Integratívna omická analýza odhaľuje dráhy súvisiace s mikrovaskulárnym zápalom v biopsiách aloštepu obličiek

edmund.chen@wecistanche.com

Pri transplantácii pevných orgánov sa mikroRNA (miRNA) ukázali ako kľúčoví hráči v regulácii funkcie aloštepových buniek v reakcii na poškodenie. Aby sme získali prehľad o úlohe miRNA pri odmietnutí sprostredkovanom protilátkami, fenotyp odmietnutia histologicky definovaný mikrovaskulárnym zápalom,obličky biopsie aloštepu boli podrobené profilovaniu miRNA, ale aj messenger RNA (mRNA). Použitím jedinečného viacstupňového selekčného procesu špecifického pre štúdiu BIOMARGIN (objavná kohorta, N=86;výberová kohorta, N=99; validačná kohorta, N=298), bolo konzistentne identifikovaných šesť rozdielne exprimovaných miRNA: miR-139-5p (dole) a miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (hore). Úroveň ich expresie postupne korelovala s intenzitou mikrovaskulárneho zápalu. Bunková špecifickosť cieľových génov miRNA sa skúmala integráciou ich cieľov mRNA in vivo so sekvenovaním jednobunkovej RNA z nezávislej kohorty biopsie aloštepu. Expresia miR-139-5p odvodená z endotelu negatívne korelovala s expresiou génov súvisiacich s MHC. Naopak, nadmerná expresia miR-222-3p odvodená od epitelu bola silne spojená s degradovanou homeostázou renálnych elektrolytov a potlačenými imunitne súvisiacimi dráhami. V imunitných bunkách miR-150-5p reguloval aktiváciu NF-kB v T lymfocytoch, zatiaľ čo miR{18}}p reguloval zostrih mRNA v bunkách prezentujúcich antigén. Celkovo nám integrované omiky umožnili odhaliť nové cesty zapojené do mikrovaskulárneho zápalu a naznačujú, že modifikácie metabolizmu v tubulárnych epiteliálnych bunkách sa vyskytujú ako dôsledok odmietnutia sprostredkovaného protilátkou mimo blízkeho endotelového kompartmentu.

Kľúčové slová:transplantácia obličky, mikroRNA, multi-omika, mikrovaskulárny zápal, odmietnutie sprostredkované protilátkou

CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN

ÚVODIntransplantácia obličky(KT) sa aloimunitné poškodenie zvyčajne dichotomizuje na dva typy odmietnutia aloštepu podľa priestorovej distribúcie imunitnej infiltrácie a informácií o prítomnosti alebo neprítomnosti darcovských špecifických anti-HLA protilátok. Diagnóza sa opiera o biopsiu aloštepu s klasifikáciou histologických lézií podľa Banff International Consensus klasifikácie (1). Tubulitída (lézia "t") a intersticiálny zápal (lézia "I") sú charakteristické histologické znaky odmietnutia sprostredkovaného T bunkami (TCMR) a súvisia s priamou cytotoxicitou na tubulointersticiálny kompartment. Rejekcia sprostredkovaná protilátkou (ABMR) je najčastejšie spojená s cirkulujúcimi anti-HLA protilátkami so zápalom zameraným na mikrovaskulárny kompartment. Aktívne ABMR histologické lézie zahŕňajú prítomnosť mononukleárnych buniek v glomerulárnych kapilárach ("g"lézia) a v peritubulárnych kapilárach ("ptc" lézie), spoločne označované ako "mikrovaskulárny zápal" (MVI). Pri chronickej aktívnej ABMR sa k týmto akútnym léziám pridáva chronické poškodenie tkaniva, ako je transplantačná glomerulopatia alebo arteriálna intimálna fibróza (1). Pri použití súčasných imunosupresív zacielených na T'-bunky sa TCMR považuje za látku s obmedzeným prognostickým vplyvom, zatiaľ čo ABMR je hlavnou príčinou zlyhania štepu, čo súvisí s nedostatkom účinných terapeutických prístupov (2).

Na nájdenie lepších terapií pre MVI a ABMR je potrebný lepší prehľad o biologických mechanizmoch, ktoré sú základom týchto procesov poškodenia. Zdá sa, že vysokovýkonné omické technológie sú na tento účel vhodné, pretože umožňujú presný a súčasný skríning tisícok génov, proteínov a metabolitov (3). Výsluch celého prepisuobličkybiopsie aloštepu preukázali hlboké zmeny génovej expresie mRNA v poškodených rezidentných bunkách alebo v infiltrujúcich bunkových populáciách počas ABMR (4). Medzitým sa mikroRNA (miRNA) ukázali ako kľúčoví hráči v bunkovom metabolizme reguláciou messenger RNA (mRNA) na posttranskripčnej úrovni. V skutočnosti miRNA spôsobili revolúciu v našom chápaní jemného ladenia fyziologických procesov tela, ktoré sa podieľajú na proliferácii, apoptóze, diferenciácii a vývoji (5). Nie je prekvapujúce, že dysregulovaná expresia miRNA vedie k rozvoju mnohých patológií vrátaneobličkové ochorenie(6). Keďže profily expresie miRNA sa medzi chorými a zdravými stavmi líšia, mnohé štúdie analyzovali miRNA buď samotné alebo v kombinácii s inými tradičnejšími markermi, nielen na diagnostiku ochorenia a prognózu progresie ochorenia, ale aj na navrhnutie potenciálnych terapeutických aplikácií (7).

V kontexte transplantácie pevných orgánov sa miRNA môžu podieľať na odmietnutí prostredníctvom svojej úlohy v regulácii funkcie imunitných buniek a v reakcii rezidentných buniek aloštepu na poškodenie (6, 8). Niekoľko štúdií skúmalo aloštepové miRNA ako biomarkery a/alebo efektory v nastaveniach TCMR (8,9), ale žiadna sa doteraz nezamerala na MVI a ABMR. V tejto štúdii sme sa zamerali na integráciu rôznych úrovní omiky zobličkybiopsie aloštepu, aby sme získali prehľad o úlohe miRNA v tomto škodlivom fenotype odmietnutia.

MATERIÁLY A METÓDY Návrh štúdieTáto štúdia je súčasťou programu BIOMArkers financovaného z FP7-RenálnaVýskumný program poranení štepu (BIOMARGIN, https://cordis.europa.eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, číslo NCT02832661), vedený európskym výskumným konzorciom pri hľadaní biomarkerov aloštepových imunitných lézií vtransplantácia obličkys diagnostickou a/alebo prognostickou hodnotou. BIOMARGIN je multicentrická, prospektívna, viacfázová štúdia vykonaná v štyrochtransplantácia obličkycentrá v Európe (Necker Hospital, Paríž, Francúzsko; Univerzitné nemocnice, Leuven, Belgicko; Hannover Medical School, Hannover, Nemecko; a Univerzitná nemocnica, Limoges, Francúzsko). Vzorky sa prospektívne odoberali v čase skríningu a indikačných biopsií medzi aprílom 2013 a júnom 2015 (obrázok IA). Všetky transplantácie sa uskutočnili s negatívnymi krížovými zhodami cytotoxicity závislej od komplementu. V týchto štyroch klinických centrách sa okrem indikačných biopsií vykonali protokolárne biopsie 3, 12 a niekedy aj 24 mesiacov po transplantácii, podľa praxe miestnych centier. Inštitucionálna hodnotiaca komisia na každom mieste štúdiu schválila a všetci pacienti poskytli písomný informovaný súhlas.

Študijné kohortyŠtúdia bola rozdelená do troch fáz (obrázok 1A). V prvej fáze objavovania prípadov a kontrol sa na analýzu globálnej expresie miRNA použili vzorky N=88 biopsie (N=754 miRNA, s výnimkou potenciálnych normalizačných miRNA) . Vzorky sme vybrali na základe dostupnosti a histologických kritérií (okrem prípadov s diagnózou glomerulonefritídy alebo nefropatie spojenej s polyomavírusom a prípadov s nejasnou diagnózou). Na základe údajov z miestnej biopsie sa urobil prvý výber, ktorý sa ďalej spresnil prostredníctvom centrálneho čítania skupinou patológov, nezávislých od pôvodného centra. Štatistická analýza (pozri výber miRNA) sa použila na výber rozšíreného zoznamu miRNA, najviac rozdielne exprimovaných medzi histologickými fenotypmi, ktoré boli následne kvantifikované v 2. fáze.

Podobný dizajn prípadovo-kontrolnej štúdie sa použil pre druhú (výberovú) fázu, kde sa uskutočnila cielená analýza expresie miRNA (N=143) na vzorkách biopsie N=99. Rovnaký štatistický kanál sa použil na výber ešte obmedzenejšieho zoznamu miRNA, ktoré sa následne kvantifikovali v 3. fáze. Nakoniec v tretej (validačnej) kohorte boli všetky vzorky prospektívne a následne odobraté podľa protokolu BIOMARGIN medzi 24. júnom 2014 a 2. júlom 2015 as primeranýmobličkykvalita biopsie aloštepu sa hodnotila pre 38 miRNA vybraných ako výsledok druhej selekčnej fázy. V tejto kohorte v reálnom živote sa neuskutočnila žiadna selekcia na základe histológie, demografie, času alebo akéhokoľvek faktora iného ako dostupnosť vzorky a kritériá kontroly kvality (primeranosť biopsie a výťažok RNA).

Výber miRNARobustný štatistický kanál bol špeciálne vyvinutý pre štúdiu BIOMARGIN v R(R Core Team(10), verzia 1.0.44), ako rozšírenie balíka biosignálu R(1l). Stručne povedané, vo fáze objavovania sme vykonali stratégiu výberu funkcií vrátane jednorozmerných a viacrozmerných prístupov. Pre jednorozmerný výber sme použili neparametrický test (Wilcoxon-Mann-Whitney test) a parametrický test (Studentov t-test) a kohortu Discovery (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238). Predikčné skóre každého transkriptu miRNA v každom multivariačnom modeli sa integrovalo, aby sa získalo "multivariačné skóre". Kombináciou výsledkov týchto jednorozmerných a viacrozmerných analýz sme boli schopní zoradiť a vybrať podskupinu kandidátov miRNA, ktorí budú súčasťou rozšíreného zoznamu, ktorý sa má kvantifikovať počas ďalšej fázy.Pre túto posthoc analýzu zameranú na dráhy VMI sa porovnal medián normalizovanej expresie každej miRNA medzi prípadmi a kontrolami pomocou Wilcoxonovho testu vo všetkých troch kohortách. Kontrolovali sme viacnásobné testovanie pomocou metódy Benjamini & Hochberg false discovery rate (FDR).

Klinickopatologické hodnotenieJednotlivé skóre histologických lézií boli semikvantitatívne hodnotené podľa kritérií Banff 2019 (16). Pojem "mikrovaskulárny zápal" (MVI) sa použil na označenie akéhokoľvek stupňa kombinácie glomerulitídy (g) a/alebo peritubulárnej kapiláry (ptc). Všetky prípady ABMR splnili prvé 2 kritériá klasifikácie Banf 2015 alebo Banff 2017 (histologické dôkaz akútneho poškodenia tkaniva a dôkaz súčasnej/nedávnej interakcie protilátok s vaskulárnym endotelom), ale nie všetky splnili tretie kritérium [sérologické dôkazy darcovských špecifických protilátok (DSA) a/alebo farbenie CAD]. DSA po transplantácii boli stanovené podľa praxe v miestnom centre, pričom pozitivita DSA bola definovaná ako detegovateľné darcovské špecifické sérové ​​anti-HLA protilátky s hodnotou strednej intenzity fluorescencie (MFI) 500 v čase biopsie alebo kedykoľvek predtým.

Extrakcia RNA z bioptických vzoriek na profilovanie mRNA a miRNAZ každej sa odobrali jadrá s dvoma ihlamiobličkybiopsia aloštepu. Jedna sa použila na konvenčné histologické hodnotenie a najmenej polovica druhej sa okamžite skladovala v Allprotect Tissue Reagent (Qiagen Benelux BV, Venlo, Holandsko). Skúmavky Allprotect sa skladovali pri 4 °C (minimálne 24 hodín až maximálne 72 hodín). a potom uchovávané pri -20 stupni až do extrakcie RNA. Celková RNA bola izolovaná zobličkybioptické vzorky aloštepu pomocou univerzálnej súpravy Allprep DNA/RNA/miRNA (Qiagen Benelux BV) na prístroji QIAcube (Qiagen Benelux BV). Množstvo (absorbancia pri 26{{2{24}}}} nm) a čistota (pomer absorbancie pri 230,260 a 280 nm) izolovanej RNA sa merali pomocou spektrofotometra NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Gent, Belgicko). Číslo integrity RNA (RIN) bolo hodnotené pomocou súpravy Eukaryote nano/pico RNA Kit (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgicko) na prístroji Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies BelgiumNV). Indexy kontroly kvality sa medzi VMI a č. Skupiny MVI [RIN(priemer ± SD):5,6±1,96 vs 5,4±1,97,P=0,66; pomer 260/280 (priemer ±SD):1,87±0,06 vs 1,87±0,1l,P{{26 }}.40]. Pre vzorky RNA s nízkym RIN(<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">

CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU OBLIČIEK/RENÁL

miRNA profilovanieSpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 sa považovalo za nevyjadrené. RNU44 a RNU48 vykazovali konzistentnú expresiu vo všetkých vzorkách, priemerný variačný koeficient (RNU44 plus RNU48) bol 3,73 percenta na karte Array A a 3,79 percenta na karte poľa B] a použili sa ako gény pre domácnosť na normalizáciu údajov vo všetkých podštúdiách.

mRNA transkriptomická analýzaTranskriptomická analýza sa uskutočnila pomocou microarray, ako už bolo opísané (17). Stručne, celková RNA extrahovaná zo vzoriek biopsie bola najprv amplifikovaná a biotinylovaná na komplementárnu RNA(cRNA) pomocou súpravy GeneChip 39 IVT PLUS Reagent Kit (Affymetrix) a hybridizovaná s Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays( Affymetrix), ktorý obsahoval 54 675 sád sond pokrývajúcich celý genóm. Použili sme robustnú viacčipovú priemernú (RMA) normalizáciu. Stredná normalizovaná expresia každej mRNA bola porovnaná medzi prípadmi a kontrolami pomocou Wilcoxonovho testu. Kontrolovali sme infláciu rizika alfa v dôsledku viacnásobného testovania použitím metódy Benjamini & Hochberg false discovery rate (FDR). S údajmi mikročipu sa narábalo v súlade s pokynmi pre Minimum Information About Microarray Experiment.

Analýzy In SilicoNa diferenciálnu analýzu transkriptomických údajov sa použil softvér Biological Interpretation Of Multiomics EXperiments (BIOMEX) s použitím anotácie Ensembl ID(18). Analýza cesty vynaliezavosti (IPA, zostava: 478438M Verzia obsahu: 44691306, Qiagen) a OMICSnet(19) sa použili na určenie súborov génov regulovaných vybranými miRNA. OMICSnet sa použil na vykonanie analýzy génovej ontológie s databázou dráh Reactome s použitím kompletnej dráhy (20). Budovanie génových sietí bolo úplne bez dozoru a spoliehalo sa na počet hlásených molekulárnych interakcií každého jedného génu so všetkými ostatnými génmi v sieti. Gény s najvyšším počtom interakcií boli automaticky umiestnené do stredu siete, zatiaľ čo gény s nižším počtom interakcií boli rozšírené do periférie. Bunkový pôvod vybraných miRNA bol skúmaný pomocou projektu Fantom5(21), ktorý poskytuje cap analýzu génovej expresie v ľudských bunkách a tkanivách. Pre analýzu expresie miRNA sme zvážili všetkyobličky-príbuzné štrukturálne bunky a všetky cirkulujúce hematopoetické bunky, bez ďalšej selekcie.

Analýza dát sekvenovania jednobunkovej RNAPoužili sa predtým publikované údaje o sekvenovaní ľudskej jednobunkovej RNA (siRNA-seq) z dvoch biopsií ABMR a štyroch zdravých referencií zodpovedajúcich biopsiám dohľadu nad transplantáciou. Príslušné nespracované počty alebo matice boli stiahnuté v tomto poradí z GEO (GSE145927, https://www.ncbi.nlm. nihgov/geo)(22) aObličkyProjekt presnej medicíny (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Surové matrice génovej expresie vytvorené na vzorku sa spojili a analyzovali s použitím balíka Seurat V4 (23). Parametre použité na vytvorenie a filtrovanie Seuratových objektov boli nasledovné: zahrnutie buniek exprimujúcich medzi 500 a 10 000 detegovaných génov a menej ako 25 percent mitochondriálnych transkriptov. Po filtrovaní boli všetky objekty integrované pomocou pracovného postupu integrácie SCTransform na Seurate (24). Stručne povedané, na integráciu pomocou funkcie PrepSCTIntegration sa použilo 3 000 funkcií a na obmedzenie dávkového efektu sa použila funkcia FindIntegrationAnchors. Pomocou funkcie DimPlot a 16 hlavných komponentov sa vygeneroval úplný súbor údajov UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection). Klastre boli vytvorené pomocou funkcií FindNeighbors a FindClusters s rozlíšením 0,6. Identifikácia klastra sa uskutočnila pomocou funkcie FeaturePlot vyhodnotením expresie špecifických markerov v každom klastri. Bodové grafy boli vytvorené pomocou funkcií vykresľovania DotPlot a FeaturePlot s normalizovanými číslami v teste RNA ako vstupnými údajmi.

CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCIU OBLIČIEK/OBLIVÍN

Štatistická analýzaCharakteristiky pacienta a darcu boli opísané číslami, percentami a frekvenciami pre kategorické premenné. Uviedli sme spojité premenné pomocou priemerov a štandardných odchýlok (SD), ak sú normálne rozdelené, mediány a medzikvartilové rozsahy (IQR) pre premenné so šikmým rozdelením. Porovnali sme ich charakteristiky pomocou Fisherovho alebo Wilcoxonovho testu, ak je to vhodné. Na porovnanie strednej expresie miRNA podľa intenzity MVI sme použili Kruskal-Wallisov test a na korelačnú analýzu Spearmanov test. Zvažovali sme štatistickú významnosť pre P-hodnoty menšie ako 0.05. Na štatistickú analýzu a prezentáciu údajov sme použili GraphPad Prism (verzia 8; GraphPad Software, San Diego, CA) a RStudio (verzia 4.{14}}.3). Boli použité nasledujúce balíky R: heatmap3 (heatmap3_1.1.9)pre analýzy tepelných máp, fmsb(fmsb_0.7.0)a scales (scales_1.1.1)balíky pre radarové grafy, ggplot2 (ggplot2_3.3.5) pre stĺpcové grafy a complot(corrplot_0.90) pre analýzu korelačnej matice.

VÝSLEDKY

Viacstupňová identifikácia miRNA spojených s MVIBetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). Ďalších 59 pacientov (MVI-) malo rôzne diagnózy zahŕňajúce odmietnutie sprostredkované T-bunkami (TCMR, N=8), intersticiálnu fibrózu a tubulárnu atrofiu (IFIA,N=20) a normálne biopsie (N{{6 }}), ale nie MVI. Zo 754 miRNA kandidátov bolo 18 miRNA diferencovane exprimovaných medzi skupinami MVI plus a MVI- (obrázok 1B). Vo výberovej kohorte bol kvantifikovaný obmedzený zoznam 143 miRNA v 99 vzorkách. V tejto výberovej kohorte bolo 14 miRNA rozdielne exprimovaných medzi prípadmi s (N=28) a bez (N=71)ABMR (obrázok 1C). Nakoniec v najväčšej prierezovej kohorte bolo kvantifikovaných 38 miRNA v 298 vzorkách, z ktorých 12 miRNA bolo rozdielne exprimovaných medzi biopsiami ABMR(N=29) vs. bez ABMR (N=269) (obrázok 1D ).

Konzistentná identifikácia 6 miRNA spojených s MVI a korelácia s histológiouĎalej sme preťali 3 zoznamy rozdielne exprimovaných miRNA a identifikovali 6 miRNA, ktoré boli konzistentne spojené s MVI alebo ABMR v 3 nezávislých kohortách (obrázok 2A). miR-142-3p,miR-150-5p,miR -155-5p, miR-222-3p a miR-223-3p boli nadmerne exprimované v MVI/ABMR, zatiaľ čo expresia miR-139-5p bola znížená. Radarové grafy (obrázok 2B) zobrazujú pre každý krok rozdielnu expresiu medzi prípadom a kontrolami 6 miRNA a podporujú robustnosť profilov miRNA v troch nezávislých kohortách. Ďalej sme študovali, ako je expresia 6 miRNA spojená s jednotlivými histologickými léziami v rámci všetkých 483 biopsií aloštepu spolu. Expresia 5 up-regulovaných miRNA sa postupne zvyšovala s intenzitou lézií MVI, zatiaľ čo expresia miR-139-5p bola negatívne korelovaná (obrázok 2C). MiR-139-5p/142-3p/ 150-5p/155-5p/223-3p boli nielen vysoko spojené s vlastnosťami súvisiacimi s ABMR (g, ptc, depozícia C4d), ale aj s léziami súvisiacimi s TCMR (i, t ) a IFTA lézie (ct, ci), čo naznačuje ich zapojenie do bežných, pre ABMR nešpecifických, zápalových a zjazvujúcich procesov. Alternatívne môže medzi léziami prirodzene existovať určitá vnútorná kolinearita, čo vedie k našej neschopnosti identifikovať skutočnú špecifickosť pre jednu léziu. MiR-222-3p nekoreloval s histologickými léziami TCMR alebo IFTA (obrázok 2D).

Integrácia Multi-Omics: Súhra mRNA-miRNA v MVĎalej sme hodnotili rozdielne exprimované gény medzi prípadmi MVI plus a MVI- v predtým publikovanom súbore objavov (25). Z 54 675 sond bolo identifikovaných celkom 2 755 diferenciálne exprimovaných génov (DEG) medzi MVI plus a MVI-

skupiny obsahujúce 1085 down-regulovaných a 1670 up-regulovaných génov (obrázok 3A). Najviac rozdielne exprimované mRNA vo vzorkách MVI plus boli CXCL9 a CXCL10, v súlade s predchádzajúcimi správami (17, 26), že tieto gény sú najviac nadmerne exprimované v ABMR. Ďalej sme použili IPA a OMICSnet na identifikáciu predpokladaných cieľových génov pre každú miRNA in silico. Predpokladalo sa, že celkovo 4504 mRNA bude zacielených aspoň jednou zo 6 miRNA. Potom sme integrovali týchto 4504 predpovedaných cieľov s DEG v biopsiách aloštepu. Integrovaná miRNA/mRNA analýza identifikovala 61° cielené miR-139-5p, ktoré boli významne zvýšené v MVI plus biopsie. Tiež identifikoval 28, 58, 52, 43 a 27 stupňov významne znížené v MVI plus biopsiách, ktoré boli v tomto poradí cielené pomocou miR-142-3p, miR-150-5p, miR-155-5}p, miR{ {22}}p a miR-223-3p (obrázok 3B).

Bunkový pôvod miRNA spojených s MVBunkový pôvod šiestich miRNA bol charakterizovaný rôznymi spôsobmiobličkovébunkové a hematopoetické bunkové podtypy pomocou atlasu miRNA dostupného online [databáza Fantom (27)]. Diskriminované zhlukovanie bez dozoruobličkovémiRNA odvodené z buniek z miRNA odvodených od imunitných buniek (obrázok 4A). Tiež odhalil jeden alebo dva dominantné typy buniek pre každú miRNA. Zdá sa, že MiR-139-5p je exprimovaný hlavne glomerulárnymi endotelovými bunkami (EC). MiR-222-3p, hoci jeho expresia nekorelovala s tubulárnym zápalom (Banffove lézie"t", obrázok 2D), primárne súvisela sobličkovéepitelové bunky. Štyri zostávajúce miRNA boli primárne exprimované v mononukleárnych bunkách periférnej krvi (PBMC) alebo granulocytoch, pričom miR-142-3p obohatený o NK bunky a monocyty, miR-150-5p v CD4 plus a CD8 plus T bunky, miR -155-5p v CD19 plus B bunkách a makrofágoch amiR-223-3p v neutrofiloch.

Jednobunkové sekvenovanie RNA identifikovalo všetky obličkové bunky a infiltrujúce imunitné bunky Aby sme charakterizovali potenciálnu úlohu každej miRNA spojenej s MVI, analyzovali sme verejne dostupné údaje sc-RNAseq z dvochobličkovébiopsie aloštepu s ABMR a vysokým skóre MVI (g2, ptc3)(22). Tieto súbory údajov boli integrované so 4 zdravými referenčnými biopsiami bez MVI. Po kontrole kvality a filtrovaní sa detegovalo 31 545 buniek a zhlukovanie bez dozoru odhalilo 12 zhlukov (obrázok 4B). Použili sme dobre zavedené markery (28) na identifikáciu všetkých hlavných rezidentných a infiltrujúcich bunkových podtypov a ich označenie (doplnkový obrázok S2). Ďalej sme sa zamerali na bunkové populácie, z ktorých sa predpokladalo, že pochádza našich šesť miRNA. V tomto cieli sme bunky rozvrstvili do 4 hlavných zhlukov zodpovedajúcich endotelu, epitelu, lymfocytom a APC (obrázok 4C). V súlade s predchádzajúcou analýzou týchto údajov (22) sa v súboroch údajov sc-RNASeg nezistili ani neutrofilné, ani NK bunkové populácie.

miR-139-5p riadi aktiváciu EC a dráhu prezentácie antigénu počas MVIMiR{0}}p bola jedinou downregulovanou miRNA v našej štúdii v prípadoch s MVI/ABMR (obrázok 2A) a zistilo sa, že pochádza hlavne z glomerulárnej EC (obrázok 4A). Potvrdilo sa, že šesťdesiatjeden z jeho cieľových génov je upregulovaných v hromadnom mikročipe z prípadov MVI plus (obrázok 3B) a ich expresia sa ďalej skúmala pri rozlíšení jednej bunky v 3 predtým identifikovaných subklastroch EC (obrázky 4B, C). Ako je znázornené na obrázku 5A, aktivovaný ECklaster bol detegovateľný iba vo vzorkách MVI plus. Okrem toho polovica zo 61 génov (N=30) bola konzistentne zvýšená v sc-RNAseq MVI plus biopsiách, bez ohľadu na tri EC subklastre. Spomedzi nich bol najviac zvýšeným génom GBP5. Ďalej analýza génovej ontológie pomocou týchto 30 transkriptov odvodených od endotelu identifikovala UBE2D1 a YWHAG ako ústredných hráčov v génovej sieti (obrázok 5B). Konkrétnejšie boli obohatené dráhy súvisiace s imunitou a dráhy spracovania a prezentácie antigénu sprostredkované hlavným histokompatibilným komplexom (MHC) (obrázok 5C). Uskutočnila sa pseudočasová analýza, aby sa lepšie charakterizovali zmeny génovej expresie v priebehu aktivácie EC, trajektória stavu naprieč bunkami (obrázky 5D, E), UBE2D1, YWHAG a GBP5 sa kontinuálne zvyšovali počas endoteliálnej aktivácie spojenej s MVI. Veľmi podobné trajektórie sa našli pre gény súvisiace s MHC HLA-A,-B a -DRA, ale aj pre bonafide endotelovú aktiváciu a markery zápalu, ako sú VCAM1, CXCL9 a CXCL10, čo naznačuje, že všetky tieto gény sú súčasne exprimované počas aktivácie endotelu. Celkovo tieto výsledky naznačujú, že miR-139-5p je znížený počas MV lézií a už nepotláča dráhu prezentácie antigénu MHC v aktivovanom EC.

miR-222-3p Poškodzuje obojeRenálnaFyziologické a imunitne súvisiace dráhy v epiteliálnych bunkách počas MVI Ďalej sme sa zamerali na miR-222-3p, upregulovanú miRNA vo vzorkách MVI sobličkovépôvod epitelových buniek a exkluzívnejšia korelácia s histologickými léziami súvisiacimi s ABMR (obrázky 2A, D, 4A). rozlíšenie buniek v rôznychobličkovéepitelové populácie, ktoré sme predtým identifikovali (obrázky 4B, C). Masívny pokles o 41 z týchto 43 (95 percent) génov vo všetkých identifikovanýchobličkovézhluky epitelových buniek naznačujú umlčanie génov

profil vo VMI (obrázok 6A). Zaujímavé je, že sa podieľajú 4 gényobličkovéfyziologické dráhy (ERBB4, ATPIB1, TIMM50 a KIF3B), ale aj imunitne súvisiace gény (TRAPI a PEBPI) boli identifikované ako centrálne gény v sieti (obrázok 6B). Génová ontológia 43 génov odhalila obohatenie signálnych dráh ErbB, ale aj imunitne podmienených dráh a cytokínová odpoveď (obrázok 6C) a expresia ERBB4 boli ďalej potvrdené vo všetkýchobličkovébunky (obrázok 6D). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že počas VMI je vysoká úroveň-222-3p inobličkovéepitelových buniek je spojená so silnou represiou génov zapojených do obochobličkovédráhy homeostázy elektrolytov a imunitne podmienené dráhy v epiteli.

miR-150-5p reguluje aktiváciu NF-kB v T lymfocytoch počas MVI Podobne sme skúmali regulačnú úlohu (zvýšeného) miR-150-5p počas MVI v klastri T-buniek, kde bol najviac dominantne exprimovaný (Obrázok 4A). Vykreslili sme 58 znížených DEG spojených s MVI identifikovaných vo vzorkách biopsie aloštepu (obrázok 3B) a konfrontovali sme to s génovou expresiou v klastri sc-RNAseq T-buniek (obrázok 7A). Podiel génov zacielených miR150-5p a špecificky nedostatočne exprimovaných v T-bunkách počas MVI bol prekvapivo nízky (15/58, 25,9 percenta), čo naznačuje, že globálny pokles týchto génov in vivo nebol spôsobený výlučne Kompartment T lymfocytov. Napriek tomu sme z tohto vysoko vybraného zoznamu 15 génov a pomocou platformy OMICSnet vytvorili génovú sieť (obrázok 7B) a vykonali analýzu génovej ontológie (obrázok 7C). Zistili sme, že nadmerná expresia miR-150-5p bola spojená s NF -regulácia KB v T lymfocytoch počas MVI.

miR-155-5p Reguluje zostrih mRNA v APC počas MV Nakoniec sa presne rovnaká stratégia použila pre 52miR-155-5p-cieľové gény, nedostatočne exprimované počas MVI (obrázok 3B). Na rozdiel od miR-150-5p v T lymfocytoch sme pozorovali, že takmer dve tretiny miR-155-5p cielených génov bolo v klastri APC sc-RNAseq konzistentne znížené (31/52, 59,6 percent, obrázok 8A). Analýza génovej siete odhalila, že AIFMI a CIAO1 boli centrálne gény (obrázok 8B). Okrem toho génová ontológia odhalila silné obohatenie v dráhach súvisiacich so zostrihom mRNA (obrázok 8C).

DISKUSIAŠtúdia BIOMARGIN je vďaka svojmu jedinečnému dizajnu typickým rámcom pre integráciu multi-omických dát. V skutočnosti sa veľmi robustné potrubia použili v kohortách objavovania, výberu a validácie zahŕňajúcich veľký počet pacientov z rôznych transplantačných centier. V troch nezávislých kohortách sme súčasne pozorovali a potvrdili zvláštny profil expresie 6 miRNA počas MVI: miR-139-5p bol znížený, zatiaľ čo miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p a miR-223-3p sa zvýšili. Dôležité je, že hladina každej z týchto 6 miRNA korelovala so závažnosťou MVI, čo naznačuje mechanizmus regulácie závislý od dávky. Ďalej sme použili kremíkové platformy na skúmanie každého bunkového pôvodu miRNA. Prekvapivo boli pozorované dve odlišné skupiny miRNA: prvá odvodená z infiltrujúcich imunitných buniek a druhá špecifickejšia pre rezidentovobličkovébunky. Potom sa miRNA aj mRNA merali v rovnakom objavovacom súbore vzoriek biopsie, čo umožnilo integrovanú analýzu in vivo validovaných odlišne exprimovaných mRNA / miRNA spojených s MVI. Nakoniec, po opísaní asociácie mRNA / miRNA pri rozlíšení hromadného tkaniva sme potvrdili súhru mRNA / miRNA pri rozlíšení jednej bunky pre štyri zo 6 identifikovaných miRNA.

Je zaujímavé, že miR-139-5p bola jediná miRNA negatívne korelovaná s léziami MVI. Pochádza hlavne z EC a uvádza sa, že reguluje gény súvisiace s MHC. Spomedzi svojich cieľových génov bol UBE2D1 vysoko regulovaný počas endotelovej aktivácie spojenej s MVI. Rodina UBE2D je rodina enzýmov konjugujúcich ubikvitín E2 v systéme ubikvitín-proteazóm (29, 30) a ukázalo sa, že UBeD1 zvyšuje ubikvitináciu March-I, čo vedie k up-regulácii proteínov MHC triedy II (31). Okrem toho bol GBP5 najviac zastúpeným génom inaktivovaným EC počas MVI, čo je v súlade s našimi nedávnymi správami, ktoré ukazujú, že GBP5 je vysoko regulovaný v biopsiách ABMR (17), ale aj vo vzorkách krvi (32). Je zaujímavé, že expresia GBP5 sa ukázala ako indukovateľná interferónom typu II v ľudských mikrovaskulárnych endotelových bunkách maternice spolu s CXCL9 a CXCL10 (33). Včasná úloha týchto dvoch prozápalových chemokínov v procesoch akútnej rejekcie je dobre zdokumentovaná a ich hladina v moči sa navrhuje na monitorovanie rizika akútnej rejekcie pri rutinnom dohľade nad príjemcami transplantovanej obličky (34). Ďalším miR-139-5p cieľom je YWHAG.YWHAG kódujúci proteínovú rodinu HLA-F a bol opísaný ako rozdielne exprimovaný počas aktívneho profibrotického procesu pri diabetickej nefropatii (35). Možná úloha miR-139-5p pri fibróze, poslednej spoločnej ceste po zápale, je o to relevantnejšia, že IFTA bola nedávno zahrnutá do zloženého skóre na predpovedanie prežitia obličkového aloštepu po ABMR (36). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že miR-139-5p už nepotláča expresiu antigénu MCH na povrchu Anethum počas MVI a mohol by sa podieľať na procese chemoatrakcie a fibrózy, ale tieto mechanizmy je potrebné ešte experimentálne potvrdiť, expresiu na povrchu endotelu počas MVI a by sa mohli podieľať na procesoch chemoatrakcie a fibrózy, ale tieto mechanizmy je potrebné ešte experimentálne potvrdiť.

Druhyobličkové-odvodená miRNA, ktorú sme identifikovali, je miR-222- 3p, ktorej expresia je špecifickejšia pre lézie MVI: je spojená so skóre g a PTC, ako aj s ukladaním C4d, ale nie s léziami i alebo t. Vznikol však najmä z epitelových buniek. Po multi-omickej integrácii pri rozlíšení buniek sme zistili, že miR-222-3p potláča hlavne signalizáciu ErbB, ktorá je rozhodujúca pre základné bunkové funkcie, ako je proliferácia, migrácia, rast a diferenciácia (37). V biológii človeka je potrebná fyziologická signalizácia ErbBobličkovéhomeostáza elektrolytov a udržiavanie integrity obličiek (38). Naše výsledky tiež identifikovali ADAM22, NRG1, ZNF91 ako gény súvisiace so signalizáciou ErbB, ktoré sú výrazne potlačené v epiteli počas MVI. Ďalšie gény nevyhnutné pre fyziológiu obličiek, ako sú ATP1B1 a KIF3B, boli tiež potlačené v renálnom epiteli pomocou miR{8}}p počas MVI. Predtým Baker a kol. ukázali, že ATP1B1 (podjednotka b1 Na plus /K plus -ATPáza) riadiobličkovétubulárna reabsorpcia sodíka (39). Okrem toho Aguado-Fraile a kol. identifikovali člena Kinesin Family 3B (KIF3B), ktorý sa podieľa na prenose buniek v bunkách proximálnych tubulov potkanov. KIF3B sa javí ako kľúčový mediátor odpovede buniek proximálneho epitelového tubulu na ischémiu/reperfúziu s potenciálnou aplikáciou vobličkovémanažment ischemického poškodenia (40). Môžeme teda špekulovať, že miR-222-3p potláča základné fyziologické dráhy počas MVI v epiteli. Okrem toho sú imunitne podmienené dráhy tiež regulované nadmernou expresiou miR-222-3p: dôležité gény ako TRAP1 a PEBP1 boli úplne inhibované vo vzorkách so silným MVI. Je zaujímavé, že sa ukázalo, že TRAP1 sa zlepšilobličkovétubulointersticiálna fibróza u myší s jednostrannou ureterálnou obštrukciou ochranouobličkovémitochondrie tubulárnych epitelových buniek (41). Okrem toho PEBP1 poskytuje protizápalové účinky prostredníctvom inhibície MAPK aj NF-kB dráh za homeostatických/bazálnych podmienok (42). Inobličkovéepitel, štúdia Marka et al. elegantne ukázali, že postischemická aktivácia NF-kB zhoršuje tubulárne poškodenie a zhoršuje zápal (43). V našich rukách bol PEBP1 úplne potlačený miR-222-3p, čo naznačuje, že dráha NF kB sa uvoľňuje počas MVI. Celkovo tieto výsledky ukazujú, že biológia epitelu je narušená počas MVI aobličkovéepitelové bunky aktívne reagujú na poranenia MVI, zatiaľ čo účasť tohto tkaniva na MVI sa rieši len zriedka. Tieto molekulárne nálezy môžu vrhnúť nové svetlo na akútne tubulárne poranenia, dobre zavedené, ale dlho zanedbávané kritériá ABMR. Okrem toho sa ukázalo, že epitelové bunky môžu vylučovať exozomálny miR-222-3p a indukovať fenotyp M2 v makrofágoch (44). Medzitým Li a spol. nedávno oznámili, že makrofágy M2 nadmerne exprimujú miR-155 a dodávajú túto miRNA do mikroprostredia, a to aj prostredníctvom sekrécie exozómov. Pri transplantácii obličky sa miR-155 zvýšil pri rôznych stavoch (IFTA, akútna rejekcia a TCMR) a v telesnej tekutine alebo tkanivách (45). Je zaujímavé, že miR - 155 môže podporovať epitelovo-mezenchymálny prechod prostredníctvom zacielenia RASSF4 v epitelových bunkách (46). Tento presluch na báze miRNA medzi makrofágmi aobličkovéepitelové bunky sa ešte musia posúdiť vtransplantácia obličieka konkrétnejšie v kontexte MVI. V súlade s týmito zisteniami sme pozorovali, že miR{0}}p bol exprimovaný hlavne APC zahŕňajúcimi monocyty a makrofágy. V tejto konkrétnej podskupine odhalila ontológia miR- 155-5p-cieľových génov obohatenie v dráhach zostrihu premRNA. Zaujímavé je, že Janssen a spol. uviedli, že zápal pľúc indukoval dráhy zostrihu pre-mRNA v alveolárnych makrofágoch. Okrem toho sa aktivácia zostrihu pre-mRNA líšila v makrofágoch rezidentných v tkanive v porovnaní s makrofágmi získanými z monocytov (získanými krvou). Boli hlásené zmeny v jadrovom metabolizme v pribratých makrofágoch so zvýšeným efluxom prostredníctvom glykolýzy a zníženým efluxom cez cyklus trikarboxylových kyselín (cyklus TCA, tj Krebsov cyklus) (47). Čo sa týka miR-150-5p, zistili sme, že jeho nadmerná expresia počas MVI bola spojená s dráhou NF-kB v zhluku lymfocytov zahŕňajúcom vrodené NKT bunky aj adaptívne T bunky. Je zaujímavé, že miR-150-5p je rozhodujúci pre tvorbu zrelých a funkčných NK buniek (48) a miR-150-5p deficitné CD8 plus T bunky boli hlásené ako menej cytotoxické (49). Okrem toho môžu CD8 T bunky tiež vylučovať miR-150-5p v exozómoch (50), čo by zase mohlo podporovať aktiváciu fibroblastov v tubulárnych epiteliálnych bunkách a následneobličkovéfifibróza, ako naznačujú nedávne správy (51, 52).

CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCIU OBLIČIEK/RENÁL

Naša štúdia má určité obmedzenia. Náš výskum sme zamerali na 6 miRNA, konzistentne identifikovaných v našom viackrokovom dizajne. Pokračovali sme však s postupným výberom miRNA, pričom vo validačnej kohorte bola kvantifikovaná iba časť všetkých známych miRNA. Štatistická dráha výberu miRNA sa opierala o počiatočný dizajn BIOMARGIN, ktorý je vhodný na identifikáciu diagnostických biomarkerov pre viaceré koncové body (ABMR, ale aj TCMR a IFTA). Preto, hoci sa významne zvýšil v kohortách objavovania a výberu (obrázok 2A), miR-146a nebol kvantifikovaný vo validačnej kohorte. Tým bola miR{5}}a de facto vylúčená z nášho výberového procesu, hoci literatúra naznačuje úlohu pri ischémii/reperfúzii pri transplantácii obličky (53) a pri kontrole aloimunitných odpovedí sprostredkovanej Treg (54). Okrem toho nemôžeme vylúčiť, že výkonnejšia veľkosť vzorky by priniesla viac miRNA, ako napríklad miR-138 (nadol) a miR-511 (nahor), ktoré boli rozdielne vyjadrené v prípadoch ABMR výberovej kohorty a vykazovali trend rovnakým smerom v objaviteľskej kohorte. Okrem toho sme nevykonali analýzu sc-RNAseq na našich vlastných bioptických vzorkách, ale použili sme online dostupný súbor údajov sc-RNAseq. V čase návrhu štúdie a odberu vzoriek biopsie technológia scRNAseq skutočne ešte nebola k dispozícii a potreba čerstvo odobratých vzoriek neumožňovala retrospektívne použitie zmrazených vzoriek alebo vzoriek zaliatych do parafínu. Podobne sa profilovanie mRNA uskutočnilo pomocou mikročipov, štandardnej technológie v tom čase, ktorú teraz prekonala RNA-seq novej generácie. Použitie online dostupného súboru údajov sc-RNAseq obmedzuje našu schopnosť hlásiť základné demografické charakteristiky pacientov. Tieto chýbajúce informácie by mohli vyvolať obavy týkajúce sa reprezentatívnosti skupín obyvateľstva. Navyše sme nekontrolovali žiadny technický aspekt sekvenovania. Preto pri zvolenom rozlíšení naša analýza sc-RNAseq nezistila v týchto vzorkách žiadny zhluk neutrofilov alebo NK buniek. Preto sa naše následné analýzy miR-142-3p a miR{20}}p obmedzili na vybudovanie ich príslušnej cieľovej génovej siete a ontológie (doplnkový obrázok S2) a neumožnili žiadne skúmanie rozlíšenia jednej bunky. Génová sieť a ontológia 27 cieľových génov miR-223-3p však odhalili obohatenie cyklu TCA (doplnkový obrázok S2) spolu so signalizáciou ERBB. Môžeme teda špekulovať, že tak miR-155-5p v monocytoch, ako aj miR-223-3p v neutrofiloch zohrávajú úlohu v metabolizme a zápalovej odpovedi týchto buniek počas MVI. Okrem toho sa už ukázalo, že miR-142-3p je zvýšený pri odmietnutí obličkového aloštepu (9, 55, 56), ale doteraz nebol špecificky spojený s ABMR. Ďalším obmedzením našej štúdie je, že špecifické zmeny génovej expresie v zriedkavých infiltrujúcich bunkách môžu byť maskované pri analýze hromadnej génovej expresie. Preto sú potrebné ďalšie štúdie zahŕňajúce viac vzoriek, aby sa umožnilo riadne vyšetrenie všetkých, dokonca aj zriedkavých bunkových podtypov, ale v súčasnosti sú obmedzené relatívne vysokými nákladmi na techniku.

Na záver sme tu skúmali molekulárne dráhy spojené s MVI, hlavným histologickým poškodením súvisiacim s ABMR. Použitý integrovaný omický prístup nám umožnil odhaliť nové cesty zapojené do MVI a naznačuje, že modifikácie metabolizmu tubulárneho epitelu sa vyskytujú v dôsledku ABMR mimo blízkeho endotelového kompartmentu. Naša štúdia ilustruje veľký potenciál multi-omík na odhalenie mechanizmov chorôb a pripravuje pôdu pre nové výskumy na ďalšie objasnenie vzájomného pojednávania medziobličkovérezidentné a aloštep-infiltrujúce bunkové podskupiny.