Izolácia extraktu z mäkkého koralového symbiotického mikroorganizmu Salinispora Arenicola s cytoprotektívnymi účinkami a účinkami proti starnutiu 1. časť

Abstraktné: Bunky vyvinuli vysoko integrovaný systém zodpovedný za stabilitu proteómu, konkrétne sieť proteostázy (PN). Keďže strata proteostázy je charakteristickým znakom starnutia a chorôb súvisiacich s vekom, aktivácia modulov PN môže pravdepodobne predĺžiť rozsah zdravia. Tu uvádzame údaje o biologickej aktivite extraktu (SA223-S2BM) purifikovaného z kmeňa Salinispora arenicola TM223-S2, ktorý bol izolovaný z mäkkého koralu Scleronephthya lewinsohni; tento koral bol zozbieraný v hĺbke 65 m z mezofotického ekosystému Červeného mora EAPC (južný Eilat, Izrael). Ošetrenie ľudských buniek proteostatickými modulmi aktivovanými SA223-S2BM znížilo oxidačnú záťaž a poskytlo ochranu pred oxidačným a genotoxickým stresom. Okrem toho SA223-S2BM zosilnil aktivity proteazómu a lyzozomálnych katepsínov v muchách Drosophila a vykazoval ochranné účinky na kožu, čo dokazuje účinná inhibícia enzýmov súvisiacich so starnutím kože, elastázy a tyrozinázy. Navrhujeme, aby extrakt SA223-S2BM predstavoval pravdepodobný sľubný zdroj na uprednostňovanie molekúl s vlastnosťami proti starnutiu.

Glykozid cistanche môže tiež zvýšiť aktivitu SOD v tkanivách srdca a pečene a výrazne znížiť obsah lipofuscínu a MDA v každom tkanive, účinne zachytáva rôzne reaktívne kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atď.) a chráni pred poškodením DNA. OH-radikálmi. Cystanche fenyletanoidové glykozidy majú silnú schopnosť zachytávať voľné radikály, vyššiu redukčnú schopnosť ako vitamín C, zlepšujú aktivitu SOD v suspenzii spermií, znižujú obsah MDA a majú určitý ochranný účinok na funkciu membrány spermií. Polysacharidy Cistanche môžu zvýšiť aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytoch a pľúcnych tkanivách experimentálne starnúcich myší spôsobenú D-galaktózou, ako aj znížiť obsah MDA a kolagénu v pľúcach a plazme a zvýšiť obsah elastínu. dobrý čistiaci účinok na DPPH, predĺženie doby hypoxie u starnúcich myší, zlepšenie aktivity SOD v sére a oddialenie fyziologickej degenerácie pľúc u experimentálne starnúcich myší Experimenty ukázali, že pri bunkovej morfologickej degenerácii má Cistanche dobrú antioxidačnú schopnosť a má potenciál byť liekom na prevenciu a liečbu chorôb starnutia kože. Zároveň má echinakozid v Cistanche významnú schopnosť vychytávať voľné radikály DPPH a má schopnosť vychytávať reaktívne formy kyslíka a zabraňovať degradácii kolagénu vyvolanej voľnými radikálmi a tiež má dobrý reparačný účinok pri poškodení aniónom voľných radikálov tymínu.

Kliknite na cistanches herba

【Ďalšie informácie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Kľúčové slová: starnutie; antioxidačné reakcie; morský mikroorganizmus; sieť proteostázy; Salinispora arenicola

1. Úvod

Starnutie je charakterizované časovo závislým poklesom funkčnej kapacity a odolnosti voči stresu, ako aj zvýšenou mortalitou a morbiditou [1]. Starnutie nie je len pasívny proces, pretože je regulované evolučne zachovanými molekulárnymi a bunkovými signalizačnými udalosťami [2,3]. Organizmy sú neustále vystavené vnútorným (súvisiacim s metabolizmom) aj vonkajším stresorom (odvodeným zo stravy alebo životného prostredia), čo môže viesť k postupnej akumulácii poškodených biomolekúl a nakoniec k narušeniu bunkovej homeostázy [4,5]. Proteíny sa podieľajú na všetkých kľúčových bunkových funkciách, a preto je homeostáza proteómu (proteostáza) rozhodujúca pre bunkovú funkčnosť a prežitie [6].

Integrita proteómu je udržiavaná sieťou proteostázy (PN), ktorá sa rozširuje do všetkých subcelulárnych kompartmentov a je regulovaná na bunkovej, tkanivovej a organizačnej úrovni, aby sa zabezpečilo zdravie a dlhovekosť organizmu [7]. Udržanie proteostázy vyžaduje, aby bunky koordinovali a regulovali funkcie syntézy, skladania, triedenia, transportu a degradácie všetkých polypeptidov [8,9]. Tieto bunkové funkcie väčšinou vykonávajú tri hlavné prepojené vetvy PN, a to sieť molekulárnych chaperónov, proteolytické dráhy ubikvitín-proteazóm-(UPP) a autofagy-lyzozóm-(ALP) [10,11].

Molekulárne chaperóny zabezpečujú správne skladanie proteínov a udržiavanie konformácie a tiež spolupracujú s degradačnými dráhami [12]. UPP je hlavným miestom kontroly kvality syntézy proteínov a podieľa sa na recyklácii normálnych proteínov s krátkou životnosťou a neopraviteľných chybne poskladaných alebo neposkladaných proteínov [6], zatiaľ čo ALP je zodpovedná za rozpoznávanie a odstraňovanie proteínových agregátov a poškodených organel. [13]. Strata proteostázy je charakteristickým znakom starnutia [14], ako aj hlavným rizikovým faktorom mnohých ľudských patológií súvisiacich s vekom, vrátane rakoviny, cukrovky, kardiovaskulárnych porúch a neurodegeneratívnych ochorení [15]. Aktivácia PN sa preto považuje za sľubný prístup na oddialenie nástupu a/alebo progresie starnutia a chorôb súvisiacich s vekom [16–18].

Starnutie kože je charakterizované štrukturálnymi a funkčnými zmenami (okrem iného) zložiek extracelulárnej matrice, ako je elastín [19]. Elastáza je enzým, ktorý sa podieľa na degradácii elastínu, čo vedie k tvorbe vrások a strate elasticity [20]. Tyrozináza je kľúčovým enzýmom syntézy melanínu, ktorý je zodpovedný za pigmentáciu (okrem iného) ľudskej kože [21,22]. Avšak nadmerná aktivácia tyrozinázy je spojená s niekoľkými kožnými poruchami, ako je hyperpigmentácia a melanóm [22,23]. Preto inhibícia elastázy a tyrozinázy predstavuje prominentný prístup proti starnutiu pokožky.

Prírodné produkty (NP) majú dlhú históriu – dobre zdokumentovanú, ešte pred zrodom modernej vedy a techniky v rôznych kultúrach – liečby ľudských chorôb [24–26]. NP teda môžu slúžiť ako vysoko obohatené východiskové materiály a skelety pre vývoj liečiv; v skutočnosti viac ako polovica všetkých liekov sú buď NP, odvodené NP alebo inšpirované NP [27–29]. Morský svet, ktorý má najväčšiu biodiverzitu, je z veľkej časti nepreskúmaný, a preto môže byť najrozsiahlejším zdrojom na objavovanie nových NP [30]. Medzi organizmami, ktoré žijú v morskom prostredí, sú mäkké koraly sľubnými poskytovateľmi bioaktívnych NP a je známe, že sú hostiteľmi mnohých rôznych mikroorganizmov [31,32].

Vzhľadom na tieto skutočnosti v súčasnosti vykonávame rozsiahly vysokovýkonný skríning NP na identifikáciu bioaktívnych molekúl, ktoré by mohli potenciálne oddialiť starnutie buniek a / alebo starnutie in vivo. V tu prezentovanej štúdii sme skúmali metanolový extrakt, konkrétne SA223-S2BM, kmeňa Salinispora arenicola (S. arenicola) TM223-S2 pomocou in vitro testov, ako aj bunkových a in vivo biologicky riadené prístupy. Kmeň S. arenicola TM223-S2 bol izolovaný z mäkkého koralu Scleronephthya lewinsohni (S. Levinson) (pôvodne pomenovaný ako Scleronephthya lewinsohni od Verseveldta a Benayahu, 1978), ktorý bol trvalo získaný z mezofotického Červeného mora (ekosystém EAPC južný Eilat, Izrael) v hĺbke 65 m. Metanolový extrakt SA223-S2BM aktivoval cytoprotektívne mechanizmy v ľudských bunkách aj v muchách Drosophila melanogaster (D. melanogaster) a prejavoval in vitro ochranné vlastnosti pokožky. Preto by extrakt SA223-S2BM mohol byť zdrojom pre pravdepodobnú identifikáciu molekúl s potenciálnymi cytoprotektívnymi vlastnosťami a vlastnosťami proti starnutiu.

2. Materiály a metódy

2.1. Pôvod a izolácia extraktu SA223-S2BM

2.1.1. Koralová kolekcia

Mäkký koral S. Levinson zozbieral ROV H800 (ECA Robotics), ktorý prevádzkuje Sam Rothberg R/V z Medziuniverzitného inštitútu pre morské vedy v Eilate (IUI). In situ bolo fotografovanie realizované čiernobielou kamerou VS300 (ECA Robotics) a 1CAM Alpha HD kamerou (SubC Imaging). Vzorky boli získané ramenom ROV z mezofotického útesu Eilat, pri termináli ropného móla (29◦300 47.0900 N, 34◦350 56.7100 E), vo výške 65 m, dňa 7. marca 2017. Miesto zberu sa vyznačuje miernym svahom so skalnatými miestami obklopenými piesočnatým morským dnom. Po odbere bol materiál okamžite zmrazený na -80 ◦C. Vzor kupónu bol uchovaný v 70-percentnom etanole na taxonomickú identifikáciu a uložený v Steinhardt Museum of Natural History, Tel Aviv University (SMNHTAU_Co{16}}).

2.1.2. Izolácia a identifikácia kmeňa

S. arenicola TM223-S2 sa izoloval z 1 ml vzorky S. Levinsona. Zozbieraná vzorka mäkkých koralov bola rozomletá v sterilnej morskej vode a zahrievaná na 50 °C počas 1 hodiny. Výsledná suspenzia bola sériovo nariedená, nanesená na selektívne izolačné agarové médium a inkubovaná pri 28 °C počas aspoň 6 týždňov. Kmeň Salinispora bol izolovaný a kolónia bola purifikovaná na morskom bujónovom agare (MBA) (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) a konzervovaná pri -20 °C v 10 percentnom glycerolovom roztoku.

2.1.3. Fylogénne vyšetrovanie

Fylogénna analýza sa uskutočnila s použitím fragmentu génu 16S rRNA amplifikovaného z genómovej DNA S. arenicola TM223-S2. Genómová DNA kmeňa TM223-S2 bola izolovaná pomocou súpravy DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) podľa pokynov výrobcu. Fragment 16S ribozomálnej RNA sa amplifikoval pomocou PCR s použitím primérov 16S F 27, AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG (Tm: 56,3 ◦C) a 16S R 1492, TAC GG(CT) TAC CTT GTT ACG ACT T ( Tm: 57,5 ​​◦C). Amplikóny boli sekvenované Sangerovým sekvenovaním a sekvencie boli porovnané s databázou 16S ribozomálnej RNA projektu Targeted Loci NCBI pomocou MUSCLE. Zarovnanie bolo ručne skontrolované a medzery boli odstránené. Evolučná história bola odvodená pomocou metódy maximálnej pravdepodobnosti a modelu Tamura-Nei [33] s 1000 replikátmi. Počiatočný strom pre heuristické vyhľadávanie sa získal automaticky aplikáciou algoritmov susedného spojenia a BioNJ na maticu párových vzdialeností odhadnutých pomocou prístupu maximálnej zloženej pravdepodobnosti (MCL) a potom výberom topológie s vyššou hodnotou logaritmickej pravdepodobnosti. Evolučné analýzy boli vykonané v MEGA X verzii 10.1.7 [34].

2.1.4. Podmienky kultivácie

Spóry S. arenicola TM223-S2 boli konzervované pri -20 ◦C v 10 percentnom glycerole. Pred kultiváciou sa kmeň oživoval 15 dní na 15 cm Petriho miske obsahujúcej MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) doplnenú 2 percentami agaru (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA , USA). Sterilná morská voda (4 x 10 ml) sa naliala na povrch platne a spóry a mycélium sa získali z platne jemným poškrabaním povrchu skalpelom, aby sa vytvorilo inokulum. Fermentácia v kvapalnom stave (LSF) sa uskutočňovala v 2 1 Erlenmeyerovej banke počas 20 dní pri 28 °C a 130 ot./min. Pred sterilizáciou sa pridala živica Amberlite XAD16 (30 g/l) (Amberlite XAD16HP N, Certis, Lenntech, Delfgauw, Holandsko), aby sa umožnilo zachytenie mikrobiálnych metabolitov in situ. Päť mililitrov inokula sa použilo na inokuláciu 1 1 na MB obsahujúcom 30 g živice Amberlite XAD16. Fermentácia v agarovom stave spojená s extrakciou na pevnej fáze (SPE) [35] sa uskutočnila na médiu MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) doplnenom 2 percentami agaru (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) počas 20 dní pri 28 ◦C. Sterilizovaný Amberlite XAD16 (35 g) zmiešaný s 35 ml inokula sa homogénne rozotrel na povrch 1 MB agarovej Petriho misky (25 cm x 25 cm).

V prípade LSF sa živica XAD16 oddelila od kultivačnej pôdy filtráciou a premyla sa vodou a potom sa eluovala etylacetátom (100 ml) a potom metanolom (100 ml). Eluáty sa koncentrovali do sucha vo vákuu a solubilizovali v DMSO na koncentráciu 10 mg/ml. Výsledný extrakt, SA223-S2LAE (extrahovaný pomocou etylacetátu), sa použil na biologické hodnotenia.

Pre SPE bola živica XAD16 získaná opatrným zoškrabaním povrchu agarovej platne. Získaná živica sa premyla vodou, aby sa eliminovala biomasa a potom sa eluovala etylacetátom (100 ml) a potom metanolom (100 ml). Eluáty sa koncentrovali do sucha vo vákuu a solubilizovali v DMSO na koncentráciu 10 mg/ml. Výsledné extrakty, SA223-S2BAE (extrahované pomocou etylacetátu) a SA223-S2BM (extrahované pomocou metanolu), sa použili na biologické hodnotenia.

2.2. Inhibičné aktivity elastázy a tyrozinázy

Inhibičná aktivita elastázy prioritného extraktu bola hodnotená pomocou elastázy z prasačieho pankreasu (PPE) typu IV (Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko) a substrátu N-sukcinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko), ako už bolo opísané [36]. Schopnosť extraktu inhibovať katalytický účinok tyrozinázy pri oxidácii L-DOPA na dopacróm bola stanovená, ako už bolo uvedené [37].

2.3. Bunkové línie, podmienky bunkovej kultúry a test životaschopnosti buniek

Fibroblasty ľudskej predkožky (BJ bunky) boli zakúpené od American Tissue Culture Collection (ATCC), zatiaľ čo ľudské imortalizované keratinocyty (HaCaT bunky) boli získané od Elabscience, Inc. Obe bunkové línie boli kultivované v Dulbeccovom modifikovanom Eagleovom médiu (DMEM) (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) doplnené 10 percentami (v/v) fetálnym hovädzím sérom (FBS) a 1 percentom (v/v) neesenciálnych aminokyselín a boli udržiavané v podmienkach 5 percent CO2, 95 percent vlhkosť a 37 ◦C. Vo všetkých použitých experimentálnych postupoch boli bunky subkultivované s použitím roztoku trypsín/EDTA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Účinok extraktu SA223-S2BM na životaschopnosť buniek sa odhadol pomocou testu MTT, ako už bolo uvedené [38]. Ošetrenie buniek peroxidom vodíka (H202) a doxorubicínom (DXR) sa uskutočnilo tak, ako je opísané v legendách obrázkov; H202 a DXR boli získané od Merck KGaA (Darmstadt, Nemecko).

2.4. Drosophila Lines and Longevity Assay

V tejto štúdii sme použili kmeň Drosophila w1118 zakúpený od Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN, USA). Muchy sa udržiavali pri 25 °C a 60 percentnej vlhkosti v cykle 12 hodín svetlo: 12 hodín tma. Vo všetkých prezentovaných experimentoch boli analyzované iba somatické tkanivá (hlava a hrudník) múch, pretože reprodukčné tkanivá vykazujú odlišnú reguláciu proteostatických mechanizmov a rýchlosti starnutia v porovnaní so somatickými tkanivami [39].

Životnosť múch bola testovaná tak, ako je opísané vyššie [40] s použitím samíc a samcov múch (rovnaký počet na pohlavie), ktoré boli kultivované vo fľaštičkách obsahujúcich (alebo nie) študovaný extrakt. Muchy sa premiestňovali do fľaštičiek s čerstvým jedlom každé dva dni a úmrtia sa zaznamenávali denne. Pre krivky prežitia a štatistickú analýzu sa použil Kaplan-Meierov postup a log-rank (Mantel-Cox) test; významnosť bola akceptovaná pri p < 0,05.

2.5. Meranie druhov reaktívneho kyslíka (ROS)

Bunky alebo tkanivá múch boli inkubované s farbivom CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) v koncentrácii 10 µM v PBS počas 30 minút v tme (37 ◦C a 25 ◦C). Po odstránení farbiva boli bunky alebo tkanivá múch inkubované s PBS počas 15 minút v tme (37 ◦C a 25 ◦C, v uvedenom poradí), lyzované v lyzovacom pufri [150 mM NaCl, 1 % (v/v) NP{{ 11}}, 50 mM Tris, pH 8,0] a potom centrifugovať pri 14,000 g počas 15 minút (4 ◦C). Potom sa meral obsah proteínu Bradfordovým testom (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) a vytvorená fluorescencia sa merala v multimódovej čítačke mikrodoštičiek Spark® (Tecan Trading AG, Männedorf, Švajčiarsko) pri excitácii. a emisné vlnové dĺžky 490 a 540 nm. Peroxid vodíka (H2O2) bol použitý ako pozitívna kontrola, keďže je všeobecne známe, že spôsobuje oxidačné poškodenie/stres [41].

2.6. Extrakcia RNA, syntéza cDNA a kvantitatívna analýza PCR v reálnom čase (Q-RT-PCR)

Celková RNA sa extrahovala z buniek pomocou RNAiso plus (Takara Bio Inc., Shiga, Japonsko) a kvantifikovala sa pomocou BioSpec-nano spektrofotometra (Shimadzu Inc., Kyoto, Japonsko). Následne sa 1 ug RNA premenil na cDNA pomocou súpravy FastGene Scriptase II cDNA Kit (NIPPON Genetics, Düren, Nemecko). Na uskutočnenie kvantitatívnych real-time PCR analýz sa použil 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix (Solis BioDyne, Tartu, Estónsko) a PikoRealTM Real-Time PCR systém (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Špecifické priméry pre študované ľudské gény boli opísané vyššie [42]. Ako normalizátor sa použil gén HMBS.

2.7. Imunoblotovacia analýza a meranie aktivity proteazómu a katepsínov

Štúdie imunoblotovania sa uskutočnili tak, ako už bolo opísané [43]. Primárne a sekundárne protilátky konjugované s chrenovou peroxidázou boli aplikované počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a imunobloty boli vyvinuté s použitím vylepšenej chemiluminiscenčnej reagenčnej súpravy (ClarityTM Western ECL Substrate, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Kvantifikácia imunoblotov sa uskutočnila skenovacou denzitometriou a softvérom ImageJ [44].

Enzymatické aktivity proteazómov a katepsínov v bunkách alebo tkanivách múch sa merali na fluorometrovom systéme VersaFluor™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) s použitím Suc-LLVY-AMC (aktivita podobná chymotrypsínu, CT-L) a Z-FR-AMC fluórpeptidy (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA), v tomto poradí, ako už bolo opísané [42,45,46]. 6-brómindirubín-30 -oxím (6BIO) sa použil ako pozitívna kontrola, pretože je známe, že aktivuje UPP v ľudských bunkách aj v muchách Drosophila [42,47]; liek Rapamycín sa použil ako pozitívna kontrola na indukciu ALP a katepsínov [48].

2.8. Použité protilátky

Primárne protilátky proti 5 (sc{1}}) proteazómovej podjednotke, NQO1 (sc-16464), Beclin 1 (BECN1) (sc-11427), klasterínu (CLU) (sc{{7} }), HSP27 (sc-13132), HSP70 (sc-59570) a GAPDH (sc{12}}), ako aj sekundárne protilátky konjugované s chrenovou peroxidázou, boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA). Primárne protilátky proti 53BP1 (4937), fosfo-histón H2A.XSer139 (H2A.X) (9718) a fosfor-p53Ser15 (9286) boli získané od Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Protilátka proti SQSTM1/p62 (BML-PW9860) bola zakúpená od Enzo Life Science, Inc. (Farmingdale, NY, USA).

2.9. Štatistické analýzy

Experimenty sa uskutočňovali aspoň v duplikátoch. Na štatistické analýzy bol použitý MS Excel. Štatistická významnosť bola hodnotená pomocou Studentovho t-testu (t-test). Dátové body zodpovedajú priemeru nezávislých experimentov a chybové stĺpce označujú štandardnú odchýlku (SD); významnosť pri p < 0.05 alebo p < 0,01 sú v grafoch označené jednou alebo dvomi hviezdičkami.

3. Výsledky

3.1. Identifikácia aktinomycét spojených s mäkkým koralom S. Levinson

Cielený mikrobiálny kmeň bol izolovaný z koralu S. Levinson, čo je mäkký koralový endemit v Červenom mori. Kolónie tohto koralu sa zvyčajne nachádzajú v hlbokých lokalitách, a to ako v ekosystémoch horných mezofotických koralových útesov (30–60 m), tak aj v ekosystémoch nižších mezofotických koralových útesov (60–105 m) [49]. Navyše ide o mäkký koral azooxanthelát, ktorý svoje energetické nároky získava filtrovaním, a preto sa nachádza v biotopoch vystavených silným prúdom vody.

Z fylogenetickej analýzy založenej na sekvencii 16S rRNA sa zistilo, že izolát TM223-S2 patrí do rodu Salinispora (obrázok 1).

Keďže S. arenicola možno odlíšiť od S. Pacifica a S. tropica na základe sekvencie 16S rRNA [50], nazvali sme tento izolát S. arenicola TM223-S2 s prírastkovým číslom Genbank MW446171. Kmeň sa kultivoval ako je uvedené v časti Materiály a metódy a extrahoval sa etylacetátom a metanolom. Predbežné biologické skúmanie ukázalo, že extrakt z tekutej kultúry, SA223-S2BAE, a etylacetátový extrakt z pevnej kultúry, SA223-S2LAE, nemali žiadnu významnú biologickú aktivitu (obrázok S1). Preto sa v tejto štúdii použil iba metanolový extrakt z tuhej kultúry spojenej s extrakciou tuhou fázou, SA223-S2BM.

3.2. Extrakt SA223-S2BM nevykazuje žiadnu toxicitu v ľudských bunkách a aktivuje kľúčové zložky PN

Najprv sme skúmali účinok SA223-S2BM na životaschopnosť normálnych kožných BJ fibroblastov a človekom imortalizovaných HaCaT keratinocytov vykonaním testu toxicity MTT. Na tento účel sa bunky inkubovali 24 hodín so zvyšujúcimi sa koncentráciami extraktu a ako je znázornené na obrázku 2A1, A2, extrakt nevykazuje cytotoxický účinok na žiadnu z dvoch skúmaných bunkových línií v koncentráciách do 10 ug/ml ; pri vyšších koncentráciách (nad 10 µg/ml) extrakt znižuje životaschopnosť buniek väčšinou v bunkách HaCaT.

Následne sme študovali vplyv extraktu na bunkové dráhy, ktoré zabezpečujú proteómovú stabilitu bunky. Pozorovali sme, že krátkodobá (24 h) expozícia BJ fibroblastov študovanému extraktu signifikantne indukovala expresiu génu proteazómu PSMB7 (v koncentrácii 10 µg/ml), pričom súčasne mala tendenciu zvyšovať expresiu PSMB6 gén v rovnakej koncentrácii (obrázok 2B1). Okrem toho extrakt indukoval expresiu génu proteazómu 20S, PSMB6, a génu proteazómu 19S, RPN11 v koncentrácii 1 ug/ml v bunkách HaCaT (obrázok 2B2). Okrem toho ošetrenie fibroblastov BJ extraktom počas 24 hodín viedlo k miernej indukcii hladín expresie proteazómovej podjednotky 20S 5 v koncentrácii 1 ug/ml (obrázok 2C). Na podporu našich zistení expozícia extraktu významne zvýšila aktivitu proteazómu podobnú chymotrypsínu vo fibroblastoch BJ aj v keratinocytoch HaCaT po 24 hodinách inkubácie (obrázok 2D1, D2); rozdielne výsledky skúmaných koncentrácií extraktu medzi BJ a HaCaT bunkami možno pripísať účinkom špecifickým pre bunkový typ.

Okrem toho analýzy expresie Q-RT-PCR odhalili, že ošetrenie fibroblastov BJ extraktom počas 24 hodín vyvolalo hladiny expresie génov súvisiacich s ALP, nazývaných CTSB, CTSL, CTSD a SQSTM1, v koncentrácii 10 µg/ml ( Obrázok 3A1). Ďalej sme pozorovali, že vystavenie HaCaT buniek extraktu počas 24 hodín viedlo k indukcii hladín expresie génov zapojených do funkčnosti ALP (CTSB, CTSL, CTSD a SQSTM1) (obrázok 3A2).

V súlade s týmito zisteniami sme zaznamenali upreguláciu proteínov súvisiacich s autofágiou BECN1 a SQSTM1/p62 po vystavení BJ fibroblastov extraktu v koncentrácii 1 ug/ml (obrázok 3B1); zvýšené hladiny expresie proteínov BECN1 a SQSTM1/p62 boli tiež pozorované v keratinocytoch HaCaT pri oboch študovaných koncentráciách (obrázok 3B2). V súlade s tým sme zistili, že extrakt zvyšuje enzymatickú aktivitu lyzozomálnych katepsínov v bunkách BJ aj HaCaT (obrázok 3C1, C2); opäť, rozdielne výsledky skúmaných koncentrácií extraktu medzi BJ a HaCaT bunkami možno pripísať účinkom špecifickým pre bunkový typ.

Ďalej sme skúmali účinok extraktu na hladiny expresie kľúčových molekulárnych chaperónov. Imunoblotové analýzy teda odhalili, že extrakt indukoval hladiny expresie molekulárnych chaperónov CLU (v oboch študovaných koncentráciách) v BJ bunkách (obrázok 3D1), ako aj HSP27 (1 ug/ml) a HSP70 (v oboch študovaných koncentráciách) v HaCaT bunkách (obrázok 3D2).

【Ďalšie informácie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】