Vrodená imunitná odpoveď na pôst a kŕmenie v obličkách zebrafish

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zongzhen Liao, Dihang Lin, Jirong Jia, Ran Cai, Yang Yu a Wensheng Li *

Štátne kľúčové laboratórium biokontroly, Kľúčové laboratórium pre vodné hospodárske živočíchy v provincii Guangdong, Technologické výskumné centrum provincie Guangdong pre zdravý chov dôležitých hospodárskych rýb, Škola prírodných vied, Univerzita Sun Yat-Sen, Guangzhou 510275, Čína;

liaozzh@mail2.sysu.edu.cn (ZL); lindihang2018@sibcb.ac.cn (DL); jiajr3@mail.sysu.edu.cn (JJ); Alan6382@163.com (RC); yuyang65@mail2.sysu.edu.cn (YY)

* Korešpondencia: lsslws@mail.sysu.edu.cn

Cistanche je veľmi dobrý na funkciu obličiek

Abstraktné: Zvieratá získavajú živiny a energiu kŕmením, aby dosiahli rovnováhu medzi rastom a zdravím organizmu. Keď dôjde k zmene v získavaní živín, stav rastu sa zmení a môže tiež spôsobiť zmeny vo vnútornom imunitnom systéme. Kompenzačný rast (CG), špecifický rastový fenomén, zahŕňa otázku, či zmeny v raste môžu byť sprevádzané zmenami vrodenej imunity. Ako vhodný model môže poslúžiť zebrička (Danio rerio), známy modelový organizmus rýb. V tejto štúdii zebrička podstúpila 3 týždne hladovania a kŕmenia počas 3 až 7 dní. Zistilo sa, že CG možno dosiahnuť u zebry. Citlivosť zebričiek na Streptococcus agalactiae sa zvýšila po hladovaní. Okrem toho sa počet melanomakrofágových centier zvýšil po hladovaní a podiel poranených tubulov sa zvýšil po opätovnom kŕmení počas 3 a 5 dní. Okrem toho,obličkyzebričky trpiace hladovaním boli pod oxidačným stresom a aktivita niekoľkých antioxidačných enzýmov sa po hladovaní zvýšila, vrátane katalázy, glutatiónperoxidázy a superoxiddismutázy. Vrodené imunitné parametre boli ovplyvnené hladovaním. Okrem toho sa po hladovaní zvýšila aktivita alkalickej fosfatázy a lyzozýmu. Expresia mRNA imunitne podmienených génov, ako je il-1, bola zvýšená v rôznom rozsahu po pôste s alebo bez stimulácie lipopolysacharidmi (LPS). Táto štúdia ukázala, že funkcia vrodeného imunitného systému u zebry môže byť ovplyvnená stavom výživy.

Kľúčové slová: vrodený imunitný systém; obličky; oxidačný stres; kompenzačný rast; zebrička

1. Úvod

Základné životné činnosti sú závislé od energetického zásobovania organizmu. Stav živín v tele zvieraťa môže ovplyvniť fungovanie imunitného systému [1,2]. Kompenzačný rast (CG) je obdobie rýchleho rastu po fáze útlmu rastu, ktorá môže byť spôsobená nedostatkom potravy a iných faktorov prostredia [3,4]. Tento jav bol prvýkrát zaznamenaný u cicavcov a nakoniec bol nájdený u vtákov [3] a teleostov [5]. CG sa delí na dve fázy: katabolickú fázu a hyperanabolickú fázu [6]. Jedným zo základných vzorcov CG je pôst a dokrmovanie. Po kŕmení môžu ryby zažiť čiastočnú, úplnú, nadmernú alebo žiadnu kompenzáciu [4]. Špeciálny režim kŕmenia CG sa považuje za potenciálny spôsob, ako zlepšiť efektivitu produkcie u chovaných druhov [7].

Vrodená imunitná odpoveď je prvou hranicou obrany hostiteľa, ktorá chráni organizmy pred patogénmi. U rýb patrí medzi orgány imunitného systému týmus,hlavuobličky, kaudálna oblička, žiabre, pečeň,a črevá [8,9]. Na nešpecifických bunkových obranných odpovediach u rýb sa podieľa široká škála bunkových typov, vrátane monocytov/makrofágov, nešpecifických cytotoxických buniek a granulocytov (neutrofilov). Imunometabolizmus je súhra medzi imunologickými a metabolickými procesmi [10]. Metabolický stav rýb môže ovplyvniť ich imunitnú funkciu. U ľudí stav výživy ovplyvňuje počet imunitných buniek – a ich aktivitu [11]. Zistilo sa, že funkcia imunitného systému u myší môže byť ovplyvnená ich metabolickým stavom [12–14]. Prerušovaný pôst u karasa (Carassius auratus) zmenil črevné bakteriálne spoločenstvá a zvýšil aktivitu superoxiddismutázy (SOD) a lyzozýmu [15]. Hladovanie tiež mení génovú expresiu vrodených imunitných odpovedí v pečeni lososa [16]. Okrem toho štúdie o účinkoch metabolického stavu na imunitný systém možno nájsť v iných teleostoch [17–19]. Avšak vplyv metabolického stavu na imunitný systém u teleostov je stále nedostatočne pochopený. Oxidačný stres môže obmedziť funkčnosť vrodeného imunitného systému a indukovať zložky, ako sú toll-like receptory [20,21]. Medzitým môže hladovanie zvýšiť produkciu ROS a spôsobiť autofágiu [22,23]. Stálo by za to preskúmať, či oxidačný stres sprostredkováva vzťah medzi hladovaním a imunitou.

Zebrafish (Danio rerio) oblasť široko používaný model pri štúdiu imunity a chorôb. Vrodený imunitný systém zebry sa začína vyvíjať v deň 1 embryogenézy a adaptívny imunitný systém chýba až do 4-6 týždňov po oplodnení. Vďaka tomu je zebrička skvelým modelom na štúdium vrodeného imunitného systému [9]. Obličky sú primárnym lymfoidným orgánom u zebry [24]. Gén havcr1 kóduje transmembránový tubulárny proteín tzvmolekula poškodenia obličiek-1 (KIM-1) [25]. KIM-1 je indikátorom poškodenia tkaniva v obličkách a nadmerná expresia KIM-1 spôsobuje poškodenie obličiek u zebry [26]. Zistilo sa, že pôst môže zmeniť metabolický stav u zebry [27]. Pôst viedol k zníženiu spotreby kyslíka a obsahu pečeňových lipidov a glykogénu. Tiež zvýšil aktivitu 8-oxidácie a glukoneogenézy v pečeni. Medzitým sa reaktívne formy kyslíka (ROS) zúčastnili na CG u zebričiek [28]. ROS, produkované v pečeni, boli nevyhnutné pre CG u zebry, pretože indukovali dráhu AMPK. V tejto štúdii sme prijali stratégiu pôstu a opätovného kŕmenia, aby sme preskúmali vzor CG u zebry. Streptococcus agalactiae spôsobil ťažkú ​​sepsu a meningitídu u zebričiek a mohol infikovať viac ako 30 druhov rýb [29]. Vybrali sme Streptococcus agalactiae a lipopolysacharidy (LPS) na injekciu, aby sme preskúmali vplyv CG na vrodený imunitný systém v kombinácii so zmenami v parametroch súvisiacich s imunitou a génovou expresiou.

2. Materiály a metódy

2.1. Zebrafish, režimy kŕmenia a telesná hmotnosť

Dospelé zebričky použité v experimente boli zakúpené z Yuehe Fish-Bird- Flower market (Guangzhou, Čína) a aklimatizované počas dvoch týždňov. Všetok chov rýb sa uskutočňoval na experimentálnej stanici na chov rýb na Sun Yat-sen University, provincia Guangdong, Čína. Všetky pokusy na zvieratách sa uskutočňovali v súlade s usmerneniami a schválením Výboru pre starostlivosť o zvieratá a používanie zvierat na univerzite Sun Yat-Sen. Počas experimentálneho obdobia sa pH pohybovalo v rozmedzí 7,8 až 7,9, rozpustený kyslík v rozmedzí 6,95 až 7,23 mg/l a teplota vody sa pohybovala v rozmedzí 26,5 až 28 oC. Koncentrácie amoniakálneho dusíka a dusičnanového dusíka sa udržiavali nižšie ako 0,2 a 0.{{20}}05 mg/l, v uvedenom poradí. Slanosť vody bola 0,2 ppt. Zebrafish bola chovaná v 12:{23}}hodinovom cykle svetlo-tma. Na preskúmanie zmien telesnej hmotnosti počas pôstu a kŕmenia sa telesná hmotnosť zaznamenávala raz týždenne. Počiatočná telesná hmotnosť zebričiek v experimente bola 0,35 ± 0,06 g a boli vo veku približne 3 mesiacov. Zebričky boli rozdelené náhodne do 24 1 nádrží a každá nádrž obsahovala 30 rýb. Bola im ponúknutá komerčná strava dvakrát denne s nasýteným kŕmením. Kŕmne režimy pre každý experiment sú uvedené v tabuľke 1. Po liečbe boli zebričky anestetizované predávkovaním MS-222 (Sigma, Burlington, MA, USA) a usmrtené. Potom sa oblička vybrala do Eppendorfovej skúmavky a ihneď sa umiestnila do tekutého dusíka. Vzorka bola prenesená z tekutého dusíka a uskladnená pri -80 oC.

2.2. Výzva proti Streptococcus agalactiae

Zebričky, ktoré sa hladovali a kŕmili, boli napadnuté Streptococcus agalactiae. Kmeň Streptococcus agalactiae láskavo poskytol profesor Anxing Li, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University [30]. Zebričky v každej skupine boli ďalej rozdelené do štyroch malých skupín, pričom v každej malej skupine bolo 15 rýb. Zebričky v troch z týchto skupín sa anestetizovali 80 mg/l MS-222 a intraperitoneálne sa im injikovalo 5 ul obsahujúcich 5 x 106 jednotiek tvoriacich kolónie Streptococcus agalactiae. Zvyšné zebričky boli injikované 5 ul PBS. Všetky zebričky boli pozorované 4 dni bez kŕmenia. Bola zaznamenaná úmrtnosť.

2.3. LPS injekcia

Zebričky, ktoré sa podrobili pôstu a kŕmeniu (F24, S24 a F21R3), boli stimulované LPS (Sigma, Burlington, MA, USA). LPS prášok sa rozpustil v sterilnej vode na konečnú koncentráciu 1 mg/ml. Pred použitím bol 1 mg/ml LPS zriedený PBS a konečná koncentrácia bola 20 ug/ml. Zebričky v každej skupine boli rozdelené do dvoch malých skupín a v každej malej skupine bolo 12 rýb. Rybám v dvoch skupinách sa injekčne podali LPS a PBS. Zebričky sa anestetizovali MS-222 a intraperitoneálne sa im injikovalo 5 ul 20 ug/ml LPS alebo PBS. Po 3 hodinách boli zebričky anestetizované a usmrtené. Potom bola oblička odstránená a udržiavaná pri -80 oC.

2.4. Histopatológia

Zebričky boli chované s dokrmovaním počas 14 dní po hladovaní počas 21 dní. Vzorky sa odoberali na 21., 24., 28. a 35. deň. Po obetovaní sa obličky zebry vybrali a ponorili do 4% formaldehydu. Potom sa obličky podrobili parafínovému rezu. Rezy boli zafarbené hematoxylínom-eozínom (HE) (Beyotime, Shanghai, Čína) a pozorované svetelným mikroskopom (Olympus, Tokio, Japonsko). Na kvantifikáciu zmeny poškodených tubulov a melano-makrofágových centier (MMC) sa z každého sklíčka zachytilo 5 neprekrývajúcich sa obrázkov. Plochy poranených tubulov a celá vzorka boli merané pomocou softvéru Cellsens (Olympus, Tokio, Japonsko). Z každého obrázku sa vypočítal podiel poškodených tubulov vydelením plochy poškodených tubulov plochou celej vzorky. Množstvo MMC sa spočítalo na každom obrázku a potom sa vydelilo plochou celej vzorky. Potom sa vypočítali násobné zmeny MMC so skupinou F21 ako štandardom.

2.5. Skúška súvisiacich biochemických parametrov

Obsah malondialdehydu (MDA) a oxidu dusnatého (NO) a enzymatické aktivity SOD, alkalickej fosfatázy (ALP), katalázy (CAT), glutatiónperoxidáz (GSH-Px) a lyzozýmu v obličkách sa merali pomocou zodpovedajúcich komerčných súprav. v súlade s protokolmi výrobcu. v skratke,obličkyodstránené zo zebry boli umiestnené do tekutého dusíka a skladované pri teplote -80 oC. Pred testovaním sa každá oblička vybrala a urobila sa z nej homogenát vo vopred vychladenom PBS s tkanivovým disruptorom.Obličkový homogenátsa centrifugoval pri 4 oC a 12,000× g počas 10 minút a supernatant sa odobral akoobličkyextrakt na detekciu. Obsah MDA bol detekovaný pomocou súpravy Lipid Peroxidation MDA Assay Kit (Beyotime, Shanghai, Čína) a detekcia bola založená na farebnej reakcii medzi MDA a kyselinou tiobarbiturovou. Použitá vlnová dĺžka bola 535 nm. Obsah NO sa meral systémom Griessovho činidla (Promega, Madison, WI, USA). Systém Griessových činidiel je založený na reakcii dusitanov so sulfanilamidom a N-1-naftyletyléndiamíndihydrochloridom za kyslých podmienok. Obsah NO sa vypočítal pomocou štandardu dusitanu sodného a normalizoval sa na obsah proteínu. Absorbancia sa merala pomocou filtra pri 490 nm. Aktivita lyzozýmu sa detegovala pomocou súpravy Lysozyme Assay Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) podľa protokolu výrobcu. Extrakt z obličiek sa inkuboval s bunkovou stenou Micrococcus lysodeikticus konjugovanou s fluoresceínom. Fluorescencia sa merala po 45 minútach inkubácie pri 37 oC, pri excitačných a emisných vlnových dĺžkach 485 a 535 nm. Hodnota lyzozýmu sa vypočítala pomocou štandardnej krivky a normalizovala sa na obsah proteínu. Enzymatické aktivity SOD, ALP, CAT a GSH-Px sa samostatne detegovali pomocou testovacích súprav typu SOD, testovacích súprav s alkalickou fosfatázou, katalázových testovacích súprav a testovacích súprav glutatiónperoxidázy (Nanjing Jiancheng, Nanjing, Čína). Jednotka aktivity SOD bola definovaná ako množstvo SOD zodpovedajúce 50 percentnej inhibícii rýchlosti redukcie nitromodrej tetrazoliovej na mg proteínu v 1 ml systéme. Použitá vlnová dĺžka bola 570 nm. Jednotka aktivity ALP bola definovaná ako objem enzýmu, ktorý reagoval so substrátom za vzniku 1 mg fenolu za 30 minút pri 37 oC a normalizoval sa na obsah proteínu. Použitá vlnová dĺžka bola 490 nm. Aktivita CAT bola založená na spotrebe peroxidu vodíka. Použitá vlnová dĺžka bola 405 nm. Aktivita GSH-Px bola meraná rýchlosťou katalyzačnej reakcie medzi peroxidom vodíka a GSH. Odčítaním neenzymatickej reakcie bola jednotka aktivity GSH-Px definovaná ako zníženie koncentrácie GSH o 1 mol/l v každom systéme. Použitá vlnová dĺžka bola 405 nm. Koncentrácia proteínu sa merala pomocou súpravy BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanghai, Čína). Použitá vlnová dĺžka bola 570 nm.

2.6. Výroba ROS

Obsah ROS vobličkybola stanovená fluorescenčnou sondou 2/,7/-dichlórfluoresceín diacetát (DCF-DA) (Sigma, Burlington, MA, USA), ako už bolo opísané [28]. Stručne povedané, oblička odobratá z zebry sa umiestnila do vopred vychladeného 100 ul PBS a spracovala sa do homogenátu s tkanivovým disruptorom. Po 10-minútovej centrifugácii s 10,000 x g pri 4 oC, 20 ulobličkyextraktsa pridalo do 96-jamkových čiernych mikrodoštičiek a do každej jamky sa pridalo 25 uM DCF-DA. Mikroplatnička bola inkubovaná pri 37 oC počas 30 minút. Fluorescencia sa merala v multilabelovej čítačke doštičiek (PerkinElmer Victor X5, Waltham, MA, USA) s excitačnými a emisnými filtrami nastavenými na 485 a 535 nm. Obsah proteínu v obličkovom extrakte sa meral pomocou súpravy BCA Protein Assay Kit. Obsah ROS pre každú vzorku sa vypočítal normalizáciou hodnoty fluorescencie na obsah proteínu. Koncentrácia proteínu sa merala pomocou súpravy BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanghai, Čína). Použitá vlnová dĺžka bola 570 nm.

2.7. Respiratory Burst Assay

Na meranie aktivity respiračného vzplanutia sa použili zebričky nalačno a kŕmené (F24, S24 a F21R3). Protokol pre test respiračného vzplanutia sa uskutočnil podľa predtým publikovanej metódy [31,32]. Stručne povedané,obličkyboli oddelené od anestetizovaných zebričiek a umiestnené do {{0}}jamkových mikrodoštičiek so 100 ul Dulbeccovho modifikovaného Eaglovho média (DMEM)/F-12. Po inkubácii platne počas 30 minút pri 28 oC sa pridalo 100 ul DMEM/F-12 obsahujúceho DCF-DA, dimetylsulfoxid (DMSO) a forbolmyristátacetát (PMA) (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). pridané do každej zistenej jamky. Medzitým sa do každej kontrolnej jamky pridalo 100 ul DMEM/F-12 obsahujúceho DMSO. Konečné koncentrácie rôznych roztokov boli nasledovné: 500 ng/ml DCF-DA, 0,2 percenta DMSO a 200 ng/ml PMA. Fluorescencia sa merala v multilabelovej čítačke doštičiek s excitačnými a emisnými filtrami nastavenými na 485 a 535 nm. Fluorescencia každej jamky

sa merala ihneď po pridaní roztokov do jamky a potom každých 15 minút počas 150 minút. Časový bod na porovnanie hodnôt fluorescencie bol 150 minút. Hodnoty fluorescencie neindukovanej kontrolnej skupiny sa odpočítali od fluorescencie

hodnoty jednotlivých skupín indukovaných PMA. Vypočítali sa normalizované hodnoty fluorescencie. Tieto normalizované hodnoty fluorescencie boli zoradené do troch stĺpcov.

2.8. Extrakcia RNA a PCR v reálnom čase

Zmrznutéobličkyboli rozomleté ​​v TRIzole (Omega, Norcross, GA, USA) a celková RNA bola separovaná podľa protokolu [33]. Po štiepení s DNase1 (NEB, Ipswich, MA, USA) sa cDNA vyrobila pomocou súpravy RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) s Random Hexamer Primer. qRT-PCR bola pripravená v 10 ul reakčnej zmesi obsahujúcej 5 ul 2x SYBR Green qPCR Master Mix (Bike, Houston, TX, USA). Všetky vzorky boli uskutočnené v duplikáte a normalizované na expresiu eEF1a1a. Sekvencie oligonukleotidových primérov použitých v tejto štúdii sú opísané v doplnkovej tabuľke S1. Relatívna kvantifikácia mRNA cieľa k referencii bola stanovená pomocou 2-metódy AACT [34].

2.9. Štatistická analýza

Kvantitatívne údaje sú uvedené ako stredná hodnota ± SD. Štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou SPSS verzie 24 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Štatistické porovnania medzi dvoma skupinami boli uskutočnené pomocou Studentovho t-testu alebo neparametrického testu, v závislosti od výsledku testu normality. Analýzy pre viaceré skupiny s normálnou distribúciou sa uskutočnili pomocou jednosmernej ANOVA a zvyšok sa uskutočnil pomocou neparametrických testov. Všetky štatistické údaje a metódy je možné skontrolovať v tabuľke S2.

3. Výsledky

3.1. Zmeny telesnej hmotnosti a antibakteriálne vlastnosti Zebrafish počas pôstu a kŕmenia

U zebričiek bol realizovaný úplný kompenzačný rast. Po 7 až 14 dňoch pôstu zebrička stratila najmenej 15 percent telesnej hmotnosti. Po 14 dňoch kŕmenia sa telesná hmotnosť zebry v skupine nalačno vyrovnala hmotnosti kontrolnej skupiny (obrázok 1A–C). Po hladovaní a kŕmení, aby sa preskúmala odolnosť zebričiek voči patogénom, im bol intraperitoneálne podaný Streptococcus agalactiae. Zebrafish v skupine nalačno mala zvýšenú úmrtnosť v porovnaní s kontrolnou skupinou. S predĺžením dokrmovania miera úmrtnosti naďalej klesala (obrázok 1D).

Obrázok 1. Model kompenzačného rastu u zebričky. A až C: zmena telesnej hmotnosti zebričky počas pôstu a kŕmenia. (A) Zebričky hladovali 7 dní a kŕmili 28 dní. (B) Zebričky boli hladované 14 dní a kŕmené 21 dní. (C) Zebričky boli hladované 21 dní a kŕmené 14 dní. n=21–22. (D) Miera prežitia zebričiek, ktorým bola intraperitoneálne podaná S. agalactiae; F: kŕmenie; S: hladovanie; R: dokrmovanie. n=3, *: p < {{10}}.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

3.2. Morfologické zmeny obličiek zebrafish počas pôstu a kŕmenia

Theobličkyje hlavným imunitným tkanivom u zebry. Hladovanie spôsobilo morfologické zmeny vobličky. Po 21 dňoch hladovania oblička vykazovala zjavné morfologické zmeny. Zistili sme, že viac poranených tubulov s hyalínovými kvapôčkami sa objavilo po dokrmovaní 3 a 5 dní. Táto situácia sa zlepšila po 7 dňoch. Okrem toho sa pozorovalo, že počet melanomakrofágových centier (MMC) vobličkyzvýšená po hladovaní (obrázok 2A–C). Spolu s dokrmovaním bol tento príznak zachránený. Expresia mRNA havcr1 sa zvýšila po pôste (obrázok 2D), čo ukazuje, že hladovanie môže spôsobiťobličkyzranenie.

Obrázok 2. Morfologické zmeny vobličkyzebričiek počas pôstu a kŕmenia. (A) HE-farbenieobličkyu zebričiek počas pôstu a kŕmenia. Čierny trojuholník označuje poškodené tubuly. Červená šípka označuje MMC. Červená hviezda označuje hyalínové kvapôčky. (B) Štatistická analýza podielu poškodených tubulov vobličky. (C) Štatistická analýza MMC v obličkách. n=3–4. (D) Relatívna expresia mRNA génu havcr1 vobličkyzebričiek počas pôstu a kŕmenia. n {{0}} – 10. F: kŕmenie; S: hladovanie; R: dokrmovanie. *: p <>

3.3. Oxidačný stres bol spustený počas pôstu a kŕmenia

Obsah MDA sa výrazne zvýšil po hladovaní počas 21 a 24 dní a znížil sa po 3 dňoch opätovného kŕmenia (obrázok 3A). Obsah ROS však klesol po 24 dňoch hladovania a obnovil sa opätovným kŕmením počas 7 dní (obrázok 3B). Obsah NO sa zvýšil po hladovaní počas 21 dní (obrázok 3C). Aktivita antioxidačných enzýmov vrátane SOD, GSH-Px a CAT sa po hladovaní zvýšila. Aktivity GSH-Px a CAT rýchlo klesli a obnovili sa na 3. deň kŕmenia. Hoci aktivita SOD klesala s dokrmovaním, bola stále vyššia ako aktivita kontroly (obrázok 4).

Obrázok 3. Oxidačný stres v obličkách zebry počas pôstu a kŕmenia. (A) Obsah MDA v obličkách. (B) Zmena ROS v obličkách. (C) Obsah NO v obličkách. F: kŕmenie; S: hladovanie; R: dokrmovanie. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Obrázok 4. Aktivita enzýmov v antioxidačných systémoch vobličkyzebričiek počas pôstu a kŕmenia. (A) Aktivita SOD v obličkách. (B) Aktivita GSH-Px v obličkách. (C) Aktivita CAT v obličkách. F: kŕmenie; S: hladovanie; R: dokrmovanie. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

3.4. Vrodený imunitný systém obličiek zebričky bol ovplyvnený pôstom a kŕmením

Aktivita ALP sa zvýšila v obličkách po hladovaní a znížila sa po dokrmovaní (obrázok 5A). Pri dokrmovaní počas 7 dní nebol medzi dokrmovanou skupinou a kontrolou žiadny významný rozdiel. Aktivita lyzozýmu v obličkách vykazovala podobný trend ako ALP, ktorý sa zvyšoval nalačno (obrázok 5B). Po dokrmovaní rýchlo klesol. Reakcia respiračného výbuchu v obličkách nevykazovala žiadne významné zmeny v rôznych skupinách, ale odpoveď bola vyššia v skupine nalačno a dokrmovania (obrázok 5C). Expresia mRNA prozápalového cytokínu il{4}} vykazovala pozoruhodný nárast vo všetkých skupinách nalačno, ale po dokrmovaní rýchlo klesla (obrázok 6A). Expresia mRNA tgfb1a a tgfb1b vykazovala rovnaký trend ako il-1 (obrázok 6E,F). Expresia mRNA nfkb1 sa však výrazne zvýšila iba po hladovaní počas 24 dní a znížila sa po opätovnom kŕmení počas 3 dní. Expresia mRNA nfkb2 vykazovala trend podobný trendu nfkb1 (obrázok 6B, C). Gén arg2 kóduje arginázu II, ktorá súvisí s prozápalovou odpoveďou. Okrem toho sa expresia mRNA arg2 výrazne zvýšila vo všetkých skupinách nalačno a po opätovnom kŕmení sa znížila (obrázok 6D). Po napadnutí zebričky, ktorá prešla pôstom a kŕmením, bola reakcia silnejšia v skupine, ktorá sa postila. Expresia mRNA il-1 a mmp9 v skupine nalačno liečenej LPS bola významne vyššia ako v kontrolnej skupine liečenej LPS alebo skupine s opakovaným kŕmením (obrázok 7).

Obrázok 5. Parametre vrodeného imunitného systému vobličkyzebričiek počas pôstu a kŕmenia. (A) Aktivita ALP v obličkách zebry počas pôstu a kŕmenia. (B) Aktivita lyzozýmu vobličkyzebričiek počas pôstu a kŕmenia. (C) Reakcia obličiek v prípade zebry na respiračné vzplanutie po hladovaní a kŕmení. (C1) Hodnota fluorescencie/proteínu obličiek v rôznych časoch. (C2) Hodnoty fluorescencie/proteínuobličkyo 150 min. (C3) Normalizácia hodnoty fluorescencie/proteínu obličiek pri 150 min. F: kŕmenie; S: hladovanie; R: dokrmovanie. n=12. *: p < 0,05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Obrázok 6. Relatívna expresia mRNA génov súvisiacich s imunitou v obličkách zebry počas hladovania a kŕmenia. (A–F):il-1, nfkb1, nfkb2, arg2, tgfb1a a tgfb1b. F: kŕmenie; S: hladovanie; R: dokrmovanie. n=8–1{{10}}. *: p < 0,05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Obrázok 7. Relatívna expresia mRNA imunitne príbuzných génov vobličkyzebričiek vystavených 5 ul 20 ug/ml LPS po hladovaní a kŕmení. (A–C) il-1, mmp9 a nfkb1. F: kŕmenie; S: hladovanie; R: dokrmovanie. n=8–12. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

4. Diskusia

V tejto štúdii sme zistili, že úplné CG by sa dalo realizovať u zebry po rôznych trvaní hladovania. Dokonca aj po 3 týždňoch hladovania telesná hmotnosť zebry dosiahla hmotnosť kontrolnej skupiny po dvoch týždňoch. Tento výsledok bol v súlade s predchádzajúcou prácou [28]. Štúdie ukázali, že hladovanie a dokrmovanie ovplyvňujú metabolický stav zebričky [27,28]. U chovaných druhov je význam CG v tom, že zlepšuje efektivitu produkcie. Pre chované druhy je dôležité zachovať antibakteriálne vlastnosti počas pôstu a kŕmenia. Počas tohto procesu má zebrička potenciál trpieť patogénmi. Uvádza sa, že hladovanie neovplyvnilo imunitnú odpoveď u infikovaných Piaractus mesopotamicus [18]. Bohužiaľ, pôst podporil náchylnosť zebričiek na S. agalactiae. Hladovaním boli súčasne ovplyvnené biochemické parametre a expresia mRNA vrodeného imunitného systému.

U zebrafish chýbajú lymfatické uzliny a obličky sú primárnym lymfoidným orgánom, ktorý je ekvivalentom kostnej drene cicavcov [24]. U dospelých zebričiek sú obličky hlavným miestom hematopoézy [35]. Populácie v dreni obličiek obsahujú mnoho typov hematopoetických buniek vrátane makrofágov, neutrofilov a lymfocytov [36,37]. Správna funkcia obličiek je dôležitá pre vrodený imunitný systém u zebry. V tejto štúdii sme pozorovali niektoré morfologické zmeny v obličkách zebry vystavenej hladovaniu. Ukladanie MMC v obličkách sa po hladovaní výrazne zvýšilo. Už skôr sa zistilo, že hladovanie môže spôsobiť ukladanie melanomakrofágov (MM) v obličkách a slezine u rýb [38]. MMC sa vyskytujú hlavne v obličkách, pečeni a slezine a sú difúzne a menej štruktúrované v obličkách [39]. Predpokladá sa, že MMC fungujú ako v imunitnej obrane, tak aj v normálnych, neimunologických, fyziologických procesoch. Primárnou funkciou MMC je fagocytóza. Predpokladá sa, že MMC sa môžu podieľať na vrodených aj adaptívnych imunitných odpovediach. Pridanie MMC po hladovaní môže byť spôsobené hemofagocytózou a klírensom bunkových zvyškov. Navyše, v prvých dňoch dokrmovania bola pozorovaná štruktúra hyalínových kvapiek. Predpokladá sa, že prítomnosť hyalínových kvapôčok svedčí hlavne pre alfa2u-globulín v tubulárnych epiteliálnych bunkách [40]. Okrem toho v modeli histiocytického sarkómu neoplastické histiocyty produkovali lyzozým a lyzozým sa akumuloval v tubulárnych epitelových bunkách [41]. Stručne povedané, k tvorbe hyalínových kvapôčok dochádza, pretože obličky nedokážu stráviť proteín, ktorý sa hromadí v tubulárnych epiteliálnych bunkách. Úroveň KIM-1 (kódovaná havcr1) môže naznačovať štrukturálne poškodenie tubulov [42]. Po hladovaní sa expresia mRNA havcr1 výrazne zvýšila a znížila s opätovným kŕmením. Môžeme predpovedať, že funkcia obličiek je narušená pôstom a s dokrmovaním sa funkcia obličiek obnoví. Požiadavky sú však na začiatku dokrmovania zaťažujúce.

Fagocytóza je dôležitý proces obrany vrodeného imunitného systému rýb. Oxidačný stres obmedzí imunitnú odpoveď [20]. Antioxidačná obrana závisí hlavne od enzýmov. SOD, GPx a kataláza sú dôležitými zložkami antioxidačných systémov [43]. SOD sprostredkováva premenu superoxidového aniónu a H2O2. Kataláza sa podieľa na detoxikácii H2O2 na vodu. GPx katalyzuje hydroperoxidy (napr. H2O2 a lipidové hydroperoxidy) na H2O oxidáciou glutatiónu (GSH) na glutatión disulfid (GSSH) [43–45]. MDA je jedným z hlavných produktov oxidácie lipidov a vyrába sa z polynenasýtených mastných kyselín (PUFA) chemickými reakciami a reakciami katalyzovanými enzýmami. ROS môže peroxidovať PUFA za vzniku MDA. Obsah MDA je biomarker bežne používaný na hodnotenie oxidačného stresu [46]. V predloženej práci, aj keď sa obsah ROS znížil, obsah MDA v obličkách sa výrazne zvýšil a zvýšila sa aj aktivita všetkých enzýmov patriacich do antioxidačného systému. Detekcia ROS je prechodná odozva. Zmena aktivity antioxidačného enzýmu bola výsledkom dlhodobého hladovania. Opačné trendy medzi ROS a antioxidačnými enzýmami môžu byť spôsobené skutočnosťou, že normálne procesy bunkovej aktivity produkujú ROS, zatiaľ čo dlhodobé hladovanie vedie k zníženiu bunkovej aktivity. Tento výsledok ukázal, že hladovanie spôsobuje oxidačný stres v obličkách chronickým spôsobom. Pretrvávajúci oxidačný stres môže spôsobiť poškodenie látok v bunkách, ako sú lipidy a proteíny, a nakoniec viesť k apoptóze a akumulácii oxidovaných molekulárnych agregátov [20]. V teleostoch sa uvádza, že hladovanie vyvolalo obsah MDA v pečeni a čreve a zvýšilo aktivitu antioxidačných enzýmov [47–49]. Tieto výsledky naznačujú, že hoci bol antioxidačný systém aktivovaný, nestačilo to na odstránenie škôd spôsobených hladovaním. Medzitým môže oxidačný stres aktivovať širokú škálu transkripčných faktorov, ako sú NF-kB, Nrf2 a HIF{19}}a. Následne tieto transkripčné faktory indukujú expresiu mnohých cytokínov a chemokínov. Oxidačný stres teda môže viesť k chronickému zápalu [44].

Zebra v skupine nalačno, vystavená Streptococcus agalactiae, trpela vyššou úmrtnosťou ako v kontrolnej skupine. Medzitým sa aktivita ALP a lyzozýmu zlepšila hladovaním. Lysozým je dôležitou súčasťou vrodeného imunitného systému rýb a podieľa sa na procese fagocytózy [50]. Podľa výsledkov hladovanie spôsobilo expresiu mRNA il-1, nfkb1, tgfb1a, tgfb1b a arg2. Tieto zmeny môžu byť spôsobené oxidačným stresom. TGFB1 je cytokín, ktorý má prozápalové aj protizápalové účinky [51]. Rekombinantný TGFB1 vykazoval imunosupresívnu aktivitu a downreguloval expresiu prozápalových cytokínov v leukocytoch teleostov. U zebričiek expresia tgfb1a spôsobila zápal v pečeni [52]. Chronická indukcia tgfb1a aktivovala zápal a jeho expresia vyvolala fibrózu pečene pri včasnom hepatocelulárnom karcinóme u zebry. Argináza je primordiálny enzým a je zodpovedný za premenu L-arginínu na L-ornitín a močovinu. Argináza má dva izoenzýmy (argináza I a argináza II) [53,54]. Argináza II je gén súvisiaci s imunitou a zistilo sa, že súvisí s prozápalovými odpoveďami v makrofágoch prostredníctvom mitochondriálnych ROS. Tieto údaje ukázali, že hladovanie môže vyvolať imunitnú odpoveď v obličkách. U myší hladovanie znížilo citlivosť na LPS a neovplyvnilo expresiu il{20}} [55]. Zebrička stimulovaná LPS však vykazovala hrubú odpoveď na LPS a expresia il-1 a mmp9 bola výrazne vyššia ako v ostatných skupinách. Na rozdiel od myší sa zebričky po hladovaní stali citlivejšie na LPS, takže hladovanie môže zhoršiť ich schopnosť odstraňovať patogény.

5. Závery

V tejto štúdii sme predbežne skúmali vplyv pôstu a kŕmenia na vrodený imunitný systém zebry. U zebričiek sa realizoval kompenzačný rast sprevádzaný zvýšenou náchylnosťou na patogény po hladovaní. Oxidačný stres - spôsobený hladovaním a molekulárnymi vzormi spojenými s nebezpečenstvom spôsobeným poranenými renálnymi tubulmi - môže prispieť k zápalu. Je potrebná ďalšia štúdia, aby sa zistilo, ako hladovanie zvyšuje náchylnosť a ako metabolický stav ovplyvňuje rôzne druhy imunitných buniek.

Doplnkové materiály: Nasledujúce sú dostupné online na https://www.mdpi.com/article/10 .3390/biom11060825/s1, Tabuľka S1: Zoznam primerov použitých v tejto štúdii; Tabuľka S2: Štatistický výsledok experimentu.

Autorské príspevky: Konceptualizácia, ZL a WL; Spracovanie údajov, JJ; formálna analýza, ZL a DL; Akvizícia financovania, WL; Vyšetrovanie, ZL, DL, RC a YY; Metodika, ŽL; Dohľad, WL; Písanie — pôvodný návrh, ZL; Písanie – kontrola a úprava, WL Všetci autori si prečítali publikovanú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.

Financovanie: Táto práca bola financovaná Národným kľúčovým programom výskumu a vývoja Číny (2018YFD0900101), Čínskym poľnohospodárskym výskumným systémom MOF a MARA (CARS-46) a Programom pre vynikajúce čínske talenty v poľnohospodárskom vedeckom výskume ({{3 }}) Wenshengovi Li.

Vyhlásenie Inštitucionálneho revízneho výboru: Štúdia bola vykonaná v súlade s pokynmi Helsinskej deklarácie a schválená Výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na Univerzite Sun Yat-Sen.

Vyhlásenie o informovanom súhlase: Neuplatňuje sa.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov: Neuplatňuje sa.

Konflikt záujmov: Autori vyhlasujú, že nemajú žiadny konflikt záujmov.