štúdie ukázali, že autofágia hrá dôležitú úlohu pri regulácii bunkového ukladania LD časť 1

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

ABSTRAKT

Nové dôkazy naznačujú, že neočakávané ukladanie a peroxidácia lipidových kvapiek (LD) môže urýchliť stres organel a zohráva kľúčovú úlohu v patogenéze neurodegeneratívnych ochorení (NDD). V našej predchádzajúcej štúdii sme potvrdili, že kaempferol (Ka), prírodná malá molekula flavonoidu, vykazoval neuroprotektívne účinky na myši s LPS-indukovanou Parkinsonovou chorobou (PD). Predchádzajúce štúdie navyše ukázali, že autofágia hrá dôležitú úlohu pri regulácii bunkového ukladania LD. V súčasnej štúdii sme ukázali, že Ka chráni pred TH plus stratou neurónov a behaviorálnymi deficitmi u MPTP/p-indukovaných PD myší, sprevádzaných zníženým lipidovým oxidačným stresom v substantia nigra pars compacta (SNpc). V kultivovaných neurónových bunkách Ka vykazoval relatívne bezpečný koncentračný rozsah a významne potláčal akumuláciu LD a bunkovú apoptózu indukovanú MPP plus . Ďalšia štúdia ukázala, že ochranný účinok Ka bol závislý od autofágie, konkrétne od lipofágie. Je kritické, že Ka podporoval autofágiu, aby sprostredkoval degradáciu LD v lyzozómoch, čo potom zmiernilo ukladanie lipidov a peroxidáciu a výsledné mitochondriálne poškodenie, čím sa znížila smrť neurónov. Okrem toho knockdown Atg5 sprostredkovaný AAV-shAtg{3}} zrušil neuroprotektívne účinky Ka proti oxidácii lipidov u myší s PD.Cistanche na zlepšenie pamäteTáto práca ukazuje, že Ka zabraňuje dopamínergickej neuronálnej degenerácii v PD prostredníctvom inhibície mitochondriálneho poškodenia sprostredkovaného peroxidáciou lipidov podporou autofágie pier a poskytuje potenciálnu novú terapeutickú stratégiu pre PD a súvisiace NDD.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Úvod

Parkinsonova choroba (PD) je bežné neurodegeneratívne ochorenie (NDD), ktoré je patologicky charakterizované progresívnou stratou dopaminergných (DA) neurónov v substantia nigra pars compacta (SNpc)[1]. Aj keď presná etiológia a prirodzený priebeh tohto ochorenia musia byť ešte úplne objasnené, na patogenéze PD sa podieľajú mnohé procesy a dysfunkcie na systémovej úrovni, vrátane mitochondriálnych funkcií, homeostázy dopamínu, neurozápalu a autofágie [1, 2]. Nedávne správy odhalili, že lipotoxicita súvisiaca s lipidovými kvapôčkami (LD) sa môže podieľať na patológii PD [3,4]. Nedávno sa ukázalo, že LD hrajú oveľa širšiu úlohu ako ukladanie mastných kyselín (FA) a podieľajú sa na mnohých ochoreniach. (cistanche para que serve) Napríklad myeloidné bunky vrátane makrofágov, leukocytov a eozinofilov tvoria LD ako odpoveď na zápal a stres,cistanche po čínskya LD sú miestami produkcie a skladovania zápalových cytokínov a ďalej sa podieľajú na prezentácii antigénu a odstraňovaní patogénov [6]. Dôležité je, že pri ateroskleróze sa ukázalo, že penové bunky bohaté na LD sú škodlivé vo všetkých štádiách ochorenia [7].

Cistanche môže zlepšiť imunitu

Avšak LD neboli rozsiahle študované v centrálnom nervovom systéme (CNS), pričom len málo prác uvádza histologickú prítomnosť LD v ľudskom mozgovom tkanive [8,9]. Napriek tomu môžu mať LD dôležité funkcie v mozgu, pretože nedávne štúdie potvrdili, že agregované LD v gliách urýchľovali neurodegeneráciu v modeli Drosophila [10]. Nedávno bolo hlásené, že u myší boli bunky plné lipidov s pozitívnym O-pozitívnym olejom, vrátane neurónov, gliálnych fibrilárnych kyslých proteínov (GFAP)t astrocytov a ionizovanej molekuly adaptéra viažuceho vápnik-1 (IBA{7} })t mikroglie, sú prítomné v mnohých oblastiach mozgu a ukázalo sa, že sa podieľajú na procesoch súvisiacich s vekom [11]. Naša predchádzajúca práca tiež preukázala zvýšenú akumuláciu LD v mozgu v modeli PD myší [12]. Celkovo tieto štúdie naznačujú, že LD sa môžu podieľať na patogenéze PD, ako aj iných NDD.

Normálne sú intracelulárne LD degradované v lyzozómoch a dodávajú FA do mitochondrií na ich spotrebu ako alternatívny zdroj energie počas období vyčerpania živín [13]. Neuróny však majú nízku kapacitu spotreby mitochondriálnych FA na produkciu energie [14]. Táto charakteristika robí neuróny obzvlášť citlivými na akumuláciu LD a peroxidáciu. Okrem toho akumulácia LD zvyšuje rýchlosť oxidácie FA a vytvára trvalý tlak na mitochondriálny transportný reťazec elektrónov, čo zvyšuje produkciu reaktívnych foriem kyslíka (ROS) komplexmi elektrónového transportného reťazca I a III [15], aby sa zosilnil oxidačný stres. Preťaženie lipidmi tiež vedie k produkcii ROS extramitochondriálnymi zdrojmi, ako sú nikotínamid adenín dinukleotid fosfát (NADPH) oxidázy a iné oxidačné enzýmy. V kombinácii so zníženou expresiou antioxidačných enzýmov a nízkou kapacitou spotreby FA v neurónoch sprostredkúva akumulácia LD oxidačný stres a môže ďalej viesť k poškodeniu mitochondrií, lyzozomálnej dysfunkcii, defektnej autofágii a aktivácii zápalových reakcií [16,17]. Pokiaľ nie je možné inhibovať alebo odstrániť nahromadené LD, vysoko aktívne neuróny podliehajú patofyziológii, čo vedie k neurodegenerácii [17]. (cistanche penis) Dôkazy naznačujú, že lyzozómami sprostredkovaný katabolický proces nazývaný autofágia hrá kľúčovú úlohu pri udržiavaní bunkovej homeostázy LD vo viacerých tkanivách [17,18]. Podrobne,rast penisu cistancheLD môžu byť selektívne sekvestrované v autofagozómoch a dodané do lyzozómov na degradáciu lyzozomálnymi kyslými lipázami, čo je proces špecificky známy ako lipofágia [19]. Zacielenie na LD a ich autofagickú dráhu odstraňovania by preto mohlo predstavovať nový prístup k riadeniu neurodegenerácie.

Štúdium prírodných produktov a dietetických látok ako zdrojov potenciálnej liečby a stratégií NDD si v posledných rokoch získalo obrovský záujem [20]. Kaempferol (Ka) je prírodná polyfenolová malá molekula, ktorú možno nájsť v mnohých čínskych liečivých bylinách a potravinových zdrojoch [21]. Uvádza sa, že Ka má antibakteriálne, anti-agingové a imunomodulačné účinky, ako aj antioxidačné a neuroprotektívne aktivity [20,22,23]. Predtým sa uvádzalo, že Ka inhibuje zápal v mikrogliálnych bunkách BV2 in vitro [24] a zvyšuje odolnosť DA neurónov voči neurozápalu in vivo [25]. Účinok Kaon LD na PD však ešte nebol skúmaný.

Vzhľadom na dôležitosť LD a úzke spojenie medzi LD, mitochondriami a autofágiou [16], ktoré sa všetky podieľajú na PD, predpokladáme, že Ka inhibuje peroxidáciu LD a zabraňuje neurodegenerácii DA pri PD. V tejto štúdii sme demonštrovali, že Ka významne chráni pred neurodegeneráciou v myšom modeli PD inhibíciou akumulácie LD. (cistanche prášok) Ďalšia štúdia odhalila, že Ka spustil autofágiu a znížil akumuláciu oxidovaných LD na zmiernenie mitochondriálnej dysfunkcie a mitochondriálnej produkcie ROS (mtROS), čím sa zabránilo apoptotickej smrti neurónov.cistanche propiedadesZistenia získané v tejto štúdii môžu pomôcť nasmerovať klinické rozhodnutia týkajúce sa použitia prirodzenej molekuly Ka v NDD, ako je PD.

2. Materiály a metódy

2.1. Pokusné zvieratá

Myši C57BL/6J (samci, 4-mesačný) boli získané z Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing).cistanche tubulosa beneficiosMyši boli udržiavané a chované v Centre zdrojov pre zvieratá Lekárskej fakulty Nanjingskej lekárskej univerzity a v zariadení pre zvieratá v nemocnici Nanjing Drum Tower Hospital. Myši majú voľný prístup k potrave a vode v miestnosti s okolitou teplotou 22 stupňov ± 2 stupne a cyklom svetlo/tma 12:12 h. Všetky postupy na zvieratách sa uskutočňovali v prísnom súlade s pokynmi National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

2.2. Činidlá

MPTP(M0896),3-MA(M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%) for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.0 percent ,96 353) pre experimenty in vitro bolo získaných od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861) a DHE (D11347) boli zakúpené od Thermo Fisher Scientific. Pre pokusy na zvieratách bol Ka rozpustený v roztoku 10 percent DMSO v 16 percentách SBE- -CD v sterilnom fyziologickom roztoku. Pre bunkové experimenty bol Ka pripravený v DMSO (Sigma-Aldrich) a PBS (konečná koncentrácia DMSO je 0,01 percenta), pH 7,4.

2.3. Indukcia a liečba metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridínom (MPTP)-indukovaného PD myšacieho modelu

Na vyhodnotenie účinkov Ka v PD modeli MPTP/p-toxicity boli myši (samce, vo veku 4-5 mesiacov) náhodne rozdelené do skupiny liečenej fyziologickým roztokom, skupiny liečenej MPTP, skupiny liečenej MPTP plus Ka a skupina liečená samotným Ka. V skupine liečenej MPTP myšiam dostávali chronické podávanie MPTP s protokolom podobným tomu, ktorý bol opísaný vyššie [26]: MPTP bol rozpustený vo fyziologickom roztoku a injikovaný subkutánne v dávke 25 mg/kg, po čom nasledovalo 250 mg/kg probenecidu (rozpusteného v dimetylsulfoxide). intraperitoneálna (ip) injekcia v intervaloch 1 h každé 3,5 dňa počas 5 týždňov. (koreň cistanche) Kontrolné myši dostali injekciu fyziologického roztoku a probenecidu. V skupine liečenej MPTP plus Ka dostávali myši Ka (50 mg/kg, jedna injekcia/deň počas experimentov, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Čína) intraperitoneálne (ip) denne 3 dni pred liečbou MPTP a počas 5 MPTP injekčné týždne. Týždeň po poslednej injekcii MPTP sa myši podrobili behaviorálnemu testovaniu zaslepenými voči skupinám. Potom boli všetky myši anestetizované 40 mg / kg pentobarbitalu sodného a usmrtené na detekciu mozgových proteínov a imunohistochémiu alebo analýzu qPCR.

2.4. Stereotaxická chirurgia in vivo a experimentálne liečby

Stereotaxický chirurgický zákrok pod anestéziou pentobarbitalom sodným (40 mg/kg, ip) sa uskutočnil tak, ako je opísané [25]. Myšia Atg5 a kontrolná shRNA boli transfekované baliacimi vektormi (AAV-U6-CMV-she-NA-EGFP), aby sa vytvoril AAV. Na mikroinjekciu sa anestetizované myši umiestnia do stereotaxického zariadenia. Bol im vstreknutý 1 μl AV sklenenou elektródou namierenou na DG (AP:-0,3 mm; ML: ±0,13 mm; DV:-0,45 mm） pri rýchlosti 0,25 ul/min. Potom sa ihla ponechala ďalšie 2- min. 2 týždne po mikroinjekcii vírusu sa myši podrobili MPTP-indukovanej PD modelovej vodivosti a (alebo) liečbe Ka.

Atg5 shRNA sa získala od Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. Pre ticho Atg5 boli priméry uvedené v doplnkovej tabuľke 1.

2.5. Behaviorálna analýza

Týždeň po poslednej injekcii MPTP alebo fyziologického roztoku sa vykonal rotačný a tyčový test, ako je opísané vyššie [27]. Pre test na rotarode sa myši aklimatizovali na rotarod v dvoch pokusoch (6 minút so zrýchlenou rýchlosťou 12-20 ot./min.) denne počas 2 po sebe nasledujúcich dní pred začiatkom experimentu. Potom boli myši testované pri 20 otáčkach za minútu počas 300 s počas ďalších 3 po sebe nasledujúcich dní. Latencia do poklesu bola zaznamenaná pomocou systému Rotarod Analysis System (Jiliang, Shanghai, Čína). Na test tyče boli myši umiestnené hlavou nahor na vrchol vertikálnej drevenej tyče (drsný povrch, výška 50 cm, priemer 1 cm). Všetky myši boli zvyknuté na prístroj 2 dni pred testovaním a potom boli testované trikrát na tretí deň. Zaznamenával sa celkový čas (T-celkom, kým myš nedosiahla zem svojimi štyrmi labkami) a čas obratu (T-otoč, kedy sa myš úplne otočila hlavou nadol). Experiment bol zaslepený voči skupinám myší pre každý behaviorálny test a test bol vykonaný trikrát.

2.6. Zbierka vzoriek mozgu

Po záverečných behaviorálnych testoch boli myši anestetizované pentobarbitalom sodným (40 mg/kg, ip). Pre analýzu qPCR, western blotting a vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu (HPLC) sa zo zvierat rýchlo extrahovali celé mozgy, potom sa rýchlo vyrezali tkanivá stredného mozgu a striata, ktoré sa vopred zmrazili tekutým dusíkom. Všetky vzorky sa skladovali pri -80 stupňoch až do analýzy.

Na imunohistochemickú analýzu boli myši perfundované transkardiálne 4 percentami paraformaldehydu (PFA). Mozgy boli extrahované, dodatočne fixované, dehydrované, vložené do OCT (Tissue-Tek) a sériové rezy mozgov boli narezané kryosekciou （30 μm na plátok） cez každú celú vrstvu a stredný mozog pomocou mraziaceho mikrotómu (Leica CM1950, Nussloch, Nemecko ). Všetky rezy boli zhromaždené v šiestich samostatných sériách a mozgové rezy boli uskladnené v 50 percentnom glyceríne a zmrazené na -20 stupeň až do analýzy.

Pre TEM boli myši perfundované 2,5 percentami glutaraldehydu a 2 percentami paraformaldehydu, ako je opísané 【12】. Malá porcia (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4="" ℃.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Imunohistochemická analýza

Mozgové rezy sa prepláchli v PBS a následne 3 percentami H2O2 počas 10 minúty, potom sa inkubovali s 0,3% Tritonom X-100 v PBS doplnenom 5 percentami BSA počas 1 hodiny. Potom sa sklíčka inkubovali s primárnymi protilátkami pri 4 stupňoch cez noc v PBS obsahujúcom 5 percent BSA pri 4 stupňoch cez noc, potom sa premyli a inkubovali v sekundárnych protilátkach počas 1 hodiny pri teplote miestnosti, nasledovala inkubácia s diaminobenzidínom (DAB) alebo montáž do DAPI (Life Technologies, Cat P36931) ako imunofluorescenčné farbenie počas 5 minút. Na farbenie Nissl sa sklíčka spojili v roztoku krezylovej fialovej (CV) (0,1 g krezylovej fialovej, 99 ml H20 a 1% kyseliny octovej 1 ml) na 30 minút pri teplote miestnosti, potom sa dehydratovali alkoholom a xylénom. Snímky boli pozorované a fotografie boli zachytené pod mikroskopom Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Spojené štáty americké). Celkový počet TH-pozitívnych a Nissl's-pozitívnych neurónov v SNpc sa získal sérologicky použitím metódy optického frakcionátora so softvérom MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7. Analýza vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC).

Vzorky striatálneho pruhu myší sa homogenizovali s {{0}},1 M kyselinou chloristou （1 mg tkanív v 100μL kyseliny chloristej） a 0,1 mM EDTA, spracovanou ultrazvukom a centrifugované pri 20, 000 otáčkach za minútu počas 30 minút, ako je uvedené [27]. Potom sa supernatant zhromaždil na meranie. Mobilná fáza je zmiešaný roztok pozostávajúci z 90 mM dihydrogenfosforečnanu sodného, ​​1,7 mM kyseliny 1-oktánsulfónovej, 50 mM citrátu, 50 uM EDTA, 10 percent acetonitrilu s prietokovou rýchlosťou 0,2 ml/min. Paralelne sa na výpočet kvantitatívnej štandardnej krivky pripravil zásobný štandardný roztok pre dopamín a kyselinu dihydroxyfenyloctovú (DOPAC) (Sigma-Aldrich, USA) v 0,1 M HClO4. Injikovalo sa množstvo 10 ul pripraveného supernatantu alebo štandardného roztoku. do mobilnej fázy a testované elektrochemickým detektorom ESA Coulochem III (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Merali sa vzorky a kvantifikovali sa piky. Koncentrácie monoamínov sa kvantifikovali porovnaním so štandardom pomocou softvéru ClarityChrom (Knauer, Nemecko) a následne obsahy vo vrstve boli prevedené podľa riediaceho pomeru. Štandardná krivka DA a DOPAC bola znázornená na doplnkovom obrázku 1a a b.

2.8. Bunkové kultúry a ošetrenia

Kultúry mezencefalických primárnych neurónov sa uskutočňovali tak, ako je opísané vyššie [12]. Stručne povedané, mezencefalické tkanivá myší C57BL/6 v embryonálny deň 14/15 (E14/15) boli opatrne odstránené, mechanicky disociované, aby sa odstránili membrány a veľké krvné cievy, a potom pitvané. Potom sa štiepili trypsínom-EDTA (Amresco, Solon, OH, USA) a potom sa filtrovali cez 100-um filter, čím sa získala jednobunková suspenzia. Následne boli bunky nanesené na poly-L-lyzínom vopred potiahnuté 12-/24-jamkové platne pri 2,5 × 10 stupňoch buniek/ml obsahujúce Neurobasal médium (Cat 21103049, GibcoTM , Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA) doplnený o B27 (2 percentá v:v, Cat 1750404, GibcoTM) a penicilín/streptomycín (0,5 percent v:v). Kultúry sa udržiavali vo zvlhčenej komore (37 stupňov, 5 percent CO2 inkubátor). Kultivačné médium sa menilo každé 3 dni a bunky je možné použiť po 7-10 dňoch.

Bunkové línie: Bunkové línie SH-SY5Y sa kultivovali v 10 percentách FBS a 1 percentách penicilínu/streptomycínu vo zvlhčenom inkubátore pri 37 stupňoch a 5 percentách CO2. V experimentoch boli bunky SH-SY5Y ošetrené MPP plus （200 μM） alebo rôznymi dávkami Ka (0,3,30,60,100,300,600uM) počas 24 hodín. Bunky SY5Y boli stimulované MPPt（400 μM） počas 24 hodín.Ka（30μM, 3h）s （alebo bez）3-MA（3mM, 1h）alebo -tokoferol） (50μM, 1 h, Sigma-Aldrich ）primované-SH-SH5Y bunky boli stimulované MPPT（200μM） počas 24 hodín.

2.9. Test životaschopnosti buniek CCK8

Zmenená životaschopnosť buniek pri liečbe Ka bola detegovaná súpravou Cell Counting Kit-8 (CCK-8 Kit, Selleck, Houston, TX, USA). Stručne povedané, bunky SHSY5Y boli nasadené do 96- doštička s jamkami a potom ošetrené rôznymi koncentráciami Ka（3, 30, 60, 100, 300, 600, 600 uM） počas 24 hodín. Potom sa do každej jamky pridalo 10 ul CCK-8 činidla na 4 hodiny. Nakoniec bola absorbancia detegovaná pomocou Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) pri 450 nm.

2.10. ATP test

Bunkové hladiny ATP sa detegovali pomocou súpravy ATP Bioluminescence Assay Kit (Beyotime Biotechnology Co., Čína) podľa pokynov výrobcu. Po ošetrení boli bunky lyzované a centrifugované pri 12, 000 rpm počas 5 minút pri 4 stupňoch a supernatanty boli zozbierané. Pracovný roztok （100 μl） sa pridal k 20 μl vzorky na 96-jamkovej doštičke a luminiscencia sa okamžite merala na automatickej čítačke mikrodoštičiek. Merania zo všetkých vzoriek boli normalizované na koncentráciu proteínu.

2.11. Na plus -K plus -ATPázový test

Na meranie Nat-K plus -ATPázy (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Čína) boli bunky sonikované a centrifugované pri 600 otáčkach za minútu počas 10 minút, aby sa získal supernatant. Pridali sa reakčné roztoky detekcie Nat-Kt-ATPázy a inkubovali sa podľa pokynov výrobcu. Potom sa detegovala absorbancia pri 660 nm. Merania všetkých vzoriek boli normalizované na koncentráciu proteínu.

2.12. Analýza Western blotting

Bunky alebo mozgové tkanivá boli lyzované v RIPA pufri (50 mM Tris (pH 7,4),cistanche คือ150 mM NaCl, 1 % NP-40 (FNN0021, Thermo), 0,5 % deoxycholát sodný (D6750, Sigma), 0,1 % SDS (74255, Sigma) doplnený proteázou a inhibítory fosfatázy (Roche, Shanghai, Čína). Koncentrácie proteínov boli stanovené pomocou súpravy Micro BCA Kit (Beyotime, Shanghai, China). 30-ug proteínu každej vzorky sa separovalo pomocou SDS-PAGE s použitím polyakrylamidových TGX gélov (Bio-Rad, Hercules, Kalifornia, USA) a potom sa prenieslo na polyvinylidéndifluoridové (PVDF) membrány (Millipore, Bedford, MA). Po blokovaní sa membrány PVDF inkubovali s rôznymi špecifickými primárnymi protilátkami v TBST pri 4 stupňoch cez noc, potom sa premyli a inkubovali v zodpovedajúcich sekundárnych protilátkach konjugovaných s chrenovou peroxidázou (HRP) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Imunoreaktívne pásy boli vizualizované a detegované zosilnenou chemiluminiscenciou (ECL) plus detekčným činidlom (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) a analyzované pomocou zobrazovacieho systému ImageQuantTM LAS 4000 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA).

2.13. Kvantitatívna (Q) a reverzná transkripcia (RT)-PCR v reálnom čase

Celková RNA bola extrahovaná z mozgových tkanív a kultivovaných buniek pomocou činidla Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Reverzná transkripcia sa uskutočnila pomocou reagenčnej súpravy TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa, Japonsko). qPCR v reálnom čase sa uskutočnilo s použitím SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) v prístroji StepOnePlus (Applied Bio-systems). Priméry boli zakúpené a overené generálom (Shanghai, Čína). Priméry použité pre qPCR boli uvedené v doplnkovej tabuľke 2.

Tento článok je extrahovaný z Redox Biology 41 (2021) 101911