Iridoidné a acyklické monoterpénové glykozidy, kankanosidy L, M, N, O a P z Cistanche Tubulosa
Mar 06, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) je trváca parazitická rastlina rastúca na koreňoch druhov Salvadora alebo Calotropis, rozšírená v severnej Afrike, Arábii a ázijských krajinách.1) Stonky tejto rastliny (japonsky Kanka-nikujuyou) boli tradične používa sa na liečbu impotencie, sterility, bedrového kĺbu a slabosti tela, ako aj ako prostriedok podporujúci krvný obeh.1,2) V priebehu našich štúdií o bioaktívnych zložkách zo stoniek Cistanche tubulosa,3–6) sme predtým informovali dvadsaťštyri fenyletanoidových aminoglykozidov vrátane kankanozidov H1, H2, I, J1, J2, K1 a K2 a dva acylované oligocukry z čerstvých stoniek Cistanchetubulosa.5,6)fenyletanoidové glykozidy,echinakozid, akteozid,a izoakteozidzistilo sa, že inhibujú zvýšenie hladín sérovej aspartátaminotransferázy (sAST) a alanínaminotransferázy (sALT) v poranenej pečeni myší vyvolané D-galaktozamínom (D-GalN)/lipopolysacharidom v dávkach 25-100 mg/kg per os ( po). Boli tiež objasnené štrukturálne požiadavky fenyletanoidných glykozidov na hepatoprotektívnu aktivitu.5) V tejto pokračujúcej štúdii o zložkách v čerstvých stonkách Cistanchetubulosa sme ďalej izolovali jedenásť iridoidných glykozidov vrátane kankanozidov L (1), M (2), a N (3), sedem acyklických monoterpénových glykozidov vrátane kankanozidov O (4) a P (5), tri fenylpropanoidy a štyri lignany. Tento článok sa zaoberá izoláciou a objasnením štruktúry piatich nových zlúčenín (1-5).
Čerstvé stonky C. tubulosa (pestované v Urumuqi, provincia Xin jiang, Čína) sa extrahovali metanolom pod spätným chladičom, čím sa získal metanolický extrakt (8,36 percent z čerstvých stoniek). Z metanolového extraktu sa frakcie eluované H2O a MeOH (5,63 percent a 2,73 percent, v uvedenom poradí) získali stĺpcovou chromatografiou Diaion HP-20 (H20—>MeOH), ako bolo opísané vyššie.5) Frakcia eluovaná MeOH bola podrobili SiO2 a ODS kolónovej chromatografii a nakoniec HPLC poskytli kankanosidy L (1, 0.0026 percent ), M (2, 0.{{{101} 27}}001 percento ), N (3, 0.00{{60}}7 percent ) , O (4, 0.{75}}{{90}}2{{105}} percent) a P (5, {{118} }.{122}}002 percentá ), 6-deoxykatalpol3,7) (6, 0,197 percent ), bartsioside3,7) (7, 0.0583 percent ), glurozid3,7) (8, 0,0443 percent ), kankanoizid A3) (9, 22,3 mg, 0,0010 percent ), kyselina mussaenozidová3,7) (10, 0,0056 percenta), 8- kyselina epilogánová3,8) (11, 0,0023 percenta), 8-kyselina epideoxylogánová3,7) (12, 0,0004 percenta), kyselina geniposidová3,7) (13, 0,0040 percent ), kankanozid E3) (14, 0,0026 percent ), (2E, 6Z)-8-b D-glukopyranozyloxy-2,6-dimetyl-2,6-kyselina oktadiénová3,9) (15, 31,0 mg, 0,0014 percenta), (2E,6E){{95 }},7-dimetyl-8-hydroxyoktadién-1-yl-ObD-glukopyranozid10) (16, 0,0082 percenta), 8-hydroxygeraniol 8-Ob-D-glukopyranozid11 ) (17, 0,0044 percenta), betulalbuzid A12) (18, 0,0004 percenta), ihličnan13) (19, 0,0002 percenta), syringín13) (20, 0,0015 percenta), sinapový (0,0015 percenta) aldehyd 4-2pyranoside,14-glukozid 0,0001 percenta), ( )-pinorezinol ObD-glukopyranozid4,8,15) (22, 0,0010 percenta), eucommin A16) (23, 0,0002 percenta), izoeukommin A17) (24, 0,0010 percent)-resolsyD) a (ObringsyD) glukopyra noside4,8,18) (25, 0,0044 percent).
Cistanche tubulosazlepšiť sexuálne funkcie
Štruktúry kankanozidov L (1), M (2) a N (3)
Kankanosid L (1) sa získal ako biely prášok s negatívnou optickou rotáciou ([a]D26 45,7 v MeOH). Jeho IR spektrum ukázalo silný absorpčný pás pri 3433 a 1{{20}}}80 cm1, čo naznačuje glykozidovú skupinu. Bombardovanie rýchlymi atómami (FAB)-MS 1 cyklu v pozitívnom a negatívnom iónovom móde ukázalo kvázimolekulárne iónové píky pri m/z 371 [M Na] a 347 [MH], v danom poradí, a molekulový vzorec bol určený ako C15H24O9 meraním FAB-MS s vysokým rozlíšením. Kyslá hydrolýza 1 s 1,0 M kyselinou chlorovodíkovou (HCl) uvoľnila D-glukózu, ktorá bola identifikovaná HPLC analýzou s použitím optického rotačného detektora.3-6)1H- a 13C-NMR spektrá 1 (CD3OD, tabuľky 1 2), ktoré boli priradené rôznymi NMR experimentmi,19) vykazovali signály ako signovateľné pre štyri metylény [d 1,43 (1H, br dd, J cca. 5, 13 Hz, 4a-H), 1,73 (1H, br dd, J cca 12, 14 Hz, 6a-H), 1,85 (1H, m, 4b-H), 1,93 (1H, br dd, J= cca 8,14 Hz, 6b-H), 3,50 ( 1H, ddd, J 2,4, 12,5, 13,0 Hz, 3a-H), 3,83 (1H, br dd, J=} cca 5,13 Hz, 3b-H), 3,78, 4,12 (1H každý, obidva d, J 13,1 Hz, 10-H2)], dva metíny [d 2,15 (1H, dd, J 7,2, 8,9 Hz, 9-H) a 2,23 (1H, m, 5- H)] a acetálová skupina [d 4,81 (1H, d, J 8,9 Hz, 1-H)] spolu s b-glukopyranozylovou skupinou [d 4,70 (d, J 7,9 Hz, 1 -} H)]. Ako je znázornené na obr. 1, experiment 1H–1H korelačnej spektroskopie (1H–1H COSY) na 1 naznačil prítomnosť čiastkových štruktúr napísaných tučnými čiarami. V experimente heteronukleárnej korelácie s viacerými väzbami (HMBC) na 1 boli pozorované korelácie s dlhým dosahom medzi nasledujúcimi protónmi a uhlíkmi (1-}H a 3-C, 8-C; {{ 124}}H a 1-C; 7-H a 8-C, 10-C; 9-H a 8-C; {{131 }}H2 a 7-C, 8-C; 1-H a 1-C), ako je znázornené na obr. 1. Ďalej bola relatívna stereoštruktúra 1 charakterizovaná fázovo citlivou jadrovou Experiment overhauserovej vylepšenej spektroskopie (fázovo citlivá NOESY), ktorý ukázal korelácie NOE medzi nasledujúcimi protónovými pármi (1-H a 3aH; 3a-H a 4a-H; 3b-H a 4b-H; 4b-H a 5-H, 9-H; 5- H a 6b-H, 9-H; 6a-H a 7-H; 7-H a 10-H2), ako je znázornené na obr. 1. 1H- a 13C-NMR spektrá 1 boli superponovateľné na spektrá hlavnej iridoidnej zložky 6-deoxykatalpolu (6), s výnimkou signálov spôsobených na nasýtený d-laktolový zvyšok. Nakoniec hydrogenáciou zlúčeniny 6 sa získala 1, takže stereoštruktúra kankanozidu L bola objasnená ako 3,4-dihydro-6-deoxykatalpol (1).
Kankanosid M (2) sa získal ako biely prášok s negatívnou optickou rotáciou ([a]D26 18,7 v MeOH). IR spektrum zlúčeniny 2 ukázalo absorpčné pásy pri 3433, 1736, 1655 a 10}76 cm1, ktoré možno pripísať hydroxylovým, d-laktónovým, olefínovým a éterovým skupinám. FAB-MS spektrum kladných iónov 2 ukázalo kvázimolekulárny iónový pík pri m/z 353 [M Na] a molekulový vzorec bol stanovený ako C15H22O8 meraním kladných iónov FAB-MS s vysokým rozlíšením. Kyslá hydrolýza zlúčeniny 2 s 1,0 M HCl uvoľňuje D-glukózu. 'H- a 13C NMR spektrá 2 (CD3OD, tabuľky 1, 2) ukázali signály priraditeľné štyrom metylénom [d 1,66, 2,11 (1H každý, oba m, 4-H2), 2,15, 2,75 (1H každý m, 6-H2), 4,29 (1H, ddd, J 2,8, 8,4, 14,3 Hz, 3b-H), 4,32, 4,51 (po 1H, obidva d, J 13,1 Hz, 10- H2), 4,35 (1H, ddd, J 3,1, 6,7, 14,3 Hz, 3a-H)], dva metíny [d 2,97 (1H, m, 5-H), 3,82 (1H, br s, {{ 84}}H)], olefín [d 5,94 (1H, m, 7-H)] a nasýtená laktónová skupina (d C 174,9) spolu s bD-glukopyranozylovou skupinou [d 4,32 (1H, d J=7,9 Hz, 1-H)]. Ako je znázornené na obrázku 1, experiment 1H–1H COSY na obrázku 2 naznačil prítomnosť čiastkových štruktúr napísaných tučnými čiarami a v experimente HMBC boli pozorované korelácie na veľké vzdialenosti medzi nasledujúcimi protónovými a uhlíkovými pármi ({{105 }}H a 1-C; 7-H a 9-C; 9-H a 1-C, 8-C; {{112} }H2 a 7-C, 8-C, 9-C; 1 -H a 10-C). Relatívna stereoštruktúra 2 bola charakterizovaná fázovo citlivým NOESY experimentom, ktorý ukázal NOE korelácie medzi nasledujúcimi protónovými pármi (3a-H a 4a-H; 3b-H a 4b-H; 4b-H a 5-} H, 5-H a 6b-H, 9-H), ako je znázornené na obr. 1. Stereoštruktúra zlúčeniny 2 bola teda objasnená, ako je znázornené.
Kankanosid N (3) sa izoloval ako biely prášok s negatívnou optickou rotáciou ([a]D25 24,6 v MeOH). V FAB-MS s pozitívnymi iónmi 3 sa pozoroval kvázimolekulárny pík iónov pri m/z 371 [M Na]. Molekulový vzorec C16H28O8 bol stanovený meraním FAB-MS s vysokým rozlíšením. Kyslá hydrolýza 3 s 1,{15}} M HCl uvoľňuje D-glukózu. 1H- a 13C-NMR dáta (CD3OD, tabuľky 1, 2) ukázali signály priraditeľné k metylu [d 1.07 (3H, d, J 7,2 Hz, 10-H3)] 4 metylény {d 1,37, 1,87 (po 1H, obidva m, 7-H2), 1,65, 1,81 (po 1H, obidva m, 6-H2), [3,65 (1H, dd, J 9,1 , 9,8 Hz), 3,90 (1H, dd, J 5,9, 9,8 Hz), 11-H2] a [3,70 (1H, dd, J 3,3, 12,0 Hz), 3,88 (1H, m), {{ 71}}H2]}, štyri metíny [d 1,69 (1H, m, 4-H), 1,75 (1H, m, 9-H), 2,06 (1H, m, 8-} H), 2,16 (1H, m, 5-H)] a hemiacetálová skupina [d 4,67 (1H, d, J 7,4 Hz, 1-H)] spolu s bD-glukopyranozylovou skupinou [ d 4,26 (1 H, d, J 7,9 Hz, 1-H)]. Iridoidná štruktúra 3 bola objasnená experimentmi 1H–1H COSY a HMBC a relatívna stereoštruktúra bola charakterizovaná fázovo citlivým NOESY experimentom, ako je znázornené na obr. 1. Následne bola objasnená sterostruktúra 3, ako je znázornené.
Štruktúry kankanozidov O (4) a P (5)
Kankanozidy O (4) a P (5), C16H2608, sa tiež získali ako biele prášky s negatívnymi optickými rotáciami (4: [a]D23 26,1; 5: [a]D21 32,7 oba v MeOH). IR spektrá 4 a 5 ukázali absorpčné pásy pri 3433, 1696, 1647 a 1076 cm1 pre 4 a pri 3434, 1701, 1647 a 1{{96} }76 cm1 pre 5, pripísateľnú glykozidickým, karboxylovým a olefínovým funkciám. Ich UV spektrá vykazovali spoločné absorpčné maximum pri 217 nm, čo naznačuje prítomnosť skupiny b-nenasýtenej karboxylovej kyseliny v oboch z nich. Kyslá hydrolýza 4 a 5 uvoľnila D-glukózu, zatiaľ čo enzymatickou hydrolýzou s b-glukozidázou 4 a 5 poskytli (2E,6E)-8-hydroxy-2,6-dimetyl{{39 }},{{40}}oktadecénová kyselina20) (4a) a (2E,6E)-8-hydroxy-3,7-dimetyl{{ 48}},6-kyselina oktadecénová21) (5a). 1H- a 13C-NMR údaje 4 (CD3OD, tabuľky 2, 3) ukázali signály priraditeľné dvom metylom [d 1,71 (3H, br s, 10-H3), 1,81 (3H, d, J 1,0 Hz , 9-H3)], tri metylény {d 2,19 (2H, br t, J asi 7 Hz, 5-H2), 2,36 (2H, m, 4-H2), [ 4,24 (1H, dd, J 7,6, 12,0 Hz), 4,33 (1H, dd, J 6,2, 12,0 Hz), 8-H2]} a dva trisubstituované olefíny [d 5,41 (1H, ddd, J 1,2, 6,2, 7,6 Hz, 7-H), 6,75 (1H, tq, J 7,2, 1,0 Hz, 3-H)] spolu s bD glukopyranozylovou časťou [d 4,34 (d, J 7,8 Hz, 1 -H)]. Porovnaním uhlíkových signálov v 13C-NMR spektre zlúčeniny 4 so signálmi zlúčeniny 4a sa pozoroval glykozylačný posun v polohe 8- (d C4: 65,5; 4a: 59,4). Poloha glukozidovej väzby bola tiež potvrdená experimentmi HMBC, ako je znázornené na obr. 2. Následne sa objasnila stereoštruktúra zlúčeniny 4 na (2E,6E)-8-bD-glukopyranozyloxy-2,{{ 143}}dimetyl-2,6-kyselina oktadecénová. Na druhej strane, 1H- a 13C-NMR dáta 5 (CD3OD, tabuľky 2, 3) indikovali prítomnosť (2E,6E)-8-hydroxy-3,{{158} }dimetyl-2,6-skupina kyseliny oktadecénovej [d 1,70 (3H, br s, 10-H3), 2,14 (3H, br s, 9-H3), 2,24 ( 2H, m, 4-H2), 2,27 (2H, m, 5-H2), 4,05, 4,20 (každý 1H, obidva br d, J asi 12 Hz, 8-H2) , 5,47 (1H, tq, J 7,1, 0,9 Hz, 6-H), 5,67 (1H, br s, 1-H)] spolu s bD-glukopyranozylovou časťou [d 4,23 (d, J 7,7 Hz, 1-H)]. Konektivita bD-glukopyranozylovej skupiny v 5 bola objasnená na základe experimentov HMBC, ako je znázornené na obr. 2. Okrem toho sa pozoroval typický glykozylačný posun pre signály v polohe 8- (d C5: 75,6; 5a: 68,8). Na základe vyššie uvedených dôkazov bola stereoštruktúra zlúčeniny 5 určená ako (2E,6E)-8-bD-glukopyranozyloxy-3,7-dimetyl-2,{ {230}}kyselina oktadiénová.
Účinky zložiek na cytotoxicitu indukovanú faktorom nekrózy nádorov-a (TNF-a) v bunkách L929
Je známe, že TNF-a sprostredkováva rôzne poranenia orgánov prostredníctvom indukcie bunkovej apoptózy. V prípade pečene sa biologické účinky TNF-a podieľajú na poškodení pečene vyvolanom hepatálnymi toxínmi, ischémiou/reperfúziou, vírusovou hepatitídou a alkoholom.22-24) Preto sa TNF-a považuje za dôležitý cieľom objaviť protizápalové a hepatoprotektívne látky. Na základe vyššie uvedeného konceptu sme skúmali ochranné zložky z prirodzene sa vyskytujúcich produktov na bunkovú smrť indukovanú TNF-a v bunkách L929, bunkovej línii citlivej na TNF-a.25) Predtým sme uviedli, že niekoľko zložiek z Zistilo sa, že Piper Chaba, 26-29) Boesenbergia rotunda, 30,31) Punica granatum, 32) Helichrysum arenarium, 33-35) a Sapindus rarak, 36-38) vykazujú inhibičné účinky TNF-a -indukovaná cytotoxicita v bunkách L929. Keďže fenyletanoidové zložky C. tubulosa (napr. echinakozid, akteozid a izoakteozid atď.) 5) tiež inhibovali túto cytotoxicitu, ďalej sme skúmali zložky iridoidu, fenylpropanoidu a lignanu, ako je uvedené v tabuľke 4. Výsledkom bolo, že kankanozid A (9, inhibícia: 16,3 2.0 percent pri 100 mM), kyselina mussaenozidová (10, 44,7 8,7 percenta), 8-kyselina epilogánová (11, 10,7 0,4 percenta), 8-hydroxygeraniol Zistilo sa, že 8-ObD-glukopyranozid (17, 21,3 ± 2,4 percenta) a ( )-pinorezinol ObD-glukopyranozid (22, 22,3 ± 1,6 percenta) vykazujú významnú aktivitu. Hoci ich aktivity boli slabšie ako aktivity echinakozidu (IC50 31,1 mM), akteozidu (17,8 mM) a izoaceteozidu (22,7 mM), základných fenyletanoidových zložiek.5)
Experimentálne
Na získanie spektrálnych a fyzikálnych údajov boli použité nasledujúce prístroje: špecifické rotácie, digitálny polarimeter Horiba SEPA-300 (l 5 cm); UV spektrá, Shimadzu UV-1600 spektrometer; IČ spektrá, spektrometer Shimadzu FTIR-8100; 'H- a 13C-NMR spektrá, JEOL JNM-ECA600 (600, 150 MHz) a JEOL JNM-ECS400 (400, 100 HMz) spektrometre s tetrametylsilánom ako vnútorným štandardom; FAB-MS a FAB-MS s vysokým rozlíšením, hmotnostný spektrometer JEOL JMS-SX 102A; HPLC detektor, Shimadzu RID-10A index lomu, Shimadzu SPD-10A UV–VIS a Shodex OR-2 optické rotačné detektory. Na analytické a preparatívne účely sa použili kolóny HPLC, Cosmosil 5C{25}}MS-II a pNAP (Nacalai Tesque Inc., 250 4,6 mm vnútorný priemer) a (250 20 mm vnútorný priemer).
Na chromatografiu sa použili nasledujúce experimentálne podmienky: stĺpcová chromatografia na silikagéli s normálnou fázou (CC), silikagél 60N (Kanto Chemical Co., Ltd., 63-210 mesh, sférický, neutrálny); silikagél s reverznou fázou CC, Diaion HP{5}} (Nippon Rensui) a Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd., 100-200 mesh); TLC s normálnou fázou, TLC platne vopred potiahnuté silikagélom 60F254 (Merck, 0,25 mm); TLC s reverznou fázou, TLC platne vopred potiahnuté silikagélom RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); HPTLC s reverznou fázou, vopred potiahnuté TLC platne so silikagélom RP-18 WF254S (Merck, 0,25 mm), detekcia sa dosiahla postriekaním 1 % Ce(SO4)2 – 10 % vodnou H2SO4, po čom nasledovalo zahrievanie .
Rastlinný materiál
Táto položka bola opísaná v predchádzajúcej správe.
Extrakcia a izolácia
Čerstvé stonky C. tubulosa (2,98 kg) boli jemne narezané a extrahované trikrát metanolom pod refluxom počas 3 hodín. Odparenie rozpúšťadla za zníženého tlaku poskytlo metanolový extrakt (249,1 g, 8,36 %). Metanolový extrakt sa podrobil Diaion HP-20 CC (5,{9}} kg, H20—>MeOH), čím sa získali frakcie eluované H20 a MeOH (167,84 g, 5,63 percent a 81,21 g, 2,73 percent, v uvedenom poradí). Frakcia eluovaná MeOH (61,{24}} g) sa podrobila normálnej fáze silikagélu CC [1,8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15 : 3 : 0,4→1{{ 36}} : 3 : 0 ,5->6 : 4 : 1, obj./obj./obj.)-MeOH], čím sa získa sedem frakcií [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0,89 g), 4 (10,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) a 7 (4,6{{104}}g)], ako bolo opísané vyššie.5) Frakcia 1 (1,12 g) sa oddelila na silikagéli s reverznou fázou CC [55 g, MeOH–H2O (4 0 : 60, obj./obj.)→MeOH], čím sa získa päť frakcií [Fr. 1-1 (132,8 mg), 1-2 (267.0 mg), 1-3 (182,8 mg), {{80}} (31{{ 156}},9 mg) a 1-5 (91,4 mg)]. Frakcia 1-1 (132,8 mg) sa ďalej purifikovala pomocou HPLC [Cosmosil 5C{{9{{16{161}}}}}}MS-II, CH3CN – 1 % vodný AcOH (1{166} } : 90, v/v)], čím sa získa kankanozid M (2, 2,8 mg, 0.{{203}}{{22{{24{{248 }}}}}}01 percento ), bartsiozid (7, 5,2 mg, 0.0002 percentá ), sinapový aldehyd {{1{{295 }}6}}O-bD-glukopyranozid (21, 1,4 mg, {{3{{3{{3{{310}}9}}5}}{{320} }}}.{331}}001 percento). Frakcia 1-2 (267.{{350}} mg) sa ďalej purifikovala pomocou HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vodný AcOH (7 : 93, v/v)], čím sa získa (2E,6E)-3,7-dimetyl-8-hydroxyoktadién{{13{{360}}}}yl-O-bD -glukopyranozid (16, 15,8 mg, {{370}}.{{406}}007 percent), 8-hydroxygeraniol 8-ObD glukopyranozid (17, 5,2 mg, 0,0002 percent), ( )-pinorezinol ObD-glukopyra nozid (22, 22,0 mg, 0,0010 percent), eucommin A (23, 5,0 mg, 0,0002 percent), commin isoe02 percent (24, 21,3 mg, 0,0010 percent) a ( )-syringaresinol ObD-glukopy ranozid (25, 98,0 mg, 0,0044 percent). Frakcia 2 (9,56 g) sa oddelila pomocou reverznej fázy silikagélu CC [400 g, MeOH-H20 (10 : 90, obj./obj.) -MeOH -> acetón], čím sa získalo päť frakcií [Fr. 2-1 (55,9 mg), 2-2 (4,48 g), 2-3 (3,42 g), 2-4 (1,16 g) a 2-5 (31,9 mg) ], ako bolo opísané vyššie.5) Frakcia 2-2 (500,0 mg) sa podrobila HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vodný AcOH (5 : 95, obj./obj. )], čím sa získa kankanosid L (1, 6,6 mg, 0,0026 percenta) a 6-deoxykatalpol (6, 455,5 mg, 0,182 percenta). Frakcia 2-3 (1,00 g) sa podrobila HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vodný AcOH (7 : 93, obj./obj.)], čím sa získalo sedem frakcií [Fr . 2-3-1 (66,5 mg), 2-3-2 (20,4 mg), 2-3-3 (26,0 mg), 2-3-4 (136,6 mg), 2-3-5 [ 7 (380,6 mg) , 0,0581 percenta)], 2-3-6 [ glurozid (8, 285,1 mg, 0,0435 percent)] a 2-3-7 (84,9 mg)]. Frakcia 2-3-4 (106,6 mg) sa ďalej purifikovala pomocou HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN – 1 % vodný AcOH (5:95, obj./obj.)], čím sa získala zlúčenina 6 (68,4 mg, 0,0134 percenta) spolu so salidrozidom5) (13,7 mg, 0,0027 percenta). Frakcia 2-4 (1,16 g) sa podrobila HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vodný AcOH (15 : 85, obj./obj.) a Cosmosil pNAP, CH3CN – 1 % vodný AcOH (10 : 90 alebo 15 : 85, obj./obj.)], čím sa získajú kankanosidy N (3, 15,6 mg, 0,0007 percent), O (4, 44,1 mg, 0,0020 percent) a P (5, 4,2 mg, 0,0002 percent), 6 (24,0 mg, 0,0011 percent), 8 (17,7 mg, 0,0008 percent), kankanoizid A (9, 22,3 mg, 0,0010 percent), 8-epideoxylogánová kyselina (12, 8,1 mg, 0,0004 percent), kankanozid E (14, 58,1 mg, 0,0026 percenta), (2E,6Z)-8-bD-glukopy ranozyloxy-2,6-dimetyl-2,6-oktadiénová kyselina (15, 31,0 mg, 0,0014 percenta), 16 (168,6 mg, 0,0075 percenta), 17 (94,3 mg, 0,0042 percenta), betulalbusid A (18, 8,1 mg, 0,0004 percenta), 2,0004 percenta koniferínu (819,09 mg) a syringín (20, 33,9 mg, 0,0015 percent). Frakcia 4 (10,69 g) sa oddelila pomocou reverznej fázy silikagélu CC [500 g, MeOH-H20 (30 : 70, obj./obj.) -MeOH -> acetón], čím sa získali štyri frakcie [Fr. 4-1 (878,2 mg), 4-2 (7,06 g), 4-3 (1,57 g) a 4-4 (792,8 mg)], ako bolo opísané vyššie.5) frakcia 4-1 (500,0 mg) sa purifikovala pomocou HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vodný AcOH (10 : 90, obj./obj.)], čím sa získala kyselina mussaenozidová (10, 39,1 mg, 0,0031 percenta) a kyselina geniposidová (13, 51,2 mg, 0,0040 percenta). Frakcia 5 (8,84 g) sa oddelila pomocou reverznej fázy silikagélu CC [400 g, MeOH-H20 (20 : 80 —» 30 : 70, obj./obj.) —» MeOH —» acetón], čím sa získalo sedem frakcií [Fr. 5-1 (870,2 mg), 5-2 (478,9 mg), 5-3 (3,72 g), 5-4 (979,9 mg), 5-5 (1,19 g), 5-6 (1,27 g) a 5-7 (130,1 mg)], ako bolo opísané vyššie.5) Frakcia 5-1 (870,2 mg) sa ďalej purifikovala pomocou HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN -1 percentný vodný AcOH (5 : 95, obj./obj.)], čím sa získa 10 (55,3 mg, 0,0025 percenta) a kyselina 8-epiloganová (11, 51,5 mg, 0,0023 percenta).
Kankanosid L (1): biely prášok, [a]D26 45,7 (c 0,48, MeOH). FAB-MS s kladným iónom s vysokým rozlíšením: Vypočítané pre C15H24O9Na [M Na] 371,1318; Nájdené 371,1309. IR (KBr, cm1): 3433, 2928, 1080. 'H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: uvedené v tabuľke 1. 13C-NMR (150 MHz, CD30D) dC: uvedené v tabuľke 2. Pozitívne- ión FAB-MS m/z: 371 [M Na]. Negatívny ión FAB-MS m/z: 347 [MH].
Kankanosid M (2): biely prášok, [a]D26 18,7 (c 0,11, MeOH). FAB-MS s kladným iónom s vysokým rozlíšením: Vypočítané pre C15H2208Na [M Na] 353,1212; Nájdené 353,1208. IR (KBr, cm1): 3433, 2924, 1736, 1655, 1076. 'H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: uvedené v tabuľke 1. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) dC: uvedené v tabuľke 2. Pozitívny ión FAB-MS m/z: 353 [M Na].
Kankanosid N (3): biely prášok, [a]D25 24,6 (c 1.00, MeOH). FAB-MS s kladným iónom s vysokým rozlíšením: Vypočítané pre C16H2808Na [M Na] 371,1682; Nájdené 371,1686. IR (KBr, cm1): 3415, 2874, 1076, 1028.1H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: uvedené v tabuľke 1. 13C-NMR (150 MHz, CD30D) dC: uvedené v tabuľke 2. Pozitívny ión FAB-MS m/z: 371 [M Na].
Kankanosid O (4): biely prášok, [a]D23 26,1 (c 2,30, MeOH). FAB-MS s kladným iónom s vysokým rozlíšením: Vypočítané pre C16H2608Na [M Na] 369,1525; Nájdené 369,1528. UV [lmax (loge), MeOH, nm]: 217 (4,04). IR (KBr, cm1): 3433, 2926, 1696, 1647, 1076.1H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: uvedené v tabuľke 3. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) dC: uvedené v tabuľke 2. Pozitívny ión FAB-MS m/z: 369 [M Na].
Kankanosid P (5): biely prášok, [a]D21 32,7 (c 0,18, MeOH). FAB-MS s kladným iónom s vysokým rozlíšením: Vypočítané pre C16H2608Na [M Na] 369,1525; Nájdené 369,1520. UV [lmax (loge), MeOH, nm]: 217 (4,08). IR (KBr, cm1): 3434, 2926, 1701, 1647, 1076.1H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: uvedené v tabuľke 3. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) dC: uvedené v tabuľke 2. Pozitívny ión FAB-MS m/z: 369 [M Na].
Kyslá hydrolýza kankanozidov L-P (1-5): Roztoky 1-5 (každý 1,{5}} mg) v 1,0 M HCl (1, 0 ml) zahrievané na 80 stupňov počas 3 hodín. Po ochladení sa reakčná zmes neutralizovala Amberlitom IRA-400 (OH forma) a živice sa odstránili filtráciou. Po odstránení rozpúšťadla pri zníženom tlaku sa zvyšok oddelil na kolóne Sep-Pak C18 (H20—>MeOH). Frakcia eluovaná H20 bola podrobená HPLC analýze za nasledujúcich podmienok: HPLC kolóna, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm vnútorný priemer 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd., Tokio, Japonsko); detekcia, optická rotácia [Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd., Tokio, Japonsko); mobilná fáza, CH3CN-H20 (85:15, obj./obj.); druhá rýchlosť 0,8 ml/min]. Identifikácia D-glukózy prítomnej vo frakciách 1-5 eluovaných H2O sa uskutočnila porovnaním ich retenčných časov a optickej rotácie s retenčnými časmi autentickej vzorky [tR 17,9 min (pozitívne)].
Hydrogenácia {{0}}deoxykatalpolu (6) Suspenzia 6 (12.0 mg) a 10 percent paládia na uhlíku (50 mg) v MeOH (2,0 ml) sa miešal pri teplote miestnosti pod atmosférou H2 počas 2 hodín. Katalyzátor sa odfiltroval a filtrát sa kondenzoval za zníženého tlaku, čím sa získala zlúčenina 1 (12,0 mg, kvant.).
Enzymatická hydrolýza kankanozidov O (4) a P (5) s b-glukozidázou Do roztoku 4 (8.0 mg) v H2O (1,5 ml) sa pridala b-glukozidáza (4,7 mg, z mandľového, Oriental Yeast Co., Tokyo, Japonsko) a roztok sa miešal pri teplote 37 stupňov počas 24 hodín. Reakcia bola ukončená pridaním EtOH (5,{15}} ml), zmes bola kondenzovaná pri zníženom tlaku. Zvyšok sa extrahoval EtOAc a odparením rozpúšťadla sa získal (2E,6E)-8-hydroxy-2,{{20}}dimetyl-2,{{22} kyselina oktadecénová20) (4a, 3,9 mg, 92 percent). Podobným postupom sa získa (2E,6E)-8-hydroxy-3,7-dimetyl-2,6-kyselina oktadecénová21) (5a, 0,9 mg, 94 percent ) sa získal z kankanozidu P (5, 1,8 mg).
Metóda biologického testu Inhibičný účinok na cytotoxicitu indukovanú TNF-a v bunkách L929 sa testoval metódou opísanou v predchádzajúcom článku.5)
Štatistika Hodnoty sú vyjadrené ako priemer SEM Na štatistickú analýzu sa použila jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Dunnettov test. Hodnoty pravdepodobnosti (p) menšie ako 0,05 sa považovali za významné.
bylina cistanche
