ČasťⅡ: Izolácia nových diglykozidov substituovaných fenylpropanoidmi z Cistanche Salsa riadená dereplikáciou a ich inhibičná aktivita na produkciu NO v makrofágoch
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
3-metylbutenylová skupina, aglykónová subštruktúra, bola navrhnutá COZY koreláciami H-2 s H-1a a H-1b a HMBC koreláciami medzi H{{ 4}} a H-5 a olefínové uhlíky, pri 120,7 kC (C-2) a 136,4 (C-3). NMR spektrálnou analýzou a HPLC spektrálnou analýzou kyslého hydrolyzátu sa stanovili dve cukrové skupiny s MS fragmentom. Ich absolútna konfigurácia bola stanovená na D-glukózu a L-ramnózu pomocou HPLC analýzy kyslého hydrolyzátu [17]. Tieto cukrové skupiny boli definované ako -glukóza a a-ramnóza väzbovými konštantami anomérnych protónov. Spektrum 1H-1H COZY ukázalo sekvenčné korelácie od H-13 po H-63 a od H-133 po H-633 (obrázok 4).
Posunutý glukózový protón pri kH 4,70 (H-43) naznačuje acylový substituent na glukóze. Zo spektra HMBC korelácia medzi H-43 a C-9333 potvrdila polohu kofeoylového substituenta. HMBC korelácie medzi H-13 a C-1 (kC 64,5) a medzi H-33 (kH 3,68) a C-133 (kC 101,2) navrhli polohy každého substituenta . V súlade s tým bola štruktúra 6 určená ako 3-metylbutenyl-O- -L-ramnopyranozyl-(1→3)-4-0-(E)-kafeoyl- -D- glukózo-pyranozid a nazvaný cistansalzid B.
Cistansalside C (12), hnedý amorfný prášok, mal molekulový vzorec C26H38O13 pomocou (plus)-HR-ESI-QTOF-MS, ktorý vykazoval vrchol pri m/z 581,2213 [M plus Na] plus (vypočítané pre C26H38013Na, 581,2205). Charakteristický ión pri m/z 163 naznačuje, že v štruktúre existuje kofeoylový substituent. Fragmentové ióny pri m/z 325 a m/z 471 naznačujú existenciu ramnózovej jednotky a glukózovej jednotky.
Porovnanie NMR spektier zlúčeniny 12 so spektrom zlúčeniny 6 ukázalo, že sú podobné, s výnimkou aglykónovej štruktúry. V NMR spektrách 12 boli pozorované dva parafínové uhlíky pri kC 38.{4}} (C-2) a 24,4 (C-3) namiesto dvoch olefínových uhlíkov pri kC 12{{16 }}.7 (C-2) a 136,4 (C-3) v aglykóne 6. Zárodočné metylové skupiny (kH 0.88) v aglykóne 12 boli posunuté nahor relatívne k H-4 a H-5 (kH 1,71 a 1,63) v aglykóne 6 (tabuľka 2). Aglykón 12 bol navrhnutý ako 3-metylbutylová skupina, čo bolo potvrdené 1H a COSY NMR spektrami. Píky 3-metylbutylovej skupiny boli pozorované pri 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) a 0,88 (H-4, 5).
Dve cukrové skupiny boli znovu potvrdené HPLC analýzou kyslého hydrolyzátu a NMR spektrálnou analýzou, ako aj vzorom MS fragmentov. Absolútne konfigurácie cukrov boli identifikované ako D-glukóza a L-ramnóza pomocou HPLC analýzy kyslého hydrolyzátu [17]. A-glukózová skupina a a-ramnózová skupina boli potvrdené väzbovými konštantami anomérnych protónov. Spektrum 1H-1H COZY ukázalo sekvenčné korelácie od H-13 do H-53, od H-133 po H-333 a od H{{11} } až H-433 (obrázok 4).
Poloha substituentov bola potvrdená pomocou analýzy HMBC. V HMBC spektre sú korelácie medzi H-13 a C-1 (kC 67,2), medzi H-33 (kH 3,68) a C-133 (kC 101,2) a medzi Detegovali sa H-43 (kH 4,70) a C-9333 (kC 165,7). Následne sa zistilo, že štruktúra 12 je 3-metylbutyl-OaL-ramnopyranozyl-(1→3)-4-0-(E)-kafeoyl- -D-glukóza-pyranozid a s názvom cistansalside C.
Cistansalside D (17), amorfný hnedý prášok, sa zistilo, že má molekulový vzorec C31H38O14 pomocou pozitívneho módu s vysokým rozlíšením ESI-QTOF-MS, ktorý ukázal vrchol aduktových iónov pri m/z 657,2147 [M plus Na] plus (vypočítané pre C31H38014Na, 657,2154). Fragmentové ióny vrátane [M plus H x Aglykón x Rha x Acetyl Glc] plus ión pri m/z 147, [M plus H x Aglykón x Rha] plus ión pri m/z 351 a [M plus H x Aglykón] boli tiež detegované plus ión pri m/z 497. Charakteristický ión pri m/z 147 naznačuje, že v jeho štruktúre je prítomný kumaroylový substituent. Fragmentové ióny pri m/z 351 a m/z 497 naznačujú existenciu ramnózovej jednotky a acetylom substituovanej glukózovej jednotky.
Cistansalside zbylina cistanche
13C-NMR spektrum odhalilo prítomnosť 31 atómov uhlíka. V spektrách 1H a HSQC boli pozorované dva anomérne protóny pri kH 4,61 (1H, m, H-13) a 4,60 (1H, s, H{{10}}). . 1H-NMR spektrum indikovalo prítomnosť metylovej skupiny pri 1,97 (3H, s, acetyl-CH3), trans-olefínu pri kH 7,55 (1H, d, J=15,9 Hz, H{{ 25}}) a 6,34 (1H, d, J=15,9 Hz, H-8333) a dva para-substituované benzénové kruhy pri kH 7,53 (2H, d, J=6). 9 Hz, H-3333, 5333) a 6,79 (2H, d, J=6,9 Hz, H-2333, 6333)/kH 6,98 (2H, d, J {{5 0}},0 Hz, H-2, 6) a 6,65 (2H, d, J=8,0 Hz, H-3, 5) (tabuľka 2) . Z HMBC NMR spektra sú korelácie medzi karbonylovým uhlíkom pri kc 165,5 (C-9333) a H-8333 a medzi H-2333, 6333 a C-7333 (kc 145,4) navrhol (E)-kumaroylovú skupinu. HMBC korelácia medzi metylovým protónovým vrcholom a karbonylovým uhlíkom pri kc 169,0 potvrdila prítomnosť acetylovej skupiny.
4-hydroxyfenylová skupina bola navrhnutá na základe HMBC korelácií medzi H-3, 5 a kvartérnymi aromatickými uhlíkmi pri kC 155,6 (C-4) a 128,6 (C-1) . Hydroxylovaná etylová skupina bola potvrdená signálmi COSY NMR pri kH 2,66 (2H, t, J=6,1 Hz, H-7), 3,90 (1H, m, H-8a ) a 3,54 (1 H, m, H -8b). HMBC korelácie medzi H-7 a C-1 (kC 128,6) a C-2, 6 (kC 129,7) naznačujú 4-hydroxyfenyletylovú skupinu ako aglykónovú subštruktúru.
Dve cukrové skupiny, navrhnuté z MS fragmentového vzoru, boli znovu potvrdené HPLC analýzou kyslého hydrolyzátu a NMR spektier. D-glukóza a L-ramnóza boli objasnené pomocou HPLC analýzy kyslého hydrolyzátu [17]. A-glukózová skupina a a-ramnózová skupina boli stanovené väzbovými konštantami anomérnych protónov. Spektrum 1H-1H COZY ukázalo sekvenčné korelácie od H-13 po H-53 a od H-133 po H-633 (obrázok 4).
Z 1H-NMR spektra posun smerom nadol H-23 (kH 4,69) a H{5}} (kH 4,80) naznačil acyl-substituovanú polohu na glukóze. Spojenie medzi glukózou a dvoma acylovými skupinami boli potvrdené koreláciami HMBC medzi H-43 (kH 4,80) a C-9333 a medzi H-23 a karbonylovým uhlíkom acetylovej skupiny (kC 169,0 ). Polohy aglykónu a ramnózy boli dané HMBC koreláciami medzi H-33 (kH 3,95) a C-1333 a medzi H-8 a C-13. V súlade s tým bola štruktúra 17 priradená ako 4-hydroxyfenyletyl-2-O-acetyl-O- -L-ramnopyranozyl-(1→3)-4-0-(E)- kumaroyl- -D-glukopyranozid a pomenovaný cistansalzid D.
Cistansalside E (18) sa izoloval ako amorfný hnedý prášok. Jeho molekulový vzorec bol stanovený ako C31H38O14 pomocou 13C-NMR údajov a píku ESI-QTOF-MS s vysokým rozlíšením v pozitívnom móde pri m/z 657,2166 [M plus Na] plus (vypočítané pre C31H38O14Na, 657,2154). Okrem toho boli detegované aj fragmentové ióny zahŕňajúce kafeoylový ión pri m/z 163, [M plus H x Aglykón x Rha] plus ión pri m/z 367 a [M plus H x Aglykón] ión pri m/z 513. Fragmentové ióny naznačujú existenciu ramnózovej jednotky a acetyl-substituovanej glukózovej jednotky.
1H-NMR spektrum naznačilo prítomnosť dvoch anomérnych protónov pri kH 4,63 (1H, d, J=8,2 Hz, H-13) a 4,60 (1H, s, H-133 ) a dva acylom substituované protóny glukózy pri kH 4,71 (1H, dd, J=8,9, 8,2 Hz, H-23) a 4,81 (1H, dd, J=9,7 , 9,5 Hz, H-43). 1H a HMBC spektrá naznačujú existenciu acetylovej skupiny pri kH 1,94 (3H, s, acetyl-CH3), (E)-kafeoylovej skupiny pri kH 7,48 (1H, d, J=15,9 Hz, H-7333), 7,02 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2333), 6,98 (1H, dd, J=8,1, 1,6 Hz, H-6333), 6,76 (1H,d, J=8,1 Hz, H-5333) a 6,21 (1H, d, J=15,9 Hz, H{ {67}}) a monosubstituovaný benzénový kruh pri kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) a 7,20 (1H, m, H-4) (tabuľka 2). Fenylmetylová skupina, aglykónová subštruktúra, bola navrhnutá pomocou HMBC korelácií medzi H-7 (2H, kH 2,80, m) a C-1 (kC 138,8) a medzi H-7 a C -2, 6 (kC 128,9) a COSY NMR signály H-7 s H{97}}a (1H, kH 3,99, m) a H-8b (1H, kH 3,63, m).
Dve cukrové skupiny boli znovu potvrdené HPLC analýzou kyslého hydrolyzátu a NMR spektrálnou analýzou. Absolútne konfigurácie cukrov boli objasnené pomocou HPLC analýzy kyslého hydrolyzátu, ktoré boli potvrdené ako D-glukóza a L-ramnóza [17]. A-glukózová skupina a -ramnózová skupina boli stanovené väzbovými konštantami anomérnych protónov. Spektrum 1H-1H COZY ukázalo sekvenčné korelácie od H-13 do H-53, od H-133 po H-233 a od H{{11} } až H-333 (obrázok 4).
Zo spektra HMBC, korelácie medzi H{{0}} a C-8 (kC 69,4), medzi H-23 a karbonylovým uhlíkom acetylovej skupiny (kC 169,1), medzi H-33 (kH 3,95) a C-133 (kC 102,0) a medzi H-43 (kH 4,81) a C-9333 (kC 165,6) potvrdili polohu substituentov v štruktúra. Preto sa určilo, že štruktúra 18 je fenyletyl-2-O-acetyl-OaL-ramnopyranozyl-(1→3)-4-0-(E)-kafeoyl- -D-glukopyranozid a s názvom cistansalside E.
Väčšina trans-cinnamoylových substituentov bola izomerizovaná na cis-izoformu in vitro. Uvádza sa, že svetlo premieňa deriváty kyseliny trans-škoricovej na cis-izoformy [18,19]. Bolo pozorované, že rovnováha trans-cis konverzie cinnamoylových substituentov udržiava približne 70 percent izolátov v trans-izoforme. Pre olefínové protóny cis formy vrcholy pri približne 6,90 ppm (d, J=12~13 Hz, H-7333) a 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) boli priraditeľné v 1H-NMR spektrách, zatiaľ čo vrcholy pri približne 7,55 ppm (d, J=15,8 Hz, H-7333) a 6,40 ppm (d, J { {28}},8 Hz, H-8333) boli pozorované pre transformáciu [20]. V 1H-NMR spektre trans-cis zmesí boli pozorované píky pre dva olefínové protóny (H-7333 a H-8333) v pomere 7:3 (trans:cis). 13C-NMR píky cis formy boli podobné ako píky transformácie.
Účinné zložky z cistanche: akteozidy
Všetky izoláty boli testované na ich inhibičné účinky na produkciu NO v RAO indukovanú LPS
Všetky izoláty boli testované na ich inhibičné účinky na LPS-indukovanú produkciu NO v bunkách RAW 264.7. Dexametazón bol použitý ako pozitívna kontrola a jeho IC50 bola 7.{18}} uM. Z testovaných zlúčenín zlúčeniny 5 (IC50 42,7 až 6,6 uM), 11 (IC50 37,3 až 2,2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) a 18(IC50 27,9 až 0,8 uM) vykazovali mierne inhibičné aktivity na indukovateľnú NO syntázu, zatiaľ čo ostatné zlúčeniny boli v tomto teste neaktívne (IC50 hodnoty > 100 uM). Aby sa overilo, či tieto zlúčeniny majú cytotoxicitu, merala sa životaschopnosť buniek pomocou MTT testu. V dôsledku toho žiadny z nich nevykazoval významnú cytotoxicitu (doplnkový obrázok S6-1). Tieto štyri zlúčeniny sa vybrali na vyhodnotenie ich inhibičnej aktivity voči dráhe NF-AB v bunkách RAW 264.7 stimulovaných LPS. Stimulácia buniek RAW 264.7 pomocou LPS vyvolala fosforyláciu I入B a NF-入B (p65) po 0,5 hodine inkubácie. Fosforylácia NF-入 B (p65) bola významne znížená predbežným spracovaním zlúčeninami 11, 13 a 18, ako ukazuje analýza Western blot (obrázok 5). Preto zlúčeniny 11, 13 a 18 môžu mať protizápalové účinky prostredníctvom inhibície NF-入B v makrofágoch.
Obrázok 5.Účinok štyroch zlúčenín na fosforyláciu I入B a NF-入B (p65) v bunkách RAW 264.7 stimulovaných LPS. (A) Western bloty sa uskutočňovali v LPS a bunkách RAW 264.7 ošetrených vzorkou; (B, C) Imunoblotové signály boli kvantifikované pomocou softvéru Molecular Analyst/PC denzitometria (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Uvádza sa denzitometrická analýza fosforylovaných izoforiem. NF-入 B v RAW 264.7 bunke bol normalizovaný na obsah -aktínu.
3. Materiály a Metódy
3.1. Všeobecný experiment Postup
Optické rotácie sa merali digitálnym polarimetrom Jasco P{0}} (Jasco, Tokio, Japonsko). UV spektrá boli zaznamenané na spektrometri Chirascan plus Circular Dichroism (Chirascan, APL, UK). IR spektrá boli zaznamenané pomocou Jasco FT/IR-4200 spektrofotometra. Elektrosprejová ionizačná kvadrupólová hmotnostná spektrometria s vysokým rozlíšením (HR-ESI-qTOF-MS) sa uskutočnila na Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS vybavenom sériou Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, USA) a použitý stĺpec bol stĺpec Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id 150 4,6 mm, 5 um). Na zber údajov sa použil softvér MassHunter Workstation.
1D (1H a 13C) a 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR spektrá boli získané pomocou Jeol LA 300 (Jeol, Tokio, Japonsko), Bruker AVANCE-400, Bruker Spektrometre AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 a Bruker AVANCE 800 HD spojené s kryosondou (Bruker, Ettlingen, Nemecko). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, In Cistanche Andover, MA, USA) sa použil ako NMR rozpúšťadlo a referenčné píky (kH 2,50 a kC 39,5). Kolónová chromatografia (CC) sa uskutočnila s použitím Sephadexu LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Švédsko) alebo silikagélu Kieselgel 60 (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt , Nemecko). Chromatografia na tenkej vrstve (TLC) sa uskutočnila na vopred potiahnutých platniach Kieselgel 60 silikagél F254 (Art. 5715; Merck). Škvrny na TLC sa detegovali pomocou UV lampy pri 254 nm a 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Francúzsko). Strednotlaková kvapalinová chromatografia (MPLC) sa uskutočňovala na kolóne RediSep 120 g silikagélu (Isco, Lincoln, NE, USA) a silikagéli Kiesegel 60 (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck) s použitím Combiflash spoločník (Isco). Systém vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie (HPLC) bol Gilson HPLC vybavený pumpou Gilson 321 a detektorom UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, USA), s použitím semipreparatívnych kolón ODS (Luna 5 um C18 (2) 100 Á, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Nemecko; stĺpec Inno C18 12 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Kórea). Analytickým RP-HPLC systémom bol aliančný systém Waters 2695 s detektorom 996 Photodiode Array (PDA) (Waters Corp, Milford, MA, USA) a použitá kolóna bola Hypersil™ BDS C18 kolóna (130 Á, id 150: 4,6 mm, 5 um, Thermo Scientific™). Kyselina mravčia bola zakúpená od Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seoul, Kórea). Rozpúšťadlá pre HPLC boli zakúpené od Fisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, Kórea). H2S04, Na2C03 a rozpúšťadlá prvej triedy na extrakciu, frakcionáciu a izoláciu boli zakúpené od Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Soul, Kórea). Hydrochlorid metylesteru L- a D-cysteínu a o-tolylizotiokyanát boli zakúpené od Tokyo Chemical Industry (Tokio, Japonsko).
3.2. Rastlina Materiál
Celé rastliny zCistanche salsa, ktoré boli zozbierané od Ujgurov Shinjang, boli dovezené prostredníctvom spoločnosti Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Kórea). Identifikoval ich Prof. Dr. Jehyun Lee (Dongguk University, Soul, Kórea). Vzor kupónu (SNUPH2016-03) bol uložený v Herbári záhrady liečivých rastlín, College of Pharmacy, Soul National University.
3.3. Extrakcia a Izolácia
Sušené celé rastlinyCistanche salsa(5,7 kg) sa nasekali a extrahovali trikrát MeOH (20 1) pri teplote miestnosti so sonikáciou počas 99 minút. Po odstránení rozpúšťadla vo vákuu sa surový extrakt (1,35 kg) suspendoval v H20 (5 1), potom sa rozdelil s EtOAc (5 1). EtOAc zvyšok (55,3 g) sa rozdelil na 16 frakcií (E01-16) chromatografiou na silikagéli s elúciou CHCl3/MeOH (50:1–0:1, systém stupňovitého gradientu).
E08 (611,7 mg) sa podrobila strednotlakovej kvapalinovej chromatografii na silikagéli (25 g) a eluovala sa zmesou CHCl3/MeOH (18:1 – 0:1, systém stupňovitého gradientu) a poskytlo 11 frakcií (E08a-k). Z E08g sa zlúčeniny 13 (0,7 mg) a 18 (0,6 mg) purifikovali s použitím stĺpca Luna 5 um HPLC a izokratickou elúciou s 28 % vod. MeCN. Čistenie HPLC (Hypersil GOLD, 25 % vodný MeCN) E08h (138,5 mg) poskytlo zlúčeniny 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) a 17 (4,9 mg).
E09 (1,15 g) sa ďalej purifikoval na stĺpci silikagélu-MPLC (20 g) eluovaním zmesou CHCl3/MeOH (10:1–0:1, krok- gradientový systém), čím sa získa 11 podfrakcií (E09a-k). E09e (398,7 mg) sa podrobil Sephadexu LH-20 (MeOH) a získalo sa osem subfrakcií (E09e1-8). E09e6 sa následne čistil pomocou Hypersil GOLD HPLC kolóny (22 % vodný MeCN), čím sa získala zlúčenina 11 (0,4 mg). Z E09e7 sa zlúčenina 5 (0,6 mg) čistila izokratickou elúciou z Luna 5 um HPLC kolóny so 40 % vod. MeOH.
E10 (1,20g) sa rozdelil do deviatich frakcií (E10ai) na kolóne Sephadex LH-20 a eluoval sa MeOH. Z E10g (147,5 mg) sa pomocou HPLC separácie izolovali zlúčeniny 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) a 15 (5,0 mg) (Inno, 23 % vodný MeCN). Frakcia E10h (470,0 mg) sa čistila na Hypersil GOLD kolóne izokratickou elúciou (40 % vodný MeOH), čím sa získali zlúčeniny 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) a 16 (3,0 mg).
E11 (2,96 g) sa podrobil Sephadexu LH-20 elúcii MeOH, čím sa získalo deväť frakcií (Ella-i). E11e sa oddelil pomocou patróny Sep-Pak C18 a eluoval sa postupne s 10 percentami, 20 percentami, 30 percentami, 50 percentami a 100 percentami vod. MeOH, čím sa získa sedem frakcií (Elle1-7), po ktorých nasleduje Luna 5 um HPLC (28 percent vodný MeCN), čím sa získajú zlúčeniny 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) a 12 (1,2 mg).
E12 (19.0 g) sa podrobil MPLC na oxide kremičitom (120 g) s použitím systému stupňového gradientu CHCl3/MeOH, čím sa získalo šesť frakcií (18:1–0:1 , E12a-f). E12f sa chromatografoval na kolóne Sephadex LH-20 (MeOH), čím sa získalo sedem frakcií (E12f1-7). Purifikácia HPLC (Hypersil GOLD, 25 % vodný MeCN) E12f7 poskytla zlúčeninu 2 (3,3 mg). Všetky rozpúšťadlá použité pre HPLC boli 0,05 percentný pufor kyseliny mravčej. Bežný prietok pre HPLC a MPLC chromatografiu bol 3 a 40 ml/min.
3.4.Charakteristika
Cistansalside A (5): hnedý amorfný prášok; [ |20 x 33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (loge) 332 (3,18); IR (čistý) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmxl; 1H-NMR (800 MHz) a13C-NMR (200 MHz) dáta, pozri tabuľku 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 645,2146 (vypočítané pre C30H38O14Na, 645,2154).
Cistansalside B (6): hnedý amorfný prášok; [ |20 x 72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (loge) 333 (3,32); IR (čistý) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmxl; 1H-NMR (500 MHz) a13C-NMR (125 MHz) dáta, pozri tabuľku 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 579,2054 (vypočítané pre C26H36013Na, 579,2048).
Cistansalside C (12): hnedý amorfný prášok; [ |20 x 61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (loge) 337 (3,25); IR (čistý) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmxl; 1H-NMR (800 MHz) a13C-NMR (200 MHz) dáta, pozri tabuľku 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 581,2213 (vypočítané pre C26H38013Na, 581,2205).
Cistansalside D (17): hnedý amorfný prášok; [ |20 x 51,1 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (loge) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (čistý) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; 1H-NMR (400 MHz) a13C-NMR (75 MHz) dáta, pozri tabuľku 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2147 (vypočítané pre C31H38O14Na, 657,2154).
Cistansalside E (18): hnedý amorfný prášok; [ |20 x 59,2 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (loge) 336 (3,22); IR (čistý) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmxl; 1H-NMR (800 MHz) a13C-NMR (200 MHz) dáta, pozri tabuľku 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2166 (vypočítané pre C31H38O14Na, 657,2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Analýza
Chromatograficko-hmotnostná spektrometrická analýza sa uskutočnila na systéme Agilent 1260 Infinity series LC (Agilent Technologies, Inc., USA). Analytický stĺpec bol stĺpec SFCpak Crest C18T-5 (id 15{{10}}: 4,6 mm, 5 um, Jasco, Japonsko). Mobilná fáza pozostávala z 0,1 percenta (v/v) kyseliny mravčej v MeCN (A) a vode (B) s použitím gradientovej elúcie 0–35 minút (23 percent A), 35–45 minút ( 23–28 percent A), 45–75 minút (28 percent A) a 75–80 minút (90 percent A). Prietok sa udržiaval na 0,3 ml/min. Absorbancia sa merala pri 320 nm. Podmienky zdroja ESI boli nasledovné: prietok sušiaceho plynu (N2), 10 l/min; teplota sušiaceho plynu, 350 stupňov; nebulizér, 30 psig; prietoková rýchlosť plášťového plynu, 12,0 l/min; teplota plynu v plášti, 350 stupňov; kapilára, 4000 V; skimmer, 60 V; oktapól RF, 750 V; napätie fragmentora, 180 V; pozitívny režim. Systém bol prevádzkovaný pod softvérom pracovnej stanice Masshunter. Hmotnostný rozsah bol nastavený na m/z 50–1000.
3.6.Kyselina Hydrolýza
Zlúčeniny sa hydrolyzovali pomocou 1 N H2SO4 (100 ul), zahrievaného vo vodnom kúpeli pri 90 stupňoch počas 2 hodín, potom sa neutralizovali nasýteným vodným roztokom Na2C03. Po vysušení roztokov pod prúdom N2 sa produkty a štandardné cukry (D-Glc, L-Glc, L-Rha) rozpustili v pyridíne (100 ul) obsahujúcom hydrochlorid metylesteru L-cysteínu (0,5 mg). Vzorka L-ramnózy sa rozpustila v pyridíne (100 ul) obsahujúcom hydrochlorid metylesteru D-cysteínu (0,5 mg). Potom sa zahrievali na 60 stupňov počas 1 hodiny. Na roztoky sa pôsobí 1 ul (1,11 mg) o-tolylizotiokyanátu, ktorý sa opäť zahrieva na 60 stupňov počas 1 hodiny. Každá výsledná zmes sa priamo analyzovala analytickou RP-HPLC (kolóna Hypersil™ BDS C18, 17 % vodný MeCN, 0,8 ml/min, 40 minút, 35 stupňov). tR píku pri 21,9 a 40,4 min sa zhodoval s tR tiokarbamoyltiazolidínového derivátu D-glukózy a L-ramnózy.
3.7. Bunka Kultúra
Myšie makrofágy, RAW 264.7, boli získané z Kórejského výskumného ústavu biovedy a biotechnológie (Daejeon, Kórea) a pestované v RPMI médiu obsahujúcom 10 percent fetálneho hovädzieho séra a 100 U/ml penicilín/streptomycín sulfát. Bunky boli inkubované vo zvlhčenej 5-percentnej atmosfére CO2 pri 37 stupňoch.
3.8.Drogy a chemikálie
RPMI, penicilín a streptomycín boli zakúpené od HyClone (Logan, UT, USA). Hovädzí sérový albumín a LPS boli zakúpené od Sigma (St. Louis, MO, USA).
3.9. Meranie produkcie NO
Koncentrácia dusitanov v kultivačnom médiu bola meraná ako indikátor produkcie NO podľa Griessovej reakcie. Bunky sa naočkovali v pomere 2:105 buniek/jamka do 96-jamkových kultivačných platní. Po predinkubácii buniek RAW 264.7 počas 18 hodín boli bunky vopred ošetrené zlúčeninami (50 uM, 10 uM, 5 uM alebo 1 uM) a stimulované LPS (500 ng/ml) počas 24 h. Testované zlúčeniny rozpustené v DMSO. Bunky boli tiež ošetrené 0,05 percentným DMSO ako kontrolou vehikula. Bunky RAW 264.7 (2:105 buniek/jamka) sa kultivovali v 96-jamkových doštičkách s použitím RPMI bez fenolovej červene a vopred sa na ne 0,5 hodiny pôsobilo vzorkami. Bunková produkcia NO bola indukovaná pridaním 500 ng/ml konečnej koncentrácie LPS a 24 hodinovou inkubáciou. Po inkubácii sa 100 ul upraveného média zmiešalo s rovnakým objemom Griessovho činidla a inkubovalo sa 15 minút. Absorbancia zmesi pri 540 nm sa merala pomocou čítačky mikrodoštičiek ELISA (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA). Získané hodnoty sa porovnali s hodnotami štandardných koncentrácií dusitanu sodného rozpusteného v RPMI a vypočítali sa koncentrácie dusitanov v kondicionovanom médiu buniek ošetrených vzorkou.
3.10.3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazóliumbromid (MTT) test na životaschopnosť buniek
Bunky sa naočkovali do {{0}}jamkových platní v hustote 5:104 buniek/jamku a inkubovali sa s bezsérovým médiom v prítomnosti vzoriek. Testované zlúčeniny rozpustené v DMSO. Bunky boli tiež ošetrené 0,05 percentným DMSO ako kontrolou vehikula. Po inkubácii počas 24 hodín sa pridalo 10 ul MTT (5 mg/ml vo fyziologickom roztoku) a inkubácia pokračovala ďalšie 4 hodiny. Mitochondriálna sukcinátdehydrogenáza v živých bunkách premieňa MTT na viditeľné formazanové kryštály počas inkubácie. Kryštály formazanu sa potom solubilizovali v dimetylsulfoxide a absorbancia sa merala pri 540 nm s použitím čítačky mikrodoštičiek s enzýmovou imunoanalýzou (ELISA) (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). Relatívna životaschopnosť buniek sa vypočítala v porovnaní s absorbanciou neošetrenej kontrolnej skupiny. Všetky experimenty sa uskutočnili trojmo.
3.11. Imunoblotová analýza
Proteínová expresia bola hodnotená westernovým prenosom podľa štandardných postupov. V stručnosti, bunky RAW264.7 sa kultivovali v 6{{20}} mm kultivačných miskách (2:106/ml), po čom nasledovalo predbežné ošetrenie 50 uM zlúčenín . Bunky sa dvakrát premyli v ľadovo studenom PBS (pH 7,4), bunkové pelety sa resuspendovali v lyzovacom pufri na ľade počas 15 minút a zvyšky buniek sa potom odstránili centrifugáciou. Koncentrácia proteínu sa stanovila pomocou činidla Bio-Rad proteínového testu podľa pokynov výrobcu. Proteín (20–30 ug) sa zmiešal v pomere 1:1 s 2: vzorkovým pufrom (20 percent glycerol, 4 percentá SDS, 10 percent 2- ME, 0,05 percent brómfenolovej modrej a 1,25 M Tris [pH 6,8]), nanesené na 8 alebo 15 percent SDS-PAGE gély a bežať pri 150 V počas 90 minút. Bunkové proteíny sa preniesli na polyvinylidéndifluoridové membrány Immunoblot (Bio-Rad) s použitím polosuchého prenosového systému Bio-Rad podľa pokynov výrobcu. Membrány sa potom inkubovali cez noc s príslušnými primárnymi protilátkami p-NF-入B, NF-入B, pI入B a -aktín (Abcam, Cambridge, UK) v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku obsahujúcom 5 percent odstredeného mlieka a 0,1 percenta Tweenu. 20. Nasledujúci deň sa bloty trikrát premyli fyziologickým roztokom pufrovaným Tris (0,1 percenta Tween 20) a inkubovali sa 1 hodinu s HRP-konjugovanou sekundárnou anti-IgG protilátkou (zriedenou 1:2000-1 :20 000). Bloty sa znova trikrát premyli fyziologickým roztokom pufrovaným Tris (0,1 percenta Tween 20) a imunoreaktívne pásy sa vyvolali použitím chemiluminiscenčného substrátu ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).
3.12.Štatistická analýza
Experimentálne údaje sú prezentované ako priemer o SEM. Úroveň štatistickej významnosti sa stanovila analýzou rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Dunnettov t-test pre viacnásobné porovnania. p Hodnoty menšie ako 0,05 sa považovali za významné.
Extrakt z cistanche salsy
4. Závery
V tejto štúdii sme okrem izolácie a identifikácie 13 známych zlúčenín pomocou stratégie dereplikácie izolovali a objasnili štruktúry piatich nových glykozidov substituovaných fenylpropanoidom, nazvaných cistansalside AE (5, 6, 12, 17 a 18). Známe zlúčeniny boli určené ako lipedozid AI (1) [21], 23-acetylakteozid (2) [22], izocistanosid C (3) [15], osmanthuzid B (4) [21], epimeridinosid A ( 7) [15], cistanozid D (8) [23], salsazid B (9) [6], tubulozid E (10) [16], cistanozid M (11) [15], izomartynozid (13) [24], salsazid C (14) [6], jionozid C (15) [25] a salsazid F (16) [6]. Ich štruktúry boli stanovené analýzou rozsiahlych spektroskopických údajov a porovnaním s údajmi uvádzanými v literatúre. Potvrdilo sa, že predbežne predpovedané štruktúry glykozidov substituovaných fenylpropanoidom sa správne zhodovali s ich skutočnými štruktúrami.
Prínos extraktu salsy Cistanche
Referencie
1. Shimamura, H.; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Potlačenie SOS-indukujúcej aktivity Trp-P-1 mastnými kyselinami z Cistanche salsa v teste Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261-265. [CrossRef]
2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Antiproliferačné účinky Cistanches salsa na progresiu benígnej hyperplázie prostaty. Môcť. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Sun, S. Rýchla diskriminácia Herba Cistanches pomocou viacstupňového infračerveného makroodtlačku v kombinácii s mäkkým nezávislým modelovaním triednej analógie (SIMCA). Spectrochim. Acta časť A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Diferenciácia Herba Cistanches pomocou odtlačku prsta s vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou-diódové pole detekcie-hmotnostná spektrometria. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Štúdie o zložkách Cistanchis Herba. V. Izolácia a štruktúry dvoch nových fenylpropanoidových glykozidov, Cistanosides E a F. Chem. Pharm. Bull. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]
6. Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Nové glykozidy od Cistanche salsa. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79–85. [CrossRef]
7. Kartbaeva, EB; Sakipová, ŽB; Ibragimová, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Kompozičná štúdia fenolových zlúčenín Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck, rastúcich v Kazašskej republike. J. Chem. Pharm. Res. 2015, 7, 120–122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Zlepšená akumulácia fenyletanoidných glykozidov podávaním prekurzorov do suspenznej kultúry Cistanche salsa. Biochem. Ing. J. 2007, 33, 88-93. [CrossRef]
9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Výťažok zo salsy Tachibana H. Cistanche pôsobí podobne ako na bielkoviny
polysacharid-K (PSK) na rôznych typoch bunkových línií. J. Tradit. Med. 2008, 25, 166–169.
10. Tian, X.-F.; Pu, X.-P. Fenyletanoidové glykozidy z Cistanches salsa inhibujú apoptózu indukovanú 1-metyl-4-fenylpyridíniovým iónom v neurónoch. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59-63. [CrossRef] [PubMed]
11. Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Nové koncepty, experimentálne prístupy a stratégie dereplikácie na objavenie nových fytoestrogénov z prírodných zdrojov. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]
12.De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Dereplikáciou riadená izolácia depsides theaflavínov ST a lecanora DF z endofytnej huby Setophoma sp. Fytochémia 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]
13. Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodník, C.; Brodie, PJ; Blašiak, LC; Hill, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; a kol. Antiproliferatívne a antiplazmodiálne zlúčeniny z vybraných druhov Streptomyces. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]
14. Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Dereplikáciou riadená izolácia nových hepatoprotektívnych triterpenoidných saponínov z Celosiae Semen pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie spojenej s elektrosprejovou ionizačnou tandemovou štvorpólovou hmotnostnou spektrometriou s časom letu. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]
15. Zhang, J.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. Stratégia založená na LTQ pre tradičnú čínsku medicínu zameraná na triedny objav, identifikáciu a jej omický výskum: Prípadová štúdia fenyletanoidových glykozidov u troch rôznych druhov Herba Cistanches. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]
16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. The Constituents of Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Izolácia a štruktúry nového fenyletanoidového glykozidu a nového neolignánového glykozidu. Chem. Pharm. Bull. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]
17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Ľahká diskriminácia aldózových enantiomérov pomocou HPLCistanche s reverznou fázou. Pharm. Bull. 2007, 55, 899-901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Štúdium kyseliny cis-škoricovej v Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. Biochem. 2005, 43, 929-937. [CrossRef] [PubMed]
19.Kahnt, G. Trans-Cis-Equilibrium hydroxycinnamových kyselín počas ožarovania vodných roztokov pri rôznom pH. Fytochémia 1967, 6, 755-758. [CrossRef]
