Vplyv simulácie ľudského trávenia in vitro na obsah fenolových látok a biologické aktivity vodných extraktov z druhov tureckého cistu, časť 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

3. Diskusia

Voľné radikály môžu napadnúť proteíny, lipidy alebo DNA, aby získali elektrón, čo má za následok rôzne zdravotné problémy. Z tohto dôvodu je nevyhnutné vyvážiť antioxidačný systém tela a voľné radikály vznikajúce oxidáciou. V prípade zhoršenia tejto rovnováhy vzniká oxidačný stres [29]. Oxidačný stres je jedným z hlavných faktorov, ktoré vedú k rôznym chronickým poruchám, ako je rakovina, cukrovka, kardiovaskulárne choroby, Alzheimerova choroba atď. Aj keď v ľudskom tele existujú samo-antioxidačné systémy na boj proti oxidačnému poškodeniu tkanív a orgánov, tieto obranné systémy môžu stratiť svoju účinnosť v dôsledku rôznych podmienok, ako je nadmerná konzumácia alkoholu, fajčenie, stres, chronické užívanie drog a radiácia atď. [30]. Rôzne vedecké správy ukázali, že sekundárne rastlinné metabolity zohrávajú významnú úlohu pri prevencii oxidačného stresu a jeho škodlivých účinkov [13,14,31] Aj keď je biologická dostupnosť dôležitým parametrom ovplyvňujúcim biologickú aktivitu týchto zlúčenín, nebola braná do úvahy. väčšina štúdií. Je však dobre známe, že sekundárne metabolity podliehajú štrukturálnym transformáciám v dôsledku rôznych podmienok pH, enzymatickej aktivity a telesnej teploty v gastrointestinálnom systéme. Okrem toho sú významnými faktormi ovplyvňujúcimi ich biologickú dostupnosť aj chemické charakteristiky sekundárnych metabolitov, ako je molekulová hmotnosť, polarita a stupeň väzby na makromolekuly v rastlinnej matrici [13]. V súlade s tým je absorpcia zlúčenín alebo ich metabolitov do krvného obehu po požití nevyhnutná na uplatnenie ich systémových fyziologických účinkov. Simulačné modely trávenia in vitro môžu poskytnúť dôkazy na posúdenie možných charakteristík biologickej dostupnosti látok. Zatiaľ čo potvrdenie v testoch na ľuďoch je potrebné na uplatnenie akejkoľvek funkčnej vlastnosti, simulačné modely in vitro sa široko používajú ako alternatívy k štúdiám in vivo alebo testom na ľuďoch, ktoré sú často eticky diskutabilné, náročné na zdroje, drahé a časovo náročné [32].

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Niekoľko výskumníkov tiež skúmalo antioxidačný potenciál extraktov pripravených z rôznych orgánov druhu Cistus. Podľa literárneho prehľadu ide o prvú štúdiu o druhoch Cistus, ktorá sa týka biologickej dostupnosti fenolových látok a ich vplyvu na antioxidačnú aktivitu pomocou simulačného modelu trávenia in vitro. Karas a kol. [33] navrhli, že 10 percent polyfenolových zložiek zostáva nestrávených v rastlinnej matrici a 90 percent z nich podlieha tráveniu v žalúdočnej alebo črevnej fáze (približne 48 percent a 52 percent v uvedenom poradí). Ako už bolo spomenuté, všetky množstvá fenolov vo vodných extraktoch boli negatívne ovplyvnené postupom simulácie ľudského trávenia in vitro. Vo fenolových obsahoch biodostupných vzoriek všetkých extraktov boli teda zistené významné straty. Okrem toho boli celkové koncentrácie proanthokyanidínu vo vzorkách IN pod hranicou detekcie vo všetkých vodných extraktoch. Rôzne štúdie tiež podnietili negatívny vplyv procesu trávenia na fenolové zlúčeniny v rastlinných extraktoch a tým súvisiace bioaktivity. Napríklad sme uviedli celkový obsah fenolov v Salvia virgata Jacq. bol tiež nepriaznivo ovplyvnený procesom trávenia v našej predchádzajúcej štúdii Okrem toho množstvo hlavných metabolitov extraktu, tj rutínu a kyseliny rozmarínovej, malo tendenciu klesať [13]. Naproti tomu viaceré štúdie uviedli protichodné výsledky. V štúdii Celeba a kol. [34] pozorovali zvýšenie celkového množstva kyseliny fenolovej, flavonoidov a fenolov v biodostupných vzorkách metanolového extraktu z Hypericum perfoliatum L. V skutočnosti hlavné metabolity, kvercitrín, kyselina chlorogénová a kyselina galová, mali pomery biologickej dostupnosti nad 100 percent . Tieto štúdie ukázali, že účinky procesu trávenia sa môžu líšiť v závislosti od rastlinných materiálov. Na objasnenie týchto rozdielov je nevyhnutné zvážiť mechanizmus účinku tráviaceho systému na fenolické látky. (výhody bioflavonoidov) Serra a kol.[35] navrhol, že fenolové zlúčeniny sa nachádzajú hlavne v glykozidoch, polyméroch a esterových formách v matrici rastlín a pred absorpciou sa hydrolyzujú v tráviacom systéme. Štrukturálne premeny fenolových zlúčenín v gastrointestinálnom trakte môžu ovplyvniť rôzne faktory. Napríklad zlúčeniny s vyššou molekulovou hmotnosťou, ako sú proantokyanidíny alebo prokyanidíny, musia byť pred absorpciou v čreve hydrolyzované. Štruktúra rastlinnej matrice je tiež významným faktorom biologickej dostupnosti fenolových látok; (kúpiť cistanche)fenolové zlúčeniny sa môžu viazať na makromolekuly v matrici rastliny, ako sú vlákna, proteíny a molekuly lipidov. Len uvoľnené fenolové zložky z matrice sa teda môžu stať absorbovateľnými z gastrointestinálneho traktu. Okrem toho medzi ďalšie rozhodujúce faktory ovplyvňujúce transformáciu chemickej štruktúry fenolových zlúčenín patria rôzne hodnoty pH a enzymatické pôsobenie črevnej mikroflóry [36]. Vo svetle týchto údajov môžeme predpokladať, že rozdielne výsledky získané z podobných typov experimentálnych štúdií môžu byť spôsobené zložitosťou tráviaceho systému a zložením rastlinnej matrice. Ako je uvedené v tabuľke 3, biologicky dostupné vzorky extraktov Cistus vykazovali slabšiu antioxidačnú aktivitu ako nestrávené a postgastrické náprotivky v dôsledku ich nižšieho obsahu fenolov.

Cistanchemôcťzlepšiť imunitu

Okrem toho oba extrakty C. saluifolius vykazovali lepšiu antioxidačnú aktivitu v testoch DPPH, CUPRAC, FRAP a TOAC v porovnaní s inými druhmi. Okrem toho oba extrakty C. paroifforus vykazovali vyššiu aktivitu zachytávania radikálov DMPD ako extrakty iných druhov. Ako je uvedené v tabuľke 1, celkový obsah fenolových látok, flavonoidov a kyseliny fenolovej v C. salviifolius bol vyšší ako v ostatných vzorkách. Vyšší antioxidačný potenciál extraktov C. salviifolius teda môže súvisieť s jeho fenolickým obsahom.

Okrem toho zníženie antioxidačných potenciálov, inhibičných aktivít na enzýmy súvisiace so sacharidmi a AGE biologicky dostupných vzoriek môže súvisieť s poklesom markerových flavonoidových glykozidov. Extrakty Cistus však obsahovali aj iné fenolické látky, ako je uvedené na obrázku 1. Preto je potrebná podrobná chromatografická analýza extraktov na sledovanie vplyvu trávenia na biologickú aktivitu.

Inhibičný potenciál rastlinných extraktov na tráviace enzýmy nedávno pritiahol väčšiu pozornosť kvôli obavám o bezpečnosť syntetických inhibítorov. Preto bol inhibičný účinok rastlinných extraktov stanovený v niekoľkých štúdiách a tento účinok bol vo všeobecnosti spojený s fenolickými látkami, ako sú flavonoidy, fenolové kyseliny, proantokyanidíny atď. Sun et al. [37] navrhli, že polyfenolové zlúčeniny prejavujú svoje inhibičné účinky väzbou na vyššie uvedené enzýmy pomocou hydrofóbnych síl a nekovalentných väzieb. Preto inhibícia aktivity enzýmov o-amylázy a a-glukozidázy polyfenolmi súvisí s ich molekulárnymi štruktúrami. Zatiaľ čo tento interakčný mechanizmus bol študovaný pomocou rôznych techník, ako je kinetika inhibície, molekulárne dokovanie, zhášanie fluorescencie atď., zatiaľ sa nedospelo k žiadnemu istému záveru [38]. Mnohé štúdie však uvádzajú, že inhibícia tráviacich enzýmov rastlinných extraktov priamo súvisí s ich fenolickým obsahom. Podobné štúdie o inhibičných aktivitách enzýmov druhov Cistus boli tiež opísané skôr. Sayah a kol. [39] skúmali inhibičné aktivity -amylázy a -glukozidázy 8{{10}}-percentných metanolových a vodných extraktov z C. monspeliensis a C. saluifolius. Ich výsledky boli v súlade so súčasnou štúdiou a odhalili, že vodný extrakt C. salvifolius preukázal vyššiu o-glukozidázu (ICso ug/ml:0.95±0.14) a -amylázu (IC5{ {55}} ug/ml:217,1±0,15) inhibičná aktivita ako vodný extrakt C. monspeliensis （IC50 ug/ml∶ 14,58±1,26） a （IC50 4g/ml:886,10±0,10). Inhibičné rýchlosti oboch vodných extraktov na tieto enzýmy boli vyššie ako referenčná zlúčenina akarbóza (ICso ug/ml:18,01±2.00)Podobne ako v našej štúdii zistili koreláciu s inhibičnými rýchlosťami enzýmov a celkovým množstvo fenolov a flavonoidov. Celkový obsah fenolov a celkový obsah flavonoidov vo vodnom extrakte C. saloijfolius (408,43 ± 1,09 mg GAE a 140 00 ± 1,15 RE) boli vyššie ako vo vodnom extrakte C. monspeliensis (261,76 ± 1,9 mg GAE a 78.00±1,15 RE). Orhan a kol. [40] tiež skúmali inhibičný potenciál 80 % vodných a etanolových extraktov z listov C. laurifolius na tráviaci enzým. Podľa ich výsledkov 80 percent etanolového extraktu (71,7 percent ± 0,6) vykazovalo silnú inhibičnú aktivitu na amylázu v porovnaní s vodným extraktom (39,3 percent ± 2,2) pri koncentrácii 1 mg/ml. Navrhli, že fenolové zlúčeniny, najmä flavonoidy, priamo ovplyvňujú sekréciu inzulínu tým, že zabraňujú apoptóze beta-buniek a podporujú antidiabetickú aktivitu. Táto hypotéza, korelujúca s našimi výsledkami, ukazuje, že ND vzorka vodných extraktov C. salviifolius mala najvyšší celkový obsah flavonoidov a fenolov a najväčšiu inhibičnú aktivitu -amylázy a o-glukozidázy. Ako je uvedené v tabuľke 4, vodný extrakt C. salviifolius vykazoval lepšie inhibičné aktivity na tráviace enzýmy ako ostatné extrakty. Okrem toho vzorky IN vodných extraktov obsahovali nižšie množstvá fenolov a flavonoidov ako vzorky ND, a preto v tejto práci odhalili nižšie enzýmové inhibičné aktivity. Zatiaľ čo fenolické obsahy extraktov boli negatívne ovplyvnené procesom trávenia, stále vykazovali významnú inhibičnú aktivitu na tráviace enzýmy. V niekoľkých štúdiách boli flavonoidové glykozidy uvedené ako hlavné metabolity rastlinných extraktov so silným inhibičným potenciálom -amylázy a -glukozidázy[41-43]Zatiaľ čo inhibičný mechanizmus fenolových zlúčenín na tráviace enzýmy nebol doteraz odhalený, štruktúra- štúdie vzťahu aktivity sa uskutočnili na niektorých fenolových zložkách, ako sú flavonoidy, fenolové kyseliny, proantokyanidíny a taníny. Štúdie vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou flavonoidov ukázali, že dvojitá väzba C2=C3 C-kruhu zvyšuje potenciál takýchto zlúčenín inhibovať tráviaci enzým. Pretože táto väzba zvyšuje elektrónovú hustotu, zvyšuje sa sila interakcie medzi flavonoidom a enzýmom [44]. Okrem toho hydroxylové skupiny na C-5 a C-7 uľahčujú inhibičný potenciál flavonoidov na -amylázu. Bolo tiež navrhnuté, že hydroxylácia kostry flavonoidov pozitívne ovplyvňuje ich inhibičný potenciál na enzýmy a-amylázy a -glukozidázy[45]. Ako bolo uvedené vyššie, všetky markerové flavonoidy v tejto štúdii boli flavonolové glykozidy nesúce tieto štruktúrne požiadavky opísané vyššie. Avšak po in vitro štiepení ich súvisiace aktivity významne klesli v biologicky dostupných vzorkách vodných extraktov.

Vo všeobecnosti inhibičný potenciál rastlinných extraktov na AGE súvisí s niekoľkými faktormi, tj s ich fenolickým obsahom, antioxidačným potenciálom, schopnosťou chelatovať kovy, proteínovými interakciami a aktivitami blokovania AGE receptorov [13]. Ako je uvedené v tabuľke 4, biologicky dostupné vzorky vodných extraktov vykazovali nižšie AGE inhibičné aktivity v porovnaní so vzorkami ND, pretože in vitro štiepenie nepriaznivo ovplyvnilo obsah fenolov v extraktoch. Podľa aktuálnych výsledkov štúdie bola vzorka ND vodného extraktu C. (cistanche a tongkat ali reddit) saluifolius mal najvyššiu inhibičnú aktivitu voči AGE, ako aj celkový obsah fenolov a flavonoidov. Na porovnanie, IN vzorka vodného extraktu C. monspeliensis vykazovala najslabší potenciál inhibície AGE, čo možno pripísať jeho najnižším celkovým obsahom flavonoidov a fenolov. Keďže flavonoidy sú rozšírené v rastlinných extraktoch, ovocí, zelenine a nápojoch, niekoľko štúdií zintenzívnilo inhibičný potenciál flavonoidov na AGE formácie. Rovnaké flavonoidy priradené ako markerové fenolické látky v tejto štúdii boli tiež uvedené ako markerové zlúčeniny v iných štúdiách[46-48].

Podobne ako pri inhibícii tráviacich enzýmov, AGE inhibičné aktivity flavonoidov boli stimulované C2=C3 dvojitou väzbou a hydroxyláciou A a C kruhov. Naviazanie cukru na flavonoidový skelet však vedie k zníženiu inhibičnej aktivity [49]. Na druhej strane Cervantes-Lauren et al.[50] naznačili, že flavon{5}}glykozidov mal väčší potenciál inhibície AGE ako ostatné flavonoidové glykozidy. Táto hypotéza môže byť vysvetlením zníženej inhibície AGE v biologicky dostupných vzorkách. Napríklad kvercitrín a hyperozid neboli detegované v biologicky dostupných vzorkách vodného extraktu C. monspeliensis, čo je dôvodom nižšej aktivity IN vzoriek C. monspeliensis v porovnaní s extraktmi z iných druhov. Aj keď kvercitrín nebol detegovaný vo vodnom extrakte C. saloifolius, významne vyššie množstvá hyperozidu a salidrozidu môžu byť príčinou jeho vysokej aktivity inhibície AGE. Vo všeobecnosti sa pozorovala pozitívna korelácia medzi obsahom markerových flavonoidov vo vzorkách a ich inhibičnými potenciálmi na AGE.

4. Materiál a metódy

4.1.Chemikálie

Všetky referencie, enzýmy a chemikálie použité v experimentoch boli zakúpené od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). V experimentoch boli použité materiály analytickej kvality.

4.2. Vzorky rastlín

Letecké časti C.creticus a C.saloifolius boli zhromaždené z kampusu Yeditepe University (Kayisdagi, Istanbul) počas posledného aprílového týždňa 2018. Letecké časti C.mon-speliensis a C. paroiflorus boli zhromaždené z blízkosti Alacant Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Izmir v druhom májovom týždni 2018. Nadzemné časti C. laurifolius boli zozbierané z cesty Kemer-Doganhisar, Konya, v prvý júnový týždeň 2018. Prof. Dr. Erdem Yesilada overil pravosť rastlinných materiálov. Poukazové exempláre pre C. creticus (YEF18013), C. Lauri folium (YEF18017), C. monspeliensis (YEF18015), C. paroiflorus (YEF18016) a C.salvifolius (YEF18014) boli uložené na Herbárskom oddelení, Farmaceutická fakulta farmácie, Yeditepe University, Istanbul, Turecko. 4.3. Postup extrakcie

Vodná extrakcia bola zvolená, pretože sa bežne používa ako prípravná technika v tradičnej medicíne. Hrubo na vzduchu vysušené a práškové vzdušné časti druhov Cistus (100 g) boli extrahované horúcou destilovanou vodou (80 stupňov, 1,5 1) pomocou trepacieho zariadenia počas 15 minút. Potom sa vodné extrakty prefiltrovali cez filtračný papier a odparili do sucha za zníženého tlaku. Po ukončení lyofilizácie sa extrakty rozpustili v destilovanej vode na ďalšie spracovanie (nestrávená vzorka: ND) (výťažok extraktov: 13,04 percent pre C. creticus, 15,7 percent pre C. laurifolus, 12,8 percent pre C. monspeliensis ,14,94 percenta pre C.parviflorus,14,74 percenta pre C.salvifolius). 4.4. Metóda simulácie ľudského trávenia in vitro

Simulačný model ľudského trávenia bol aplikovaný na vzorky Cistus in vitro podľa metódy opísanej skôr Celebom a kol.[34]. Najprv sa 1 g NaCl a 1,6 g pepsínu rozpustilo v 500 ml destilovanej vody, aby sa získal simulovaný roztok žalúdočnej tekutiny (SGF) Neskôr sa pH roztoku SGF upravilo na 2 pomocou HCl (5 M); 17,5 ml tohto roztoku sa zmiešal s 2,5 ml vzoriek rastlín a táto zmes sa umiestnila do trepacieho vodného kúpeľa pri 37 stupňoch na 2 hodiny, aby sa napodobnili peristaltické pohyby tráviaceho systému. Po 2 hodinách sa vzorky vložili do ľadového kúpeľa, aby sa inaktivovali enzymatické reakcie; 2 ml vzoriek sa odložili ako "postgastrická" (PG) vzorka na ďalšie experimenty. Celulózová dialyzačná membrána naplnená správnym množstvom NaHC03 (1 M, pH 7) bola umiestnená v studených roztokoch vzoriek; teda gastrointestinálna absorpcia bola napodobnená. Potom sa k roztokom pridalo 4,5 ml roztoku žlčových kyselín/pankreatínu a zmes sa inkubovala ďalšie 2 hodiny pri 37 stupňoch. Nakoniec sa tekutina vo vnútri dialyzačnej membrány získala ako "biologicky dostupná" vzorka (IN). Po ukončení procedúry boli všetky vzorky uchované pri -20 stupňoch pre ďalšie experimenty. 4.5. Odhad fenolového profilu in vitro 4.5.1. Skúška celkového obsahu fenolu Spektrofotometrické stanovenie celkového obsahu fenolov vo vzorkách sa uskutočňovalo v 96-templátovej doštičke s jamkami podľa metódy opísanej skôr v Barak et al.【32】;75 ul NagCO3（20 percent v H2O ） sa pridalo do 20 μl čerstvo pripravenej vzorky a referenčných roztokov. Potom sa so zmesou spojilo 100 ul Folin-Ciocalteuovho činidla. Po 30 minútach inkubácie pri teplote miestnosti v tme sa merala absorbancia pri 690 nm. Kyselina galová sa použila ako referenčný roztok v rôznych koncentráciách na vytvorenie kalibračnej krivky a celkový obsah fenolov sa vyjadril ako ekvivalenty kyseliny galovej (GAE). 4.5.2. Skúška celkového obsahu flavonoidov Spektrofotometrické stanovenie celkového obsahu flavonoidov vo vzorkách sa uskutočnilo v šablóne 96-jamkovej platne v súlade s predtým vysvetlenou metódou Bardakci et al. 【51】; 150 μl 75 percentného etanolu, 10 μl chloridu hlinitého a 10 μl 1M trihydrátu octanu sodného sa spojilo s 50 ul roztoku vzorky a referenčného roztoku, oddelene. Potom sa tieto zmesi inkubovali pri teplote tmavej miestnosti počas 30 minút. Po inkubačnej dobe sa vypočítala absorbancia pri 405 nm. Kvercetín sa použil ako referenčný roztok v rôznych koncentráciách na vytvorenie kalibračnej krivky a celkový obsah flavonoidov bol vyjadrený ako ekvivalenty kvercetínu (QE).

4.5.3. Skúška celkového obsahu kyseliny fenolovej

Celkový obsah kyseliny fenolovej vo vzorkách sa meral spektrofotometricky podľa postupu opísaného skôr Barakom a kol. [52]. Najprv sa správne množstvá dusitanu sodného a molybdénanu sodného rozpustili v destilovanej vode, aby sa získalo Arnowovo činidlo. Potom sa 1 ml vzoriek zmiešalo s 1 ml Arnowovho činidla, 1 ml 0,1 M HCl a 1 ml 1 M NaOH, oddelene. Potom sa objem zmesi upravil na 10 ml destilovanou vodou a okamžite sa odčítala absorbancia pri 490 nm. Kyselina kávová sa použila ako referenčný roztok v rôznych koncentráciách na získanie kalibračnej krivky a celkový obsah kyseliny fenolovej sa udával ako ekvivalenty kyseliny kávovej (CAE).

4.5.4. Skúška celkového obsahu proanthokyanidínu

Spektrofotometrické stanovenie celkového obsahu proanthokyanidínu vo vzorkách sa uskutočnilo v šablóne 96-jamkovej platne podľa metódy Baraka a kol. [11]. Stručne, 25 ul roztokov vzoriek sa zmiešalo so 150 ul 4 percentného vanilínu a 75 ul roztokov HCl (32 percent), v danom poradí. Po 15 minútach inkubácie pri teplote tmavej miestnosti sa absorbancia upravila na 492 nm. Hydrát katechínu sa použil ako referenčný roztok v rôznych koncentráciách na získanie kalibračnej krivky. Ako kontrolný roztok sa použil metanol. Celkový obsah proanthokyanidínu vo vzorkách bol uvedený ako katechínové ekvivalenty (CE).

4.6. Testy aktivity zachytávania voľných radikálov 4.6.1. Test aktivity zachytávania voľných radikálov DPPH

Aktivita zachytávania radikálov DPPH vzoriek sa stanovila v šablóne 96-jamkovej platne podľa metódy modifikovanej Celebom a kol.[53]. Najprv sa čerstvo pripravilo 150 uM roztoku DPPH. Potom sa 200 ul roztoku DPPH zmiešalo s 25 ul roztokov vzoriek. Potom bola táto zmes inkubovaná pri teplote tmavej miestnosti počas 50 minút. Absorbancia sa vypočítala pri 540 nm. Butylovaný hydroxytoluén (BHT) sa použil ako referenčný roztok v rôznych koncentráciách. Ako kontrolný roztok sa použil metanol. Aktivita vzoriek bola prezentovaná ako EC50, čo zodpovedá koncentrácii vykazujúcej 50 percentnú aktivitu.

4.6.2. Test aktivity DMPD na zachytávanie radikálov

Aktivita zachytávania radikálov DMPD* (N,N-dimetyl-p-fenyléndiamín) vzoriek sa uskutočňovala v šablóne 96-jamkovej platne podľa metódy opísanej skôr v Inan et al. [13]. Po prvé, 10{{10}} mM roztok DMPD plus, 0,05 M FeCl; 6H20 roztok a 0,01 M acetátový pufor boli čerstvo pripravené. Potom sa zmiešal 1 ml roztoku DMPD, 100 ml acetátového tlmivého roztoku a 0,2 ml roztoku FeCl3-6H2O a neskôr sa 15 ul roztokov vzoriek spojilo s 210 μl tejto zmesi. Po inkubačnej dobe pri teplote tmavej miestnosti počas 50 minút sa merala absorbancia pri 492 nm. Trolox sa použil ako referenčný roztok v rôznych koncentráciách na získanie kalibračnej krivky. Koncentrácie roztokov vzoriek boli 1 mg/ml. Aktivity vzoriek zachytávajúce radikály DMPD boli uvedené ako ekvivalenty Troloxu (TE). 4.7. Skúšky aktivity znižovania kovov

4.7.1. Ferric Reduceing Antioxidant Power Assay (FRAP)

Stanovenie FRAP aktivity vzoriek sa uskutočnilo na 96-jamkovej doštičke podľa postupu opísaného skôr v Bardakci et al.[54]. Na začiatku experimentu bolo činidlo FRAP vytvorené zmiešaním acetátového pufra, tripyridyltriazínu železitého a roztokov FeCl;6H2O. Potom bolo činidlo FRAP vložené do 37-stupňovej pece na 30 min. Potom sa 10 ul roztokov vzoriek spojilo s 30 ul destilovanej vody a 260 ul FRAP činidla. Po inkubačnej dobe pri 37 stupňoch počas 30 minút sa absorbancia upravila na 593 nm. Na vyhodnotenie výsledkov sa vytvorila štandardná krivka použitím rôznych molarít roztoku síranu železnatého (0,{15}} mM). BHT sa použil ako referenčný roztok v rôznych koncentráciách. FRAP aktivity vzoriek boli prezentované ako mM FeS04 v 1 g suchého extraktu.

4.7.2. Test antioxidačnej kapacity znižujúci med (CUPRAC)

Aktivita CUPRAC vzoriek bola stanovená na 96-jamkovej doštičke podľa metódy modifikovanej Celebom a kol. 【31】; 85 ul CuS04 (10 mM), roztoky neocuprainu a octanu amónneho a 51 ul destilovanej vody sa pridalo do 43 ul roztokov vzoriek, oddelene. Po inkubačnej dobe (20 minút) pri 50 stupňoch vo vodnom kúpeli sa merala absorbancia pri 450 nm. Kyselina askorbová sa použila ako referenčný roztok v rôznych koncentráciách na získanie kalibračnej krivky. Aktivity CUPRAC vzoriek boli prezentované ako ekvivalenty kyseliny askorbovej (AAE). 4.8. Test celkovej antioxidačnej aktivity (TOAC)

Stanovenie celkovej antioxidačnej aktivity vzoriek sa uskutočňovalo na 96-jamkovej doštičke podľa postupu Celeba a kol. [55]. Najprv sa zmiešalo určité množstvo dihydrogenfosforečnanu sodného, ​​tetrahydrátu molybdenanu amónneho a kyseliny sírovej, aby sa získal roztok oktaacetátu trehalózy. Potom sa 300 ul roztoku oktaacetátu trehalózy pridalo k 30 ul roztokov vzoriek. Po inkubačnej dobe pri 95 stupňoch vo vodnom kúpeli počas 90 minút sa stanovila absorbancia pri 690 nm. Kyselina askorbová sa použila ako referenčný roztok v rôznych koncentráciách na získanie kalibračnej krivky. Aktivity oktaacetátu trehalózy vo vzorkách boli vyjadrené ako ekvivalenty kyseliny askorbovej (AAE). 4.9. Odhad indexu biologickej dostupnosti

Index biologickej dostupnosti (BAvI) sa vypočítal podľa teoretickej rovnice, ktorú opísal Inan et al.[13]:

BAVI=CIN/CND „Index biologickej dostupnosti“ (BAvI) bol opísaný ako pomer počtu fenolických látok v biologicky dostupnej vzorke (IN) k počtu fenolov v nestrávenej vzorke (ND). 4.10. Kvantifikácia markerových flavonoidov pomocou HPTLC

Kvantitatívne stanovenie koncentrácií salidrozidu, hyperozidu a kvercitrínu vo všetkých simulačných vzorkách (ND, PG, IN) vodných extraktov z druhov Cistus sa uskutočnilo pomocou vysokoúčinnej tenkovrstvovej chromatografie (HPILC) (CAMAG, Muttenz, Švajčiarsko) podľa metódy overenej Guzelmericom a kol. [16]. Hyperozid, salidrozid a kvercitrín sa pripravili v koncentráciách 25,50 a 10{{30}} ug/ml a koncentrácie čerstvo pripravených roztokov vzoriek sa upravili na 10 mg/ml. Tieto roztoky sa aplikovali na normálne fázy silikagélových platní so skleneným podkladom (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Nemecko） s určitými objemami (1-5 μl štandardných roztokov a 5 μl roztokov vzoriek) pomocou 100 μl injekčných striekačiek（ Hamilton, Bonaduz, Švajčiarsko）. Postup aplikácie bol vykonaný pomocou aplikátora vzoriek Linomat 5. Proces vývoja bol vykonaný v automatizovanej vývojovej komore (ADC 2) a etylacetát:dichlórmetán, kyselina octová, kyselina mravčia: voda (10:25:10 :10:10:10me) sa vybrala ako mobilná fáza. Potom sa platne derivatizovali pomocou Natural Product Reagent (NPR) (1 g 2-aminoetylesteru kyseliny difenylboritej v 200 ml etylacetátu) v imerznom zariadení (CAMAG) Zatiaľ čo hyperozid a kvercitrín boli analyzované spektrofotometricky pri 260 nm, množstvo salidrozidu bolo merané pri 330 nm UV skenerom. Hodnoty Rf štandardov boli stanovené ako hyperozid (~0,35), kvercitrín (c0,45) (tilirozid) 0,65）. Zistilo sa, že korelačné koeficienty（r²） byť ×0,98 pre kvantifikáciu markerových flavonoidov.

4.11. Inhibičná aktivita na enzýmy súvisiace s diabetom 4.11.1. - Inhibičná aktivita glukozidázy

-glukozidázová inhibičná aktivita neštiepených a biologicky dostupných vzoriek získaných z vodných extraktov druhov Cistus sa skúmala podľa metódy vysvetlenej skôr Balanom a kol. [56]. Najprv sa správne množstvá fosforečnanu sodného a fosforečnanu sodného zmiešali so zaobstaraním 1 00 mM fosfátového pufra (pH 7). ac glukozidázový enzým sa rozpustil vo fosfátovom pufri, aby sa získal roztok -glukozidázy (0,2 U/ml). Potom sa spojilo 170 ul fosfátového tlmivého roztoku, 20 μl roztoku -glukozidázy a 20 μl roztokov vzoriek a inkubovali sa v sušiarni pri teplote 37 stupňov počas 15 minút. Potom sa k zmesi pridalo 20 ul 2,5 mM roztoku p-nitrofenyl- -D-glukopyranozidu v 100 mM tlmivom roztoku fosforečnanu draselného (pH 7,0) a uskutočnila sa ďalšia inkubačná perióda pri 37 stupňoch počas 15 minút. Potom sa k zmesi pridalo 80 ul 0,2 M roztoku uhličitanu sodného na ukončenie reakcie. Absorbancia sa merala pri 405 nm. Ako referenčný roztok sa použil roztok kvercetínu v rôznych koncentráciách. Výsledky sa odhadli ako percento inhibičnej aktivity v koncentráciách ND a IN vo vzorkách vodných extraktov druhov Cistus 1 mg/ml a 0,5 mg/ml.

4.11.2. - Inhibičná aktivita amylázy

Inhibičná aktivita na amylázu neštiepených a biodostupných vzoriek získaných z vodných extraktov druhov Cistus sa stanovila podľa postupu, ktorý predtým podrobne opísali Balan et al.[56]. Spektrofotometrické stanovenie inhibičných aktivít a-amylázy vzoriek sa uskutočnilo s použitím činidla DNS (kyselina 3,5-dinitrosalicylová). Ako je uvedené v spôsobe, maltóza vzniká premenou škrobu a žltá farba alkalického DNS sa mení na oranžovo-červenú v dôsledku maltózy vyrobenej zo škrobu. 96 mM roztok DNS sa teda pripravil zo zmesi roztoku vínanu sodnodraselného (rozpusteného v 2 M NaOH) a určitého množstva DNS (rozpusteného v destilovanej vode). Potom sa pri 20 stupňoch (pH: 6,9) pripravil 20mM tlmivý roztok fosforečnanu sodného s 6,7 mM NaCI (kofaktor enzýmu a-amylázy). enzým a-amyláza (1 U/ml) a škrob (10 mg/ml) sa rozpustili v tomto pufri. Potom sa 50 ul tlmivého roztoku fosforečnanu sodného a 10 ul roztoku enzýmu a-amylázy zmiešalo s 20 ul roztokov vzoriek. Táto zmes bola inkubovaná pri 37 stupňoch počas 45 minút. Po inkubačnej dobe sa do zmesi pridalo 20 ul roztoku škrobu. Ďalšia inkubačná doba sa začala pri 37 stupňoch počas 45 minút. Rovnaký postup sa aplikoval na vzorky bez pridania roztoku enzýmu o-amylázy nazývaného "pozadie vzorky". Kontrolná skupina sa študovala rovnakým postupom v neprítomnosti roztokov vzoriek. Absorbancia sa merala pri 540 nm. Akarbóza sa použila ako referenčný roztok v rôznych koncentráciách. Výsledky boli prezentované ako percento inhibičnej aktivity v koncentráciách ND a IN vzoriek ND a IN s koncentráciou 1 mg/ml a 0,5 mg/ml z vodných extraktov druhov Cistus. 4.11.3. AGE Inhibičná aktivita

AGE inhibičná aktivita neštiepených a biodostupných vzoriek z vodných extraktov druhov Cistus bola stanovená podľa metódy opísanej Starow-icz et al. [57]. Pred akýmkoľvek procesom boli čerstvo pripravené vzorky ND a IN s koncentráciou 1 mg/ml a 0,5 mg/ml. Potom sa 1 ml roztoku hovädzieho sérového albumínu (BSA) s koncentráciou 10 mg/ml pridal k 1 ml roztokov vzoriek ND a IN. Kontrolné vzorky boli pripravené bez pridania ND a IN vzorkových roztokov a slepé vzorky boli pripravené bez pridania 0,5 M glukózy. Potom boli všetky pripravené vzorky inkubované počas 40 hodín v trepacom vodnom kúpeli pri 55 stupňoch. Po skončení inkubačnej doby sa na výpočet intenzity fluorescencie použila čítačka mikrodoštičiek Thermo ScientificTM VarioskanTMLUXmultimode v rozsahu excitácie 370 nm/440 nm emisie. Kvercetín sa použil ako referenčný roztok v rôznych koncentráciách.

5. Závery

V tejto štúdii sa skúmali vodné extrakty všetkých druhov Cistus zaznamenaných v tureckej flóre na ich fenolické profily a in vitro antioxidačné a antidiabetické potenciály. Keďže odvar alebo infúzia sú bežnou formou v tradičnej medicíne, použitie vodných extraktov na hodnotenie aktivity v experimentálnych štúdiách je obzvlášť dôležité. Na druhej strane hydrofilné zložky vo vodnom extrakte podliehajú sérii metabolických premien v gastrointestinálnom systéme po požití. Na správne vyhodnotenie aktivity tradičných formulácií by sa preto mali skúmať aj aktivity biologicky dostupných metabolitov.

Toto je prvá štúdia, ktorá skúma dôsledky metódy simulácie ľudského trávenia in vitro na turecké druhy Cistus. Okrem toho sa v tejto štúdii po prvýkrát študoval inhibičný potenciál tureckých druhov Cistus na AGE. Okrem toho sa salidrozid, hyperozid a kvercitrín priradili ako markerové flavonoidy a zmeny ich koncentrácií sa monitorovali v procese trávenia in vitro. Zatiaľ čo obsah fenolov a antidiabetické a antioxidačné aktivity extraktov boli negatívne ovplyvnené gastrointestinálnymi tráviacimi postupmi, stále vykazovali významnú bioaktivitu. Podľa výsledkov bol extrakt C. salviifolius zistený ako najsilnejšia rastlina z hľadiska obsahu fenolov a antioxidačných a antidiabetických aktivít. Záverom možno povedať, že nadzemné časti z tureckých druhov Cistus majú bohatý obsah fenolov a potenciálne antioxidačné a antidiabetické účinky. Aj keď sa na vyhodnotenie biologickej dostupnosti použila metóda simulácie trávenia in vitro, nemusí úplne napodobňovať metabolické dráhy vyskytujúce sa v organizme. Preto sú potrebné ďalšie in vivo a klinické štúdie na podrobné posúdenie biologickej dostupnosti fenolových zlúčenín a ich podielu na hlásených farmakologických účinkoch.

Príspevky autora:Konceptualizácia, YI, EC, EY; metodológia, YI, SA, IK, EC formálna analýza, YI, IK.-C., SA; vyšetrovanie, YI, IK.-C, SA; zdroje, YI, IK.SA, EC a EY; spracovanie údajov, YI, IK-C., SA; písanie-—YI, písanie—recenzia a úprava, YI, EC, EY; vizualizácia, YI; supervízia, ECa EYVšetci autori si prečítali publikovanú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.

Financovanie:Tento výskum nezískal žiadne externé financovanie. Vyhlásenie inštitucionálnej revíznej rady: Neuplatňuje sa. Vyhlásenie o informovanom súhlase: Neuplatňuje sa.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov:Údaje uvedené v tejto štúdii sú k dispozícii na požiadanie od príslušného autora.

Konflikt záujmov:Autori nedeklarujú žiadny konflikt záujmov.

Dostupnosť vzorky:Vzorky zlúčenín nie sú k dispozícii od autorov.

Tento článok je extrahovaný z Molecules 2021, 26, 5322. https://doi.org/10.3390/molecules26175322 https://www.mdpi.com/journal/molecules