Skúmanie účinku hypertyreózy na stres endoplazmatického retikula a potenciál prechodného receptora Kanonický 1 kanál v obličkách

pre viac informácií:{0}}

Nuriye Ezgi BEKTUR AYKANAT^1,*,Erhan ŞAHİN², Sedat KAÇAR², Rıdvan BAĞCI³, Şerife KARAKAYA²,Dilek BURUKOĞLU DÖNMEZ², Varol ŞAHİNTÜRK²

¹Ústav histológie a embryológie, Lekárska fakulta, Atılım University, Ankara, Turecko²Ústav histológie a embryológie, Lekárska fakulta, Univerzita Osmangazi, Ankara, Turecko ³Andrologické laboratórium oddelenia IVF jednotky, Vzdelávacia a výskumná nemocnica mesta Adana, Adana, Turecko

Pozadie/cieľ:Hypertyreózaje spojená s výsledkami zvýšenej rýchlosti glomerulárnej filtrácie, ako aj zvýšenej aktivácie renín-angiotenzín-aldosterónu. Porucha Ca2 plus homeostázy v endoplazmatickom retikule (ER) je spojená s mnohými chorobami, vrátane diabetickej nefropatie ahypertyreóza. Kanonický kanál 1 (TRPC1) s prechodným receptorovým potenciálom je prvý klonovaný proteín rodiny TRPC. Hoci je vyjadrená na mnohých miestach vobličky, jeho funkcia je neistá. TRPC1 sa podieľa na regulácii homeostázy Ca2 plus a jeho upregulácia zvyšuje hladinu ER Ca2 plus, aktivuje rozvinutú proteínovú odpoveď, ktorá vedie k poškodeniu buniek vobličky. Táto štúdia skúmala úlohu TRPC1 vobličkyhypertyroidných potkanov z hľadiska ER stresových markerov, ktorými sú glukózou regulovaný proteín 78 (GRP78), aktivačný transkripčný faktor 6 (ATF6), (kináza endoplazmatického retikula podobná proteínovej kináze R (PKR)) (PERK), enzým vyžadujúci inozitol 1 (IRE1).

Materiály a metódy: Dvadsať samcov potkanov sa rozdelilo do kontrolnej skupiny a skupiny s hypertyreózou (n=10).Hypertyreózabol vyvolaný pridaním 12 mg/l tyroxínu do pitnej vody potkanov počas 4 týždňov. Merali sa hladiny T3 a T4 bez séra (fT3, fT4), TSH, dusík močoviny v krvi (BUN) a kreatinín. Histochemická analýzaobličkypre protilátky GRP78, ATF6, PERK, IRE1, TRPC1 sa vykonali rezy na morfologické zmeny a tiež imunohistochemická a western blot analýza rezov obličiek.

Výsledky: Hladiny TSH, BUN a kreatinínu sa znížili, zatiaľ čo hladiny fT3 a fT4 sa zvýšili u potkanov s hypertyreózou. Morfologická analýza viedla k zhrubnutiu kapilárnej bazálnej membrány v glomerulách a tiež western blot a imunohistochemické výsledky ukázali zvýšenie TRPC1, GRP78 a ATF6 u hypertyroidných potkanov (p <>

Záver: Na záver, v našej štúdii sme prvýkrát ukázali, že vzťah medzi ER stresom a TRPC1 a ich zvýšená expresia spôsobili poškodenie obličiek u hypertyroidných potkanov.

Kľúčové slová:Hypertyreóza, stres endoplazmatického retikula (ER), prechodný receptorový potenciál kanonický 1 (TRPC1),obličky, potkan

1. Úvod

Trijódtyronín (T3) a tyroxín (T4) sú hormóny štítnej žľazy nevyhnutné pre normálny vývoj orgánov a metabolické funkcie [1]. Okrem toho regulujú rýchlosť rastu, funkciu sodíkovej/draslíkovej pumpy, srdcovú frekvenciu, krvný tlak, dýchanie, spotrebu kyslíka, trávenie, metabolizmus tukov, sacharidov a bielkovín, funkciu centrálneho nervového systému, pohyby a metabolické funkcie iných žliaz s vnútornou sekréciou [2]. .

Hypertyreózamá mnoho účinkov na cholesterol, triglyceridy, lipidy, oxidáciu, antioxidanty, malondialdehyd (MDA), katalytický enzým katalázu (CAT), pečeňové enzýmy, kyselinu močovú, močovinu, kreatinín a histopatologické zmeny v pečeni a obličkách [3]. Dysfunkcia štítnej žľazy ovplyvňuje fyziológiu a vývoj obličiek. Pri hypotyreóze, pri ktorej štítna žľaza pracuje menej, sa obličková hmota (pomer obličky/telesná hmota) znižuje, kým prihypertyreózapri ktorých žľaza tvrdo pracuje, pribúda obličková hmota [4]. Závažná hypertyreóza však vedie k degradácii proteínov a nakoniec k atrofii obličiek. Hypertyreóza spôsobuje zvýšenie renálneho prietoku krvi (RBF) a glomerulárnej filtrácie (GFR) [5]. Pri hypertyreóze sa zvyšuje reabsorpcia sodíka v proximálnom tubule, bazolaterálna aktivácia Na plus /K plus ATPáza [6], apikálny Na plus /H plus modifikátor [7] a kotransportér Na plus /Pi [8]. Hormón štítnej žľazy tiež aktivuje modifikátor Na plus / Ca2 plus, pravdepodobne prostredníctvom dráhy spojenej s cAMP, čím sa zvýši absorpcia vápnika vobličky[9].

Vápnik je druhý posol, ktorý reguluje väčšinu bunkových funkcií, vrátane génovej expresie a bunkovej homeostázy [10], uvoľňovania neurotransmiterov a funkcie neurónov [11], metabolizmu a modulácie bunkového života [12]. Rodina kanálov prechodného receptorového potenciálu (TRP) je jednou z najväčších rodín katiónových kanálov. Rodina TRP sa delí na podskupiny TRPC (kanonické), TRPM (melastatín), TRPP (polycystín), TRPV (vaniloidné), TRPML (bukolické), TRPA (ankyrínové) a TRPN (podobné NOMPC). Je známe, že proteíny TRPC tvoria Ca2 plus permeabilné, neselektívne katiónové kanály, a preto hrajú dôležitú úlohu v Ca2 plus signálnej transdukcii. Cicavčia rodina TRPC má sedem členov nazývaných TRPC1-TRPC7 [13]. Členovia rodiny TRPC sú vyjadrení v rôznych častiachobličky. TRPC1, ktorý hrá úlohu najmä pri diabetickej nefropatii, je exprimovaný takmer všade, v obličkových mezangiálnych bunkách, glomeruloch, bunkách proximálnych tubulov a v tenkej zostupnej časti Henleovej slučky, ale jeho presná funkcia je stále neznáma [14].

Závažné poruchy Ca2 plus môžu spustiť poškodenie buniek spôsobené stresom endoplazmatického retikula (ER) v reakcii na rôzne patologické stavy [5,15]. Poruchy Ca2 plus homeostázy pri ER sú spojené s mnohými ochoreniami [16]. ER je intracelulárna organela, ktorá je dôležitá pre reguláciu Ca2 plus homeostázy a syntézu a skladanie proteínov. Modulácia expresie/funkcie Ca2 plus permeabilných kanálov tiež ovplyvňuje intracelulárne koncentrácie Ca2 plus a následne procesy súvisiace s Ca2 plus, ako je bunková proliferácia, ER stres, apoptóza a autofágia. ER stres je stav, ktorý narúša redoxnú rovnováhu a luminálnu Ca2 plus homeostázu, čo spôsobuje akumuláciu rozložených/chybne poskladaných proteínov. Aktivácia odozvy rozloženého proteínu (UPR) spôsobuje zvýšenie glukózou regulovaného proteínu 78 (GRP78), chaperónu ER, ktorý zvyšuje kapacitu skladania proteínov v ER [17]. Aktivácia stresu ER iniciuje evolučne konzervovaný UPR tromi hlavnými signálnymi prevodníkmi membrány ER: PERK, IRE1 a ATF6. Bunková dysfunkcia a bunková smrť nastávajú za podmienok, keď je stres ER chronicky predĺžený a proteínová záťaž na ER podstatne prevyšuje. Je známe, že jedna z ciest spôsobujúcich smrť buniek pozorovaná pri chronických ochoreniach, ako je hypoxia, ischémia/reperfúzne poškodenie, neurodegenerácia, srdcové choroby a diabetes, je spôsobená stresom z ER [12].

Vo svetle všetkých týchto informácií sme sa zamerali na skúmanie vzťahu medzi dráhami prenosu signálu TRPC1 a ER-stresom vobličky, ktoré sú ovplyvnené všeobecne vhypertyreóza.

Kliknite naCistanche sa používa na príznaky ochorenia obličiek

2. Materiály a metódy

2.1. Zvieratá

Naša štúdia bola schválená Miestnym výborom pre etiku zvierat Univerzity Eskişehir Osmangazi (rozhodnutie č. 634 na stretnutí č. 117 dňa 30.11.2017) a riadila sa Príručkou pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat, ktorú vydal National Institutes of Health. Dvadsať dospelých (vo veku 7 – 8 týždňov) albínskych samcov potkanov Wistar, získaných z Medical and Surgical Experimental Research Center (TICAM), bolo udržiavaných pri teplote 24 ± 2 stupňov a 55 ± 5 percent vlhkosti počas 12 hodín v svetlom/tmavom prostredí. Experiment. Zvieratá sa umiestnili do polykarbonátových klietok na 2 týždne pred experimentom a nechali sa prispôsobiť okolitým podmienkam a potom sa náhodne rozdelili do kontrolných skupín a skupín s hypertyreózou. Kontrolná skupina (euthyroidná) bola počas experimentu kŕmená štandardným krmivom pre potkany a vodou z vodovodu. Skupina s hypertyreózou bola založená so štandardným krmivom pre potkany počas 4 týždňov a pitnou vodou z vodovodu s obsahom 12 mg/l tyroxínu [18]. Na konci štvrtého týždňa boli potkany usmrtené intramuskulárnou injekciou ketamínu (45 mg/kg) a xylazínu (5 mg/kg). Okamžite sa všetkým zvieratám odobrali intrakardiálne vzorky krvi. Celýobličkyboli odstránené procesom nefrektómie. Potom doprava a doľavaobličkypotkanov sa pozdĺžne rozrezalo na dva kusy. Kúsky pravej aj ľavej obličky sa použili na analýzu Western blot aj svetelnú mikroskopiu

2.2. Biochemické analýzy

Vzorky krvi sa 10 minút centrifugovali pri 11, 000 ot./min. Séra boli umiestnené do skúmaviek a skladované pri -80 stupňoch až do dňa analýzy. Hladiny bezsérového T3 (fT3), voľného T4 (fT4) a hormónu stimulujúceho štítnu žľazu (TSH) sa potom merali pomocou techniky ELISA podľa protokolu výrobcu. Úrovne expresie optickej hustoty (OD) boli odčítané pri 450 nm pomocou BioTek microplate reader 800 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA), potom boli vypočítané výsledky. Komerčné súpravy pre fT3 (YLA0127RA), fT4 (YLA0239RA) a TSH (YLA0047RA) boli zakúpené od Shanghai YL Biotech, Čína. Tiež sa merali hladiny močovinového dusíka v krvi (BUN) a kreatinínu pomocou metódy absorbančnej fotometrie od Cobas Integra 400 Plus Roche (Roche Diagnostics Ltd., Švajčiarsko).

2.3. Histologické vyhodnotenie

Obličkykúsky odobraté na skúmanie na úrovni svetelného mikroskopu boli fixované v 10 percentnom formaldehyde počas 48 hodín. Po rutinnom spracovaní tkaniva sa získali parafínové bloky. Potom sa odobrali 5 um sériové rezy a zafarbili sa technikou kyselina jodistá-Schiff (PAS). Mikroskopické hodnotenie bolo uskutočnené pre glomeruly a tubuly pod mikroskopom Olympus BX-51 (Olympus America, Inc., New York, USA). Rezy boli hodnotené slepým, semikvantitatívnym spôsobom s použitím zavedenej bodovacej stupnice. Pre každého potkana v skupinách sa skúmalo najmenej 10 polí s vysokou silou (x 1000). Percento glomerulov, ktoré vykazovali zhrubnutie glomerulárnej bazálnej membrány, bolo hodnotené nasledovne: 0=žiadne, 1 menšie alebo rovné 25 percent, 2=25 percent až 50 percent, 3 =50 percent až 75 percent , 4 Väčšie alebo rovné 75 percentám [19]. Hrúbka glomerulárnej bazálnej membrány (um) sa merala pomocou ZEISS ZEN 3.0 Microscope Software (Carl Zeiss Microscopy GmbH ZEISS Group, München, Nemecko).

2.4. Imunohistochemické hodnotenie

Parafínové blokové rezy z každéhoobličkytkanivo sa odoberalo na pozitívne nabité sklíčka. Po deparafinizácii boli sklíčka prenesené cez degradované etanolové série a potom xylol. Rezy sa inkubovali s 3 percentným peroxidom vodíka, aby sa zabránilo endogénnej peroxidázovej aktivite. Po získaní antigénu citrátovým pufrom boli rezy ohraničené pap-perom, premyté 3 x 5 minút fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS) a potom blokované Ultra V-blokom počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Rezy boli inkubované s králičou polyklonálnou ATF6 protilátkou (ab203119, Abcam Inc., Cambridge, USA), králičou polyklonálnou IRE1 protilátkou (YID5384, Shanghai YL Biotech Co., Ltd, Čína), myšou monoklonálnou protilátkou PERK (sc377400, Santa Cruz Biotechnology Inc. ., Heidelberg, Nemecko) a myšia monoklonálna TRPC1 protilátka (sc133076, Santa Cruz Biotechnology Inc.) cez noc pri plus 4 stupňoch vo zvlhčených podmienkach. Po premytí 3 x 5 minút PBS sa rezy inkubovali s vhodnými sekundárnymi protilátkami (sc2359, sc2781, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Potom sa znova premyli 3 x 5 minút PBS a kontrastne sa zafarbili hematoxylínom. Sklíčka sa aplikovali krycie sklíčko pomocou média na báze vody. Mikroskopické vyšetrenie sa uskutočnilo pomocou mikroskopu Olympus BX51 a počítačom podporovaného zobrazovacieho systému (Olympus America, Inc., New York, USA).

Všetky imunofarbené rezy boli hodnotené kódovaným spôsobom hlavným autorom, ktorý bol slepý k názvu skupiny experimentov. Expresie TRPC1, ATF6, IRE1 a PERK sa detegovali hlavne v tubuloch a/alebo glomeruloch. Výrazy boli semikvantitatívne stanovené podľa percenta pozitívnychobličkyoddielov. Intenzita farbenia bola klasifikovaná do štyroch stupňov: žiadny ({{0}}), slabý (1), stredný (2) a silný (3). Percento pozitívnych histologických rezov obličiek bolo klasifikované ako 4 stupne: 0 (0 percent), 1 (1 percento –10 percent), 2 (11 percent –49 percent) a 3 (50 percent –100 percent). Celkové skóre bolo súčinom dvoch skóre a konečné skóre jednej vzorky bolo priemerom 10 mikroskopických polí. TRPC1, ATF6, IE1 a PERK boli hodnotené podľa uvedenej metódy [20].

Cistanche-funkcia obličiek

2.5. Western blot analýzy

Na určenie zmien v množstve špecifického proteínu vobličkytkaniváchhypertyreózaa kontrolné skupiny boli obličky narezané na malé kúsky a homogenizácia bola vykonaná pridaním lyzačného pufra RIPA do 2 ml guľôčkových skúmaviek. Po homogenizácii boli skúmavky inkubované pri 4 stupňoch aspoň 3 0 min a potom boli tkanivové lyzáty centrifugované pri 4 stupňoch, 15, 000 g počas 20 min. Supernatant obsahujúci celkový proteín sa preniesol do novej skúmavky. Stanovenie proteínu sa uskutočnilo zo supernatantu pomocou zariadenia Qubit 2.0 (Invitrogen Inc., Waltham, MA, USA). Do každej jamky bolo nanesených 50 ug proteínu, podrobený elektroforéze pomocou SDS-PAGE Bio-Rad MiniTrans Blot (Bio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornia, USA) a potom prenesený na PVDF membránu pomocou zariadenia Bio-Rad Trans Turbo. Membrány sa blokovali 5 percentným hovädzím sérovým albumínom (BSA) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a potom sa inkubovali s myšou monoklonálnou protilátkou GRP78 (sc166490, Santa Cruz Biotechnology Inc.), králičou polyklonálnou ATF6 protilátkou (ab203119, Abcam Inc., Cam bridge, USA), králičia polyklonálna protilátka IRE1 (YID5384, Shanghai YL Biotech Co. Ltd., Čína), myšacia monoklonálna protilátka PERK (sc377400, Santa Cruz Biotechnology Inc.), myšacia monoklonálna protilátka TRPC1 (sc133076, Santa Cruz Biotechnology, Inc. a myšia monoklonálna aktínová protilátka (sc47778, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (na kontrolu nanášania) cez noc pri 4 stupňoch. Potom sa membrány premývali 3 x 10 minút premývacím roztokom (TBST), nasledovala inkubácia s vhodnými sekundárnymi protilátkami (sc2005, sc2030, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Potom, čo sa membrány premyli 3 x 10 minút TBST, hladiny expresie proteínov v imunoreaktívnych pásoch boli monitorované zobrazovacím systémom (C-Digit, Licor, Cambridge, UK). Výsledky obrázkov sa analyzovali pomocou programu Image J 1,49v.

2.6. Štatistická analýza

Všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou programu IBM SPSS 21.0 štatistického balíka (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Experiment Western blot sa opakoval trikrát pre každú skupinu. Hladina významnosti bola prijatá ako p < 0,05.="" na="" určenie="" normálneho="" rozdelenia="" údajov="" sa="" použil="" shapiro-wilkov="" test.="" test="" homogenity="" rozptylu="" (levenov="" test)="" sa="" použil="" na="" posúdenie,="" či="" skupiny="" mali="" rovnaké="" rozdiely.="" pre="" údaje="" ukazujúce="" normálnu="" distribúciu="" sa="" uskutočnil="" t-test="" nezávislých="" vzoriek.="" mann-whitney="" u="" test="" sa="" uskutočnil="" pre="" údaje="" ukazujúce="" nenormálne="">

3. Výsledky

3.1. Biochemické výsledky

Hladiny fT3, fT4 a TSH v sére, hladiny BUN v sére a hladiny kreatinínu skupín potkanov sú znázornené na obrázku 1. Výsledky naznačujú, že hladiny fT3 a fT4 sa významne zvýšili v skupine s hypertyreózou v porovnaní s kontrolnou skupinou (obe p < {{5="" }}.05).="" okrem="" toho="" sa="" zistil="" významný="" pokles="" hladín="" tsh="" v="" skupine="" s="" hypertyreózou="" v="" porovnaní="" s="" kontrolnou="" skupinou="" (p="">< 0,05)="" (obrázok="" 1a).="" hladiny="" sérového="" bun="" (obrázok="" 1b)="" a="" kreatinínu="" (obrázok="" 1c)="" významne="" klesli="" v="" skupine="" s="" hypertyreózou="" v="" porovnaní="" s="" kontrolnou="" skupinou="" (obe="" p=""><>

3.2. Histochemické výsledky

Histologické zmenyobličkyskupín potkanov sú znázornené na obrázku 2. Histológia obličiek (glomeruly, tubuly a vaskulárne štruktúry) bola typická v kontrolnej skupine (obrázok 2A). všakhypertyreózaspôsobilo zhrubnutie kapilárnej bazálnej membrány v glomerule (obrázok 2B). Hrúbka glomerulárnej bazálnej membrány sa významne zvýšila v skupine s hypertyreózou v porovnaní s kontrolnou skupinou (obrázok 3–4), (p < 0,05).="" z="" hľadiska="" tubulárnej="" histológie="" nebol="" medzi="" kontrolnou="" skupinou="" a="" skupinou="" s="" hypertyreózou="" žiadny="" zjavný="">

Obrázok 1. Hladiny voľného trijódtyronínu (fT3), voľného tyroxínu (fT4) a hormónu stimulujúceho štítnu žľazu (TSH) v skupinách potkanov (a). * Odlišné od kontrolnej skupiny (p < 0.05).="" hladiny="" bun="" (b)="" a="" kreatinínu="" (c)="" v="" sére="" skupín="" potkanov.="" *na="" rozdiel="" od="" kontrolnej="" skupiny="" (p="">< 0,001)="" bol="" vykonaný="" nezávislý="" t-test="">

Obrázok 2. Mikrofotografieobličkytkanivá kontrolnej (A) a hypertyroidnej (B) skupiny. V kontrolnej skupine sa pozoruje typická histológia obličiek (A). V skupine s hypertyreózouhypertyreózaspôsobilo zhrubnutie kapilárnej bazálnej membrány v glomerulu. Bolo pozorované zhrubnutie kapilárnej bazálnej membrány v glomerule (šípka) (B). Neexistujú žiadne zjavné rozdiely v dreni obličiek v oboch skupinách potkanov. (Sfarbenie kyselinou periodickou - Schiff (PAS)). Pruhy sú 20 um a 50 um.

3.3. Imunohistochemické výsledky

Imunohistochemické reakcie TRPC1, GRP78, ATF6, IRE1, PERK a ich expresie sú semikvantitatívne stanovené podľa percenta pozitívnychobličkyskupín potkanov (obrázok 5-9). Tiež ich priemerná variácia je uvedená v tabuľke. V porovnaní s kontrolnou skupinou sa expresia proteínov TRPC1, GRP78, ATF6, IRE1 a PERK významne zvýšila v skupine s hypertyreózou v glomeruloch a tubuloch (obrázok 5–9) (p < 0,="" 000).="" výsledky="" ukázali,="" že="" trpc1="" bol="" exprimovaný="" v="" glomerulárnych="" aj="" tubulárnych="" štruktúrach="" v="" kontrolnej="" skupine="" (obrázok="" 5-1ab)="" a="" jeho="" expresia="" bola="" zvýšená="" v="" skupine="" s="" hypertyreózou="" (obrázok="" 5-2ab).="" grp78="" nebol="" exprimovaný="" v="" kontrolnej="" skupine="" (obrázok="" 6-1ab)="" a="" jeho="" pozitívna="" reakcia="" bola="" pozorovaná="" v="" tubuloch="" aj="" glomeruloch="" v="" skupine="" s="" hypertyreózou="" (obrázok="" 6-2ab);="" zatiaľ="" čo="" atf6="" nebol="" exprimovaný="" v="" kontrolnej="" skupine="" (obrázok="" 7-1ab),="" jeho="" expresie="" reagovali="" pozitívne="" v="" tubuloch="" aj="" glomeruloch="" v="" skupine="" s="" hypertyreózou="" (obrázok="" 7-2ab).="" ire1="" nebol="" exprimovaný="" v="" kontrolnej="" skupine="" (obrázok="" 8-1ab)="" a="" jeho="" pozitívna="" reakcia="" bola="" pozorovaná="" v="" tubuloch="" aj="" glomeruloch="" v="" skupine="" s="" hypertyreózou="" (obrázok="" 8-2ab).="" zatiaľ="" čo="" perk="" nebol="" exprimovaný="" v="" kontrolnej="" skupine="" (obrázok="" 9-1ab),="" expresia="" perk="" bola="" obmedzená="" na="" tubuly="" v="" skupine="" s="" hypertyreózou="" (obrázok="">

Obrázok 3. Porovnanie hrúbky glomerulárnej bazálnej membrány medzi kontrolnou a hypertyroidnou skupinou. *Na rozdiel od kontrolnej skupiny (p < 0,05)="" bol="" vykonaný="" nezávislý="" t-test="">

Obrázok 4. Porovnanie skóre hrúbky glomerulárnej bazálnej membrány medzi kontrolnou a hypertyroidnou skupinou. *Na rozdiel od kontrolnej skupiny (p < 0.05)="" bol="" vykonaný="" mann-whitney="" u="">

3.4. Výsledky Western blot

Výsledky Western blot (obrázok 10) ukázali štatisticky významné zvýšenie expresie TRPC1, PERK, ATF6 a GRP78 v skupine s hypertyreózou v porovnaní s kontrolnou skupinou (p < 0,05).="" zvýšenie="" ire1="" bolo="" štatisticky="" významné,="" aj="" keď="" nie="" také="" ako="" hladiny="" iných="" proteínov="" (p=""><>Hypertyreózaspôsobilo zvýšenie expresie GRP78 (2,16-krát), ATF6 (2,82-krát), PERK (1,95-krát), IRE1 (1,60-krát) a TRPC1 (1,53-krát) v porovnaní s kontrolnou skupinou.

4. Diskusia

V tejto štúdii sme prvýkrát navrhli, ako je ovplyvnené obličkové tkanivohypertyreózaz hľadiska úloh ER stresu a TRPC1 kanála v tomto procese. V našej štúdii zvýšená expresia TRPC1 spôsobila zvýšenie koncentrácie Ca2 plus v bunke, najmä zhrubnutie kapilárnej bazálnej membrány a zvýšenú expresiu GRP78 v tubuloch, najmä v glomeruloch. Myslíme si, že ER stres hrá aktívnu úlohu v tomto procese bunkového poškodenia, najmä prostredníctvom prevodníka signálu ATF6 a PERK v dráhe UPR (rozložená proteínová odpoveď).

Ako je vidieť v mnohých štúdiách, ako aj v našej štúdii [18], hodnoty fT3 a fT4 sa v prípade hypertyreózy zvyšujú, zatiaľ čo hladina TSH klesá. Akákoľvek dysfunkcia štítnej žľazy môže ovplyvniť produkciu fT3 a fT4, čo môže byť spojené s rôznymi patológiami v tele [21]. Theobličkyhrajú dôležitú úlohu pri vylučovaní odpadových produktov a toxínov, ako je močovina, kreatinín a kyselina močová. Posúdenie funkcie obličiek je dôležité pri liečbe pacientov s ochorením obličiek alebo patologickými stavmi ovplyvňujúcimi funkciu obličiek. Testy funkcie obličiek sú užitočné pri identifikácii prítomnosti ochorenia obličiek, monitorovaní odpovede obličiek na liečbu a určovaní progresie ochorenia obličiek. Hladiny kreatinínu v sére sa pri hypertyreóze znižujú nielen v dôsledku zvýšenia GFR, ale aj zvýšenej deštrukcie svalov. Taktiež pokles koncentrácie BUN vhypertyreózaPredpokladá sa, že je to spôsobené zníženou expresiou akvaporínu 1 a 2. Preto sa hladiny BUN a kreatinínu v mnohých štúdiách znížili [22] ako v našej štúdii. Za patologických podmienok môžu bunky stratiť proteostázu, čo vedie k akumulácii rozložených a nesprávne poskladaných proteínov v ER, čo spúšťa UPR alebo ER stres [23].

Obrázok 5. Imunohistochemické farbenie na TRPC1 v kontrolnej (1A-B) a hypertyroidnej (2A-B) skupine vobličkytkaniva. Expresia TRPC sa zvýšila v skupine s hypertyreózou v porovnaní s kontrolnou skupinou (šípky). Pruhy sú 50 µm. *Na rozdiel od kontrolnej skupiny (p < 0.000)="" bol="" vykonaný="" mann-whitney="" u="">

Obrázok 6. Imunohistochemické farbenie na GRP78 v kontrolnej (1A-B) a hypertyroidnej (2A-B) skupine vobličkytkaniva. Expresia GRP78 je zvýšená v skupine s hypertyreózou (šípky). Pruhy sú 50 µm. *Na rozdiel od kontrolnej skupiny (p < 0.000)="" bol="" vykonaný="" mann-whitney="" u="">

Obrázok 7. Imunohistochemické farbenie na ATF6 v kontrolnej (1A-B) a hypertyroidnej (2A-B) skupine vobličkytkaniva. Expresia ATF6 je zvýšená v skupine s hypertyreózou (šípky). Pruhy sú 50 µm. *Na rozdiel od kontrolnej skupiny (p < 0.000)="" bol="" vykonaný="" mann–whit="" ney="" u="">

Obrázok 8. Imunohistochemické farbenie na IRE1 v kontrolnej (1A-B) a hypertyroidnej (2A-B) skupine vobličkytkaniva. Expresia IRE1 je zvýšená v skupine s hypertyreózou (šípky). Pruhy sú 50 µm. *Na rozdiel od kontrolnej skupiny (p < 0.000)="" bol="" vykonaný="" mann-whitney="" u="">

Obrázok 9. Imunohistochemické farbenie na PERK v kontrolnej (1A-B) a hypertyroidnej (2A-B) skupine vobličkytkaniva. Expresia PERK je zvýšená v skupine s hypertyreózou (šípky). Pruhy sú 50 µm. *Na rozdiel od kontrolnej skupiny (p < 0.000)="" bol="" vykonaný="" mann-whitney="" u="">

Poruchy ER a cytosolickej Ca2 plus homeostázy sú spojené s mnohými chorobami, vrátaneobličky. Narušenie ER Ca2 plus homeostázy spúšťa UPR, čo zabraňuje ďalšej akumulácii novo syntetizovaných proteínov v ER. Ukazuje teda obranný mechanizmus prosurvival tým, že znižuje záťaž na ER [24].

Je známe, že rôzne faktory vyvolávajú stres a spúšťajú ERobličkyškody. Stres ER v obličkách môže spôsobiť diferenciáciu tubulárnych epiteliálnych buniek mezenchymálnym prechodom z epitelu, stratu renálnych tubulárnych epitelových buniek apoptózou a nakoniec renálnu patológiu vrátane straty nefrónov, čo znižuje filtračnú kapacitu obličky. V štúdii Dickhouta et al. sa preukázal ER stresom indukovaný epitelovo-mezenchymálny prechodový proces v bunkovej línii renálneho proximálneho tubulu HK-2 pre chronické ochorenie obličiek [25]. Okrem mnohých štúdií [9], ako je vidieť v našej štúdii,hypertyreózaspôsobilo zhrubnutie kapilárnej bazálnej membrány v glomerulu. Predpokladalo sa, že zvýšené zhrubnutie kapilárnej bazálnej membrány v glomerulách sa vytvorilo v dôsledku procesu epitelovo-mezenchymálneho prechodu v dôsledku zvýšenej expresie GRP78 a konvertorov stresu ER. Význam ER stresu sa ukázal u chronickýchobličkyochorenie v mnohých patologických stavoch. V modeli diabetu vyvolaného streptozotocínom u myší C57BL/6 sa vyvinul ER stres a ťažká nefropatia vyskytujúca sa v dvadsiatom druhom mesiaci bola spojená s reguláciou CHOP/GADD153, jednej zo zložiek apoptózy sprostredkovanej stresom ER [26 ]. U pacientov s nefrotickým syndrómom, IgA nefropatiou, primárnou mesangiálnou proliferatívnou glomerulonefritídou a membranóznou nefropatiou, vrátane minimálne symptomatických pacientov, boli imunohistochemické expresie GRP78 a molekuly chaperónu indukovateľného endoplazmatického retikula (ER) kyslíkom regulovaného proteínu 150 (ORP150) zvýšené v porovnaní s kontrolami. Expresia CHOP/GADD153 bola tiež zvýšená a jadrová lokalizácia bola pozorovaná v epiteli proximálnych tubulov u nefrotických pacientov. V ľudských obličkových bunkách vystavených vysokým hladinám sérového albumínu bola pozorovaná indukcia ER stresu a ukázalo sa, že spôsobuje apoptózu prostredníctvom CHOP/GADD153 dráhy [25]. Tubulointersticiálna ER stresová odpoveď bola zistená pri glomerulárnych ochoreniach s apoptózou tubulárnych buniek spojenou s puromycínovou aminonukleozidovou nefrózou, preťažením proteínmi a proteinúriou spojenou s experimentálnou alebo ľudskou diabetickou nefropatiou [27]. Lorz a kol. uviedli, že paracetamol, analgetikum a antipyretikum, spôsobuje renálne tubulárne poškodenie a apoptózu v dôsledku ER stresu [28]. Paracetamol indukuje ER stresovú reakciu vrátane indukcie CHOP a štiepenia kaspázy-12. Nadmerná akumulácia sekrečných proteínov vyvoláva ER stres, čo spôsobuje poškodenie podocytov [29]. Útok komplementu tiež indukuje ER stres a aktivuje PERK dráhu vedúcu k poškodeniu glomerulárnych epitelových buniek. Všetky tieto zistenia ukazujú, že stres ER je jednou z hlavných príčin poškodenia obličiek a stresová reakcia ER je obranným mechanizmom protiobličkypoškodenie [30]. V našej štúdii si myslíme, že hypertyreóza vyvolaná tyroxínom v dávke 12 mg/l spôsobuje ER stres v obličkovom tkanive a poškodenie spôsobenéhypertyreózav obličkovom tkanive súvisí s reguláciou najmä ATF6 a PERK.

Prvý klonovaný cicavčí kanál TRP, iónový kanál TRPC1, sa nachádza v bunke v ER, plazmatickej membráne, intracelulárnych vezikulách a primárnych riasinkách. Vyjadruje sa takmer všade v tkanivách ľudí a hlodavcov. TRPC1 interaguje s rôznymi proteínovými skupinami, vrátane podjednotiek iónových kanálov, receptorov a cytosolických proteínov, aby sprostredkoval svoj účinok na Ca2 plus signál. Pôsobí ako neselektívny katiónový kanál v dráhach, ktoré riadia tok Ca2 plus v reakcii na aktiváciu receptora bunkového povrchu. Prostredníctvom tejto funkcie sú dostupné aj proliferácia, prežívanie, diferenciácia, sekrécia a migrácia buniek, ako aj znaky, ako sú neurónové rastové kužele a myoblastová fúzia funkcií špecifických pre chemotropné bunky [12].

Existuje mnoho štúdií o zmene expresie TRPC1 v mnohých patologických stavoch spôsobujúcich stres ER. Sukumaran a kol. ukázali, že existuje korelácia medzi stresom ER a expresiou TRPC1, ktorá by mohla zmeniť prežitie buniek v slinnej žľaze. Vyjadrili, že expresia TRPC1 sa znížila v podmienkach stresu ER a tiež bunková smrť v dôsledku stresu ER bola závislá od expresie CHOP. Bol pozorovaný zvýšený ER stres a infiltrácia v bunkách slinných žliaz TRPC1-/- knock-out myší [16].

Obrázok 10obličkyHladiny expresie proteínov GRP78, ATF6, TRPC1, IRE1 a PERK a graf násobnej zmeny. Nárast všetkých proteínov bol štatisticky významný (*p < 0,05),="" vykonal="" sa="" nezávislý="" t-test="">

Kedyobličkyz modelov diabetických potkanov sa zistilo, že expresia TRPC1 mRNA bola znížená [31]. U pacientov s diabetickou nefropatiou alebo u diabetických potkanov Zucker v porovnaní s kontrolami znížená expresia TRPC1 naznačovala, že TRPC1 ovplyvnil rozvoj diabetickej nefropatie [32]. TRPC1 hrá dôležitú úlohu pri udržiavaní ER Ca2 plus homeostázy a znížená funkcia vedie k predĺženej aktivácii dráhy UPR a narúša aktiváciu AKT, čo potom vedie k neurodegenerácii. Zníženie expresie TRPC1 bolo pozorované v modeli myši s Parkinsonovou chorobou vyvolanou neurotoxínom. Zvýšená expresia TRPC1 zvyšuje prežitie neurónov reguláciou dráhy AKT/mTOR, napriek stresu ER a UPR spôsobeným neurotoxínom [33]. Li a spol. uviedli, že expresia TRPC1 bola tiež zvýšená pri hypertrofii kardiomyocytov indukovanej namptínom v závislosti od času. Keď bol gén TRPC1 umlčaný, viedlo to k inhibícii srdcovej hypertrofie indukovanej nikotínamid-fosforibozyltransferázou. Nadmernou expresiou TRPC1 sa však predpokladalo, že nikotínamid fosforibozyltransferáza indukuje hypertrofiu kardiomyocytov dráhou vyvolanou stresom ER. Z tohto hľadiska môže umlčanie génu TRPC1 zohrávať ochrannú úlohu v prevencii srdcovej hypertrofie [34]. V našej štúdii sa výrazne zvýšil aj stres ER a TRPC1. To naznačuje, že zhrubnutie kapilárnej bazálnej membrány spôsobené zvýšeným stresom ER v obličkovom tkanive v dôsledkuhypertyreózaje spôsobená zvýšenou expresiou TRPC1.

Táto štúdia má určité obmedzenia. Namiesto potkanieho modelu hypertyreózy vyvolaného tyroxínom sa mohli použiť geneticky modifikované myši. S močom odoberaným pomocou metabolických klietok, niektoréobličkyfunkčné testy sa mohli merať aj v moči. Zmena úrovne stresu ER by sa mohla skúmať pomocou inhibítora TRPC1.

Ako výsledok nášho prehľadu literatúry sa v tejto štúdii prvýkrát preukázal účinok hypertyreózy na vzťah medzi stresom ER a kanálom TRPC1 v obličkovom tkanive. To bolo určenéhypertyreózaspôsobilo zvýšenie expresie TRPC1, ktoré indukuje ER stres. Navrhujeme, že zníženie expresie TRPC1 môže byť potenciálnou terapeutickou stratégiou pre hypertyreózou indukovanúobličkya možno aj poškodenie iných orgánov.

Referencie

1. Kim D, Kim W, Joo SK, Bae JM, Kim JH a kol. Subklinická hypotyreóza a nízka normálna funkcia štítnej žľazy sú spojené s nealkoholickou steatohepatitídou a fibrózou. Klinická gastroenterológia a hepatológia 2018; 16 (1): 123-131. DOI: 10.1016/j.cgh.2017.08.014

2. Bolkiny Y, Toulson E, El-Atrsh A, Akela M, Farg E. Extrakt z koreňa Costus zmierňuje krvné biochemické poruchy experimentálne vyvolaných hypo- ahypertyreózau myší. Ročný výskum a prehľad v biológii 2019; 31 (5): 1-10. DOI: 10.9734/arb/2019/v31i530063

3. Sakr S, Abdel-Ghafar FR, Abo-El-Yazid SM. Selén zlepšuje karbimazolom indukovanú hepatotoxicitu a oxidačný stres u potkanov albínov. Journal Coastal Life Medicine 2015; 3 (2): 930-936. DOI: 10.1016/j.jtemb.2010.07.002

4. Vargas F, Moreno JM, Rodríguez-Gómez I, Wangensteen R, Osuna A a kol. Cievne a renálne funkcie pri experimentálnych poruchách štítnej žľazy. European Journal of Endocrinology 2006; 154 (2): 197-212. DOI: 10.1530/tee.1.02093

5. Rhee CM. Interakcia medzi štítnou žľazou aobličkychoroba: prehľad dôkazov. Aktuálny názor v endokrinológii 2016; 23 (5): 407-415. DOI: 10.1097/Med.0000000000000275

6. Wijkhuisen A, Djouadi F, Vilar J, Merlet-Benichou C, Bastin J. Hormóny štítnej žľazy regulujú vývoj enzýmov energetického metabolizmu v proximálnom stočenom tubule potkanov. American Journal of Physiology - Renal Physiology 1995; 268 (4): 634-642. DOI: 10.1152/ajprenal.1995.268.4.F634

7. Baum M, Dwarakanath V, Alpern RJ, Moe OW. Účinky hormónu štítnej žľazy na neonatálny renálny kortikálny Na plus / H plus antiporter. Kidney International 1998; 53 (5): 1254-1258. DOI: 10.1046/j.1523-1755.1998.00879.x

8. Alcalde AI, Sarasa M, Raldúa D, Aramayona J, Morales R a kol. Úloha hormónu štítnej žľazy pri regulácii renálneho transportu fosfátov u mladých a starých potkanov. Endokrinológia 1999; 140 (4): 1544-1551. DOI: 10.1210/endo.140.4.6658

9. Iglesias P, Bajo MA, Selgas R, Díez JJ. Dysfunkcia štítnej žľazy a ochorenie obličiek: aktualizácia. Recenzie v endokrinných a metabolických poruchách 2017; 18 (1): 131-144. DOI:

10 1007/s11154-016-9395-710. Selvaraj S, Watt JA, Singh BB. TRPC1 inhibuje apoptotickú bunkovú degeneráciu indukovanú dopaminergným neurotoxínom MPTP/MPP plus. Cell Calcium 2009; 46 (3): 209-218. DOI: 10.1016/j.ceca.2009.07.008

11. Goda Y, Südhof TC. Regulácia uvoľňovania neurotransmiterov vápnikom: spoľahlivo nespoľahlivá? Current Opinion in Cell Biology 1997; 9 (4): 513-518. DOI: 10,1016/s0955-0674(97)80027-0

12. Sukumaran P, Schaar A, Sun Y, Singh BB. Funkčná úloha kanálov TRP pri modulácii stresu ER a autofágie. Cell Calcium 2016; 60 (2): 123-132. DOI: 10.1016/j.ceca.2016.02.012

13. Goel M, Sinkins WG, Zuo CD, Estacion M, Schilling WP. Identifikácia a lokalizácia TRPC kanálov u potkanovobličky. American Journal of Physiology-Fysiology Renal 2006; 290 (5): 1241-1252. DOI: 10.1152/ajprenal.00376.2005

14. Chubanov V, Kubánek S, Fiedler S, Mittermeier L, Gudermann T et al. Renálne funkcie TRP kanálov v zdraví a chorobe. In: Emir TLR (redaktor). Neurobiológia TRP kanálov. 1. vyd. Boca Raton, Florida, USA: CRC Press/Taylor & Francis; 2017. s. 187-212.

15. Jeschke MG, Gauglitz GG, Song J, Kulp GA, Finnerty CC a kol. Vápnik a stres ER sprostredkúvajú apoptózu pečene po popálenine. Journal of Cellular and Molecular Medicine 2009; 13 (8b): 1857-1865. DOI: 10.1111/j.1582-4934.2009.00644.x

16. Sukumaran P, Sun Y, Zangbede FQ, Nascimento da Conceicao V, Mishra B a kol. Expresia a funkcia TRPC1 inhibujú ER stres a bunkovú smrť v bunkách slinných žliaz. FASEB BioAdvanc es 2019; 1 (1): 40-50. DOI: 10.1096/fab.1021

17. Zhao Y, Yan Y, Zhao Z, Li S, Yin J. Dynamické zmeny markerov stresovej dráhy endoplazmatického retikula GRP78 a CHOP v hipokampe diabetických myší. Bulletin výskumu mozgu 2015; 111: 27-35. DOI: 10.1016/j.brainresbull.2014.12.00618. Araujo A, Schenkel P, Enzveiler A, Fernandes T, Partita W a kol. Úloha redoxnej signalizácie pri srdcovej hypertrofii vyvolanej experimentálnehypertyreóza. Journal of Molecular Endocrinology 2008; 41 (6): 423-430. DOI: 10.1677/JME-08-002419. Wang Z, do Carmo JM, Aberdein N, Zhou X, Williams JM a kol. Synergická interakcia hypertenzie a cukrovky pri podpore poškodenia obličiek a úloha stresu endoplazmatického retikula. Hypertenzia 2017; 69 (5): 879-891. DOI: 10.1161/hyper tensionaha.116.08560

20. Zhang LY, Zhang YQ, Zeng YZ, Zhu JL, Chen H a kol. TRPC1 inhibuje proliferáciu a migráciu rakoviny prsníka s pozitívnym estrogénovým receptorom a poskytuje lepšiu prognózu inhibíciou dráhy PI3K/AKT. Výskum a liečba rakoviny prsníka 2020; 182 (1): 21-33. DOI: 10,1007/s10549-020-05673-8

21. Aldubayan MA. Proantokyanidín z hroznových semien zmierňuje oxidačný stres a apoptózu v pečeni hypertyreóznych myší. Annual Research & Review in Biology 2019: 1-11. DOI: 10.9734/arb/2019/v33i630138

22. Sonmez E, Bulur O, Ertugrul DT, Sahin K, Beyan E a kol.Hypertyreózaovplyvňuje funkciu obličiek. Endokrinné 2019; 65 (1): 144-148. DOI: 10,1007/s12020-019-01903-2

23. Yan M, Shu S, Guo C, Tang C, Dong Z. Stres endoplazmatického retikula pri ischemickej a nefrotoxickej akút.obličkyzranenie. Annals of Medicine 2018; 50 (5): 381-390. DOI: 10.1080/07853890.2018.1489142

24. Bezprozvanny I, poslanec Mattson. Nesprávne zaobchádzanie s vápnikom v neurónoch a patogenéza Alzheimerovej choroby. Trendy v neurovedách 2008; 31 (9): 454-463. DOI: 10.1016/j.tins.2008.06.005

25. Dickhout JG, Carlisle RE, Austin RC. Vzájomný vzťah medzi srdcovou hypertrofiou, srdcovým zlyhaním a chronickým ochorením obličiek: stres endoplazmatického retikula ako mediátor patogenézy. Výskum cirkulácie 2011; 108 (5): 629-642. DOI: 10.1161/circresaha.110.226803

26. Wu J, Zhang R, Torreggiani M, Ting A, Xiong H a kol. Indukcia diabetu u starých myší C57B6 má za následok ťažkú ​​nefropatiu: spojenie s oxidačným stresom, stresom endoplazmatického retikula a zápalom. The American Journal of Pathology 2010; 176 (5): 2163-2176. DOI: 10.2353/ajpath.2010.090386

27. Cybulský AV. Stres endoplazmatického retikula pri proteinurickej chorobe obličiek.ObličkyInternational 2010; 77 (3): 187-193. DOI: 10.1038/ki.2009.389

28. Lorz C, Justo P, Sanz A, Subirá D, Egido J a kol. Paracetamolom indukované renálne tubulárne poškodenie: úloha pre ER stres. Journal of the American Society of Nephrology 2004; 15 (2): 380-389. DOI: 10.1097/01.asn.0000111289.91206.b0

29. Inagi R, Nangaku M, Onogi H, Ueyama H, Kitao Y a kol. Zapojenie stresu endoplazmatického retikula (ER) do poškodenia podocytov vyvolaného nadmernou akumuláciou proteínov.ObličkyInternational 2005; 68 (6): 2639-2650. DOI: 10.1111/j.1523-1755.2005.00736.x

30. Yoshida H. ER stres a choroby. The FEBS Journal 2007; 274 (3): 630-658. DOI: 10.1111/j.1742-4658.2007.05639.x

31. Nesin V, Tsiokas L. TRPC1. In: Nilius B, Flockerzi V (editori). Katiónové kanály cicavčieho prechodného receptorového potenciálu (TRP). 24. vyd. Berlín, Heidelberg, Nemecko: Springer; 2014. s. 15-51.

32. He F, Peng F, Xia X, Zhao C, Luo Q a kol. MiR-135a podporuje renálnu fibrózu pri diabetickej nefropatii reguláciou TRPC1. Diabetológia 2014; 57 (8): 1726-1736. DOI: 10,1007/s00125-014-3282-0

33. Selvaraj S, Sun Y, Watt JA, Wang S, Lei S a kol. Neurotoxínom indukovaný ER stres v myších dopamínergných neurónoch zahŕňa downreguláciu TRPC1 a inhibíciu signalizácie AKT / mTOR. The Journal of Clinical Investigation 2012; 122 (4): 1354-1367. DOI: 10.1172/JCI61332

34. Li J, Wu W, Zhao M, Liu X. Zapojenie TRPC1 do hypertrofie kardiomyocytov indukovanej Nampt prostredníctvom aktivácie stresu ER. Bunková a molekulárna biológia 2017; 63 (4): 33-37. DOI: 10.14715/CMB/2017.63.4.6