR extrakty vykazovali antimelanogenézu na bunkách B16F10. PR extrakty z listov, konárov, semien a zrelých a mladých plodov pomocou Soxhletovej extrakcie (PR-L-Sox, PR-B-Sox, PR-S-Sox, PR-R-Sox a PR-Y-Sox ) vykazovali najvyššiu antimelanogenézu 50,6 – 54,1 percenta, čo bolo dramaticky lepšie ako štandardná kyselina kojová (37,9 ± 3,9 percenta) asi 1,5-krát, zatiaľ čo aktivita extraktov RB-M a PR-YM bola porovnateľná s štandardná kyselina kojová (p < 0,05).

3.6. Stimulácia biosyntézy kolagénu PR extraktov

Všetky PR extrakty v koncentrácii {{0}}},1 mg/ml vykazovali stimuláciu biosyntézy kolagénu na fibroblastoch ľudskej kože stanovenú metódou Sirius Red. Koncentrácia 0,1 mg/ml PR extraktov a kyseliny ʟ-askorbovej je najvyššia koncentrácia, ktorá nevykazovala žiadnu cytotoxicitu na fibroblasty ľudskej kože. PR extrakty z listov a konárov pomocou Soxhletovej extrakcie (PR-LM a PR-BM extrakty) preukázali najvyššiu biosyntézu kolagénu (16,46 ± 0.{{20}}7 percent a 14,66 ± 0,09 percenta, čo bolo nižšie ako štandardná kyselina ʟ-askorbová (34,07 ± 0,03 percenta) asi 2-krát (p < 0,05) (obr. 5).

3.7. Stimulácia génov proti starnutiu

Obr. 6 ukazuje stimuláciu génov proti starnutiu vrátane génov Sirt1 a Foxo1 na ľudských kožných fibroblastoch extraktov PR pri 0.01 mg/ml sa určilo technikou RT-PCR. Koncentrácia {{20}}.01 mg/ml PR extraktov a resveratrolu je najvyššia koncentrácia, ktorá nevykazovala žiadnu cytotoxicitu na fibroblasty ľudskej kože. Zaujímavé je, že extrakty PR-L-Sox, PR-S-Sox, PRR-M, PR-R-Sox, PR-YM a PR-Y-Sox pri 0,01 mg/ml vykazovali najvyššiu stimuláciu proti starnutiu Foxo1. expresia mRNA (495 bp), ktorá bola dramaticky lepšia ako štandardný resveratrol asi 2-krát (p < 0,05). Na druhej strane extrakty PR-S-Sox a PR-Y-Sox vykazovali najvyššiu stimuláciu expresie Sirt1 anti-aging mRNA (160 bp), ktorá bola nižšia ako u resveratrolu (p < 0,05). Hoci takmer všetky extrakty PR preukázali stimuláciu expresie génu proti starnutiu, extrakty PR-R-Sox a PR-BM nestimulovali expresiu Sirt1 a Foxo1.

4. Diskusia

Niekoľko prírodných rastlín bolo zvyčajne testovaných na ich fytochemikálie, bioaktívne zlúčeniny a biologické vlastnosti, aby sa našli nové sľubné prírodné zložky pre medicínu, potravinové doplnky a kozmetické aplikácie. Ružový rambutan je jedným z miestnych plodov v okrese Klung, provincia Chanthaburi, Thajsko. Existuje niekoľko vedeckých správ o jeho biologických a farmaceutických aktivitách, najmä o jeho aktivite proti starnutiu. V tejto štúdii bolo päť častí ružového rambutanu, vrátane listov, konárov, semien a šupiek zo zrelého a mladého ovocia, extrahovaných Maceráciou a Soxhletovou extrakciou s použitím 95 percentného etanolu ako rozpúšťadla. Niekoľko novoobjavených fytochemikálií vrátane kvercetínu, ktoré sú sekundárnymi metabolitmi rastlín, bolo študovaných z hľadiska účinkov proti starnutiu buniek, zvierat a ľudí (Phuong et al., 2020). Podľa zistení tejto štúdie boli flavonoidy hlavnými fytochemikáliami PR extraktov. Už skôr bolo uvedené, že extrakty z iných druhov rambutanu obsahovali fytochemikálie vrátane flavonoidov, tanínov a karotenoidov, ktoré korelovali s ich antioxidačnými vlastnosťami (Rohman, 20}17). Neprítomnosť xantónov pri Soxhletovej extrakcii môže byť spôsobená vysokými teplotami (Yuvanatemiya a kol. 2022, Sankeshwari a kol., 2018). Kvercetín je jednou z najrozšírenejších fenolových a flavonoidných zlúčenín, ktoré sa nachádzajú v mnohých druhoch ovocia a zeleniny, ako aj v rambutane (Phuong et al., 2020). V tejto štúdii môže vyššia teplota (80 stupňov C) Soxhletovho procesu extrahovať tepelne nelabilnú látku vrátane kvercetínu viac ako studený proces. Množstvo kvercetínu stanovené pomocou HPLC analýzy sa môže použiť ako marker na kontrolu kvality PR extraktov vo výrobnom meradle. Pearsonov korelačný koeficient (R2 ) medzi TFC a TPC extraktov z PR bol 0,825, čo znamená, že ide o veľmi silný vzťah (R2=± 0,80 až ± 1.00) (p < 0,01), čo znamená ak sa zvýši TFC, dramaticky sa zvýši aj TPC. Okrem toho koeficient R2 medzi TPC a obsahom kvercetínu v PR extraktoch bol 0,650, čo klasifikovalo silný vzťah (R2=± 0,60 až ± 0,79) (p < 0,05). Rozdiel vo výťažkoch extrakcie, fytochemikáliách, ako aj TPC, TFC a kvercetín extraktov z PR môže byť ovplyvnený rozpúšťadlami, extrakčnými procesmi a teplotami (Chutoprapat et al., 2020). Niekoľko štúdií zistilo, že flavonoidové a fenolové zlúčeniny, ako aj kvercetín, majú širokú škálu biologických a farmaceutických aktivít, vrátane antimikrobiálnych, antioxidačných, protizápalových a anti-agingových aktivít (Panche et al., 2016, Shahidi a Yeo, 2018, Musika a kol., 2021, Wang a kol., 2022).

Ako už bolo uvedené, radikálne formy kyslíka alebo ROS môžu spôsobiť poškodenie súvisiace s vekom na úrovni buniek a tkanív, čím sa urýchli chronologické a environmentálne starnutie charakterizované vráskami a atypickou pigmentáciou (Papaccio et al., 2022). Prírodné antioxidanty dokážu vychytávať voľné radikály, čo vedie k zníženiu protizápalových účinkov, prevencii rakoviny, cukrovky a mozgových porúch, zníženiu krvného tlaku a aterosklerózy a spomaleniu starnutia pokožky (Miracle Uwa, 2{{20} }17). Vychytávanie voľných radikálov, inhibícia peroxidácie lipidov a chelatácia kovov boli široko skúmané ako systémy na skúmanie antioxidačnej aktivity prírodných produktov. Na vychytávanie voľných radikálov DPPH sa nepárne elektróny v molekulách DPPH redukujú prijatím atómu vodíka z antioxidantov, aby sa stali molekulami hydrazínu (Ionita, 2021). Metóda peroxidácie lipidov je založená na oxidácii iónov medi (II) na ióny medi (III), ktoré prechádzajú emulziou kyseliny linolovej (Bakir et al., 2017), zatiaľ čo metóda chelatácie kovov je založená na oxidácii medi (II). za vzniku železito-ferrozínového komplexu (Wong et al., 2014). Prítomnosť obsahu flavonoidov a fenolov v PR extraktoch z tejto štúdie mohla prispieť k trom antioxidačným aktivitám. Zistilo sa, že fenolové zlúčeniny (napr. korilagín, kyselina ellagová, geraniín a kvercetín) z extraktov rambutánu vykazujú antioxidačnú aktivitu vychytávaním radikálov DPPH a inhibíciou peroxidácie lipidov (Hernández-Hernández et al., 2019, Phuong et al., 2019, Monrroy a kol., 2020, Araujo a kol., 2021). Je to podobné ako v predchádzajúcich správach, že extrakty zo šupiek z iných druhov rambutanu vykazujú vysoké TPC a TFC, ako aj silnejšie antioxidačné aktivity, ako je ABTS, DPPH, zachytávanie O2-, test na redukciu železa (FRAP ), chelatačné činidlá a peroxidácia lipidov (Lourith a kol., 2017, Rohman, 2017, Monrroy a kol., 2020). Je zaujímavé, že koeficient R2 medzi chelatáciou kovu a inhibíciou peroxidácie lipidov PR extraktov ukázal veľmi silnú pozitívnu koreláciu 0,953, klasifikujúc silný vzťah na významnej úrovni p < 0,01.

【Ďalšie informácie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】