štúdie ukázali, že autofágia hrá dôležitú úlohu v regulácii bunkového ukladania LD časť 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

2.14. Test laktátdehydrogenázy (LDH).

Podľa inštrukcií výrobcu boli bunky nanesené na 96-jamkovú platňu v množstve 5 000 buniek/jamku a kultivačné médium bolo zozbierané na meranie hladín LDH pomocou testovacej súpravy (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Potom bola detegovaná absorbancia vzoriek pomocou Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) pri 450 nm.

2.15. BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11 a MitoTracker sýtočervené farbenie

Živé bunky boli premyté PBS a inkubované s 2 ug/ml BOD-IPY 493/503 (InvitrogenTM, Cat D3922) alebo BODIPY 581/591 C11 (BD-C11））(2).{15}} μM, InvitrogenTM, Cat D3861）v PBS počas 15 minút pri 37 stupňoch Na farbenie MitoTracker Deep Red sa živé bunky inkubovali s 0,5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) v PBS počas 30 minút. boli dvakrát premyté v PBS a fixované v 3,5 percentnom PFA počas 10 minút, potom nasledovalo premytie a kontrastné farbenie s Hoechst 3342 (Sigma, kat. B2261) počas 10 minút pred tým, ako boli pokryté na sklíčka na zobrazovanie.koľko cistanche vziaťObrázky boli pozorované a fotografie boli zachytené fluorescenčnou mikroskopiou (Olympus, Tokio, Japonsko).

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

2.16. Farbenie Hoechst a PI

Bunky boli zafarbené s Hoechst 33,342 (1 ul zriedený v 5 00 ul PBS, Sigma, Cat B2261) a (alebo) PI （0,1 ul zriedený v 500 ul PBS, Solarbio, (cistanche spánok) CA1020 a) na 10 min. potom fixované a pozorované fluorescenčnou mikroskopiou (Olympus, Tokio, Japonsko).

2.17.Prietoková cytometria

Bunky boli štiepené a premyté D-hank's, potom zafarbené annexinom V-FITC（5 ul zriedených v 500 ul PBS）/PI （0,1 ul zriedených v 500 ul PBS) apoptóznou súpravou (CA1020, Solarbio, Beijing, Chian ) podľa protokolu výrobcu. Potom sa apoptotické bunky analyzovali pomocou prietokovej cytometrie (guava easyCyterM 8, Millipore, USA). Merania mitochondriálneho ROS a mitochondriálneho membránového potenciálu sa uskutočnili tak, ako bolo publikované 【12】. Bunky SH-SY5Y boli zafarbené MitoSOX (2,5 μM, Invitrogen, USA) alebo JC1 (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, USA) pri 37 stupňoch počas 30 minút. Po dvojnásobnom premytí PBS boli bunky resuspendované v studenom PBS obsahujúcom 1 percento FBS na analýzu prietokovou cytometriou. Údaje sa analyzovali pomocou softvéru FCS Express (Guava Easy CyterM8, Millipore, Hayward, CA, USA).

2.18. Respiračné testy morského koníka

Mitochondriálna respiračná funkcia v živých SH-SY5Y bunkách bola meraná pomocou analyzátora extracelulárneho toku Seahorse (XFe96) (Agi-lent, Santa Clara, USA) prostredníctvom zmien v rýchlosti spotreby kyslíka (OCR). Bunky SH-SY5Y naočkované v množstve 3 x 103 buniek/jamka sa nechali priľnúť na doštičky s bunkovou kultúrou Seahorse a dosiahli približne 80 percent konfluencie v čase experimentu. (cistanche čaj) Nasledujúci deň boli bunky vopred ošetrené Ka a potom vystavené MPP* ďalších 24 hodín. OCR sa detegoval za bazálnych podmienok, po ktorých nasledovalo sekvenčné pridanie 1 μM oligomycínu, 1 μM FCCP, ako aj 1 μM rotenónu a antimycínu A.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

2.19. Štatistická analýza

Údaje boli prezentované ako priemer ± SEM. Významnosť rozdielu bola stanovená Studentovým t-testom, dvojcestnou analýzou rozptylu alebo jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Tukeyho post hoc test. Rozdiel bol považovaný za významný u P<>

3. Výsledky

Výsledok1. Ka obnovuje motorickú dysfunkciu a zvyšuje hladiny dopamínu v striate myší s modelom MPTP/p PD

Aby sa preskúmal neuroprotektívny účinok patogenézy Kaon PD, 4-mesačným samcom myší C57BL/6 bol injikovaný neurotoxín MPTP na vytvorenie modelu MPTP/p PD a boli liečení Ka (obr. la). Po modelovej indukcii sa test na rotarode a test na tyči použili na vyhodnotenie motorického a behaviorálneho výkonu myší v rôznych skupinách. Ako je ukázané, čas výkonu rotarodu bol výrazne znížený u myší liečených MPTP a tomuto efektu zabránil Ka (obr. 1b). (prínosy cistanche tubulosa) Ka tiež obnovila behaviorálne deficity vyvolané MPTP, ako naznačujú skrátenie času otáčania a celkového času v teste na tyči (obr. 1c a d), bez ovplyvnenia telesnej hmotnosti myší (obr. le). Okrem toho, HPLC analýza ukázala, že hladina dopamínu v striate bola významne znížená u myší infikovaných MPTP/p a táto hladina bola obnovená liečbou Ka (obr. 1f). (extrakt cistanche tubulosa) Liečba Ka tiež zmiernila MPTP/ p-indukované zníženie hladín kyseliny dihydroxyfenyloctovej (DOPAC, metabolit dopamínu) v striate (obr. 1g).superman byliny cistancheTieto výsledky naznačujú, že Ka obnovuje motorickú dysfunkciu a zvyšuje hladiny dopamínu v striate u MPTP-indukovaných PD myší.

Výsledok 2. Ka zmierňuje stratu DA neurónov u SNpc myší s modelom MPTP/p PD

Ďalej, aby sme ďalej vyhodnotili neuroprotektívny účinok poškodenia DA neurónov vyvolaného Kaon MPTP/p, skúmali sme neuróny tyrozínhydroxylázy (TH) v myšacom SNpc imunofarbením. Ako je znázornené na obr. 2a a b, MPTP/p indukoval významné zníženie počtu TH neurónov, ktoré bolo zmiernené liečbou Ka. Ďalej, stereologické počty celkových neurónov v SNpc, ako ich definoval Nissl

Obr.1. Liečba Ka zmierňuje motorickú dysfunkciu a zvyšuje hladiny dopamínu v striate myší s modelom MPTP/p PD.

(a) Schematický diagram experimentálneho dizajnu. (cistanche tubulosa reddit) (b) Čas na tyči sa meral pre test rotarod tri po sebe nasledujúce dni. (cd) Čas potrebný na otočenie sa (čas otočenia) a zostup tyče (čas stúpania) bol zaznamenaný pre test na tyči. (e) Telesné hmotnosti myší sa merali na konci štúdie. (fg) Dopamín (DA) a kyselina dihydroxyfenyloctová (DOPAC) v striate boli analyzované vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM.n=9-10 pre každú skupinu v (b,c,d);n=6-8 pre každú skupinu v (f,g).ns, nevýznamné,* P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,kaempferol.="" staining,="" verified="" that="" the="" loss="" of="" th+="" cells="" reflected="" cellular="" death="" but="" not="" the="" downregulation="" of="" th="" expression="" and="" showed="" that="" ka="" treatment="" restored="" the="" decrease="" in="" the="" number="" of="" nissl-positive="" neurons="" in="" the="" snpc="" of="" mptp-treated="" mice="" from="" 43.3%="" to="" 25.4%="" (fig.="" 2c="" and="" d).in="" addition,="">výhody bioflavonoidovKa významne zlepšila MPTP-indukovanú redukciu expresie TH a DAT proteínu, ako bolo merané Western blotom (obr. 2e-g). Tento dôkaz potvrdzuje neuroprotektívny účinok Kaonu na myšom modeli PD.

Výsledok 3. Ka znižuje akumuláciu LD vakuol a oxidačný stres v SNpc myší liečených MPTP/p

Čoraz viac dôkazov preukázalo zapojenie LD do NDD [10], naša predchádzajúca práca konzistentne identifikovala zvýšené LD v SNpc myší s PD indukovanou MPTP [12]. LD sa dajú ľahko identifikovať a vykazujú okrúhle štruktúry s nízkou hustotou s homogénnymi amorfné obsahy [28]. Normálne môžu byť LD degradované autofágiou, aby sa zabránilo akumulácii [29].kúpiť cistancheAby sa zistilo, či Ka môže regulovať LD v PD, akumulácia LD sa analyzovala transmisnou elektrónovou mikroskopiou (TEM) v SNpc kontrolných, MPTP/p a MPTP/p ＋ Ka myší. Ako je uvedené v našej predchádzajúcej práci [12], počet a veľkosť LD boli

zvýšené u MPTP/p myší v porovnaní s kontrolami ošetrenými fyziologickým roztokom (obr. 3a a b) a boli významne znížené u myší ošetrených Ka (obr. 3c-e). Okrem toho u myší liečených Ka boli LD častejšie pozorované aj v blízkosti, uzavreté alebo degradované autolyzozómami, ktoré boli definované ako granuly lipofuscínu s hustotou elektrónov. Ďalšie histologické farbenie TH neurónov pomocou BODIPY, farbiva, ktoré špecificky označuje neutrálne lipidy a bežne sa používa na detekciu LD [30], ukázalo, že počet aj veľkosť BODIPY plus LD v SNpc boli vyššie u PD myší ako u kontrol, a boli významne znížené ošetrením Ka (obr. 3f-h).

Ak nie je možné degradovať LD včas, nahromadené LD môžu podliehať peroxidácii a prispievať k mitochondriálnemu stresu sprostredkovanému ROS [4],vzdialenosťktorý zosilňuje neurotoxicitu a progresiu ochorenia. Preto sme ďalej skúmali expresné profily génov spojených s ochranou proti toxicite voľných FA (Gpx8), neutralizačnými oxidačnými druhmi, superoxidovými radikálmi (Sod3) a peroxidom vodíka (Cat) a metabolizmom FA (Acsbg1 a Dbi), ako bolo uvedené [31]. , pričom všetky boli nápadne znížené u SNpc myší liečených MPTP v porovnaní s kontrolami a tieto účinky sa zlepšili u myší s PD liečených Ka (obr. 3i). Podobne MPTP/p tiež zvýšil hladiny expresie mRNA

Obr.2. Ka zlepšuje stratu DA neurónov u SNpc myší s modelom MPTP/p PD.

(ab) Mikrofotografie neurónov pozitívnych na tyrozínhydroxylázu (TH) (a) a stereologické počty neurónov pozitívnych na TH v substantia nigra pars compacta (SNpc) (b). Mierkové pruhy sú uvedené. (cd) Mikrofotografie buniek pozitívnych na krezylovú fialovú (c) a stereologické počty buniek pozitívnych na krezylovú fialovú v SNpc (d). Mierka, 120 um. (napr.) Western blot analýza expresie TH a DAT proteínu v SNpc (e) a kvantitatívna analýza (f,g). Kvantifikované údaje sú normalizované na kontrolnú skupinu s fyziologickým roztokom. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM.*P<><0.01, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydroloyridine..="" (for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" nox1,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Výsledok 4. Ka chráni bunky SH-SY5Y proti apoptóze indukovanej MPP plus

MPP, aktívny metabolit MPTP, inhibuje enzýmy mitochondriálneho komplexu a spôsobuje bunkovú smrť, ktorá je priamo spojená s PD [32]. Ďalej sme skúmali, či Ka môže zabrániť apoptóze neurónov indukovanej MPPt in vitro. Ako je znázornené na obr. 4a a b, MPPt (40 uM, 24 h) indukoval uvoľnenie LDH z buniek SH-SY5Y a Ka(30 a 60 uM) významne zoslabil uvoľňovanie LDH bez ovplyvnenia prežitia buniek (obr. 4a). Pretože Ka vyvolal podstatný ochranný účinok pri koncentrácii 30 μM (obr. 4b), túto koncentráciu sme použili v nasledujúcich experimentoch. Výsledky farbenia Hoechst/PI tiež ukázali, že Ka významne znížilo percento buniek s MPPt-indukovanou kondenzáciou chromatínu (obr. 4c a d) a bunkovou apoptózou, čo dokazuje zvýšená intenzita fluorescencie Hoechst (obr. 4c) a percento Bunky zafarbené Hoechst/PI (Hoechst plus /PI') (obr. 4e). Tiež, ako sa detegovalo prietokovou cytometriou, MPP plus indukovala bunkovú apoptózu, dokázanú zvýšeným percentom buniek zafarbených annexinom V (AV/PI a AV plus/PI plus), bola chránená Ka (obr. 4f a g). Okrem toho Ka výrazne zvrátil MPP-indukované zmeny v expresii proteínu súvisiaceho s apoptózou, čo dokazuje upregulácia Bcl-2, downregulácia Bax (obr. 4hi-j) a znížené štiepenie kaspázy-3 (obr. 4h, k). Tieto údaje naznačujú, že Ka môže zrušiť škodlivé účinky MPPt na prežitie buniek.

Výsledok 5. Ka potláča akumuláciu LD indukovanú MPPt a peroxidáciu lipidov, ktoré sprostredkovávajú mitochondriálne poškodenie v bunkách SH-SY5Y

Nedávne štúdie ukázali, že neočakávaná akumulácia LD môže viesť k zvýšenému stresu sprostredkovanému peroxidáciou lipidov a urýchliť mitochondriálnu dysfunkciu, ktorá podporuje neurodegeneráciu [10]. Naša predchádzajúca práca tiež ukázala, že zvýšené LD v SNpc boli spojené s patológiou PD u myší [12]. Aby sme zistili, či ochranný účinok Ka súvisel s akumuláciou LD in vitro, najprv sme vykonali LD-špecifické farbenie v SH-SY5Y bunkách pomocou BODIPY 493/503 a pozorovali sme zvýšenú depozíciu LD (zvýšené hladiny neutrálnych lipidov)

Výsledok 6. Ka podporuje autofágiu a znižuje produkciu mtROS v bunkách SH-SY5Y ošetrených MPP plus

Normálne sa LD dodávajú do lyzozómov autofágiou a môžu sa rozdeliť na FA, aby sa zabránilo peroxidácii. Dôkazy však naznačujú, že autofágia je narušená, čo hrá kľúčovú úlohu pri PD [2]. Keď autofágia zahŕňa porciovanie LD, ktoré sa má rozložiť v lyzozómoch (obr. 6a), tento proces sa špecificky nazýva lipofágia [2]. Aby sme zistili, či sa autofágia podieľa na neuroprotektívnom účinku Ka, skúmali sme hladiny proteínov spojených s autofágiou. Ako je znázornené na obr. 6b-d, v kultivovaných bunkách SH-SY5Y bola hladina ľahkého reťazca 3 (LC3)-II asociovaného s mikrotubulami výrazne znížená, zatiaľ čo expresia p62 bola výrazne zvýšená v bunkách ošetrených MPP plus, merané imunoblotovaním a tento účinok bol významne zvrátený Ka. Ďalej sme skúmali zmeny v autofágii imunofarbením na LC3. Aby sa umožnilo akumulovať autofagozómy v bunkách, pridal sa bafilomycín, aby sa zabránilo fúzii autofagozómov s lyzozómami. Ako je ukázané, v bunkách ošetrených MPP* bol detegovaný zvýšený počet LC3b puncta, čo naznačuje zhoršenú autofagickú degradáciu a tento účinok bol tiež zvrátený pomocou Ka (obr. 6e a f). Tieto výsledky naznačujú, že LD v bunkách SH-SY5Y sú mobilizované autofágiou na prípadné odstránenie a že Ka môže podporovať autofágiu, aby sa znížila akumulácia oxidovaných lipidov. Zvýšená peroxidácia lipidov môže zhoršiť poškodenie mitochondrií zvýšením mitochondriálneho oxidačného stresu [4]. Okrem toho liečba Ka významne znížila robustnú generáciu mtROS, ako sa určilo farbením MitoSOX (obr. 6g a h), a znížilo počet dysfunkčných mitochondrií, ako sa určilo značkami špecifickými pre mitochondrie na rozlíšenie dýchania (MitoTracker tmavočervené) a celkového ( MitoTracker zelená) mitochondrie (obr. 6i a j). Okrem toho, aby sme mali priamy pohľad na mitochondriálne zmeny, ďalej sme zistili rýchlosť spotreby kyslíka (OCR) pomocou analyzátora Seahorse XF. Ako je znázornené na obr. 6k, mitochondriálne dýchanie bolo znížené v bunkách ošetrených MPPt, zatiaľ čo ošetrenie Ka zjavne obracia toto poškodenie spôsobené MPP plus (obr. 6k).

Výsledok7. Inhibícia autofágy zvráti supresívny účinok akumulácie Kaon LD, mitochondriálnej dysfunkcie a poškodenia DA neurónov in vitro

Na preskúmanie, či je autofágia jedným z hlavných mechanizmov, ktorými Ka sprostredkúva DA neuroprotekciu, sa použil inhibítor autofágie 3-MA. Zistili sme, že inhibičné účinky Ka na poškodenie vyvolané MPP#, vrátane zníženej akumulácie LD (obr. 7a a b), zníženej produkcie mtROS (obr. 7c a d) a zmiernenia mitochondriálnej dysfunkcie (obr. 7e a f) v Bunky SH-SY5Y boli významne blokované 3-MA. Pretože oxidácia LD a mitochondriálna dysfunkcia sú úzko spojené so smrťou DA neurónov, ďalej sme skúmali primárne kultivované neuróny DA. Kultivované mezencefalónové TH plus neuróny sme ošetrili Ka a/alebo MPPf a kvantifikovali sme počet a dĺžku TH plus neurónových procesov imunofarbením. Morfologická analýza odhalila, že počet a dĺžka neurónových procesov boli výrazne znížené pomocou MPP plus a chránené pomocou Ka a táto ochrana bola ďalej zvrátená pomocou 3-MA (obr. 7g-i). Tieto údaje naznačujú, že Ka zmierňuje poškodenie DA neurónov podporou autofágie.

Výsledok 8. Umlčanie Atg5 zrušilo Ka-sprostredkovanú prevenciu straty neurónov in vivo

Aby sme ďalej potvrdili, že Ka chráni pred MPTP/p-indukovanou TH plus stratou neurónov spôsobom závislým od autofágie, umlčali sme Atg5 mikroinjekciou adeno-asociovaného vírusu (AAV) exprimujúceho predtým charakterizovanú shRNA proti Atg5 do bilaterálneho mezencefalu (obr. .8a), ako už bolo opísané [25]. V predbežných experimentoch sme pozorovali, že transfekcia Atg5 shRNA počas 2 týždňov dosiahla dostatočnú expresiu GFP v TH plus neurónoch (obr. 8b) a inhibovala expresiu ATG5 v SNpc injikovaných myší (obr. 8c). Zistili sme, že Atg5-knockdown zvrátil neuroprotektívny účinok Ka, čo dokazuje zvýšená expresia proteínu TH (obr. 8d a e) a zvýšený počet TH plus neurónov (obr. 8f a g). Tieto údaje ďalej podporujú príspevok autofágie k ochrannému účinku Ka u PD myší. Na záver sme potvrdili, že Ka chráni pred MPTP / p-indukovaným poranením znížením oxidácie LD a mitochondriálnej dysfunkcie podporou autofágie.

4. Diskusia

Táto štúdia ukázala, že prirodzená malá molekula Ka bola kľúčovým faktorom, ktorým by autofagická signalizácia mohla inhibovať oxidačnú toxicitu lipidov. Naše výsledky ukázali, že autofágová dráha je kľúčovou regulačnou slučkou, prostredníctvom ktorej Ka zmierňuje peroxidáciu LD a následné poškodenie mitochondrií, a zamerala sa na úlohu autofagiou regulovanej toxicity LD pri zmierňovaní mitochondriálneho poškodenia pri predchádzaní neurodegenerácii v dôsledku nadmerného oxidačného stresu (obr. 9).

LD sú intracelulárne miesta ukladania neutrálnych lipidov [5] a sú rozhodujúce pre metabolizmus lipidov a energetickú homeostázu, zatiaľ čo dysfunkcia LD je spojená s mnohými chorobami [16]. Hromadné dôkazy naznačujú, že úlohy, ktoré LD hrajú v biológii a patológii, sú podstatne širšie, ako sa pôvodne predpokladalo. V CNS dôkazy ukázali, že zvýšené LD v neurónoch a gliách sa podieľajú na neurodegeneratívnej patológii [10,36]. Podrobne, LD boli detegované v axónoch neurónov Aplysia kultivovaných in vitro [37] a v rezoch mozgu z Modely Huntingtonovej choroby [38]. Okrem toho sa ukázalo, že neuróny sú obzvlášť citlivé na toxicitu lipidov a akumulácia LD, ktorú nemožno odstrániť včas, vedie k zrýchlenej peroxidácii LD a môže viesť k neurodegenerácii [17].

Akumulácia lipidov v hyperaktívnych neurónoch je toxická nielen kvôli náchylnosti týchto lipidov na peroxidáciu. Okrem toho môže obsah nadbytočných LD vstúpiť do neoxidačných metabolických dráh, čo spúšťa nadmernú produkciu ceramidu, ktorý je toxický pre bunky [39]. Nedávne štúdie tiež ukázali, že v LD-defektných bunkách môžu byť FA premenené na acylkarnitíny, ktoré potom spôsobujú mitochondriálnu dysfunkciu a produkciu ROS [40]. Tieto procesy budú mať pravdepodobne špecifické a hlboké dôsledky v hyperaktívnych neurónoch, pretože dysfunkčné mitochondrie ohrozujú kapacitu spotreby FA a produkcia mtROS ďalej spôsobuje peroxidáciu membránových lipidov.

Homeostáza LD by teda mala byť dobre kontrolovaná v neurónoch, čo je rozhodujúce pre zabránenie toxicite a v konečnom dôsledku udržanie zdravia mozgu. V tejto štúdii sme zistili, že malá prírodná molekula Ka inhibuje neuronálnu toxicitu LD, ktorá sa prejavuje ako zvýšená akumulácia LD, zvýšená peroxidácia lipidov a zvýšená expresia génov súvisiaca s toxicitou lipidov v bunkách SH-SY5Y urazených MPP#. Ešte dôležitejšie je, že sme tiež ukázali, že liečba Ka znižuje 45]. V tejto štúdii sme pozorovali defektnú autofágiu/lipofágiu v neurónových bunkách poškodených MPPt, vrátane znížených hladín LC{6}}II a zvýšenej expresie p62 a zvýšený počet LC3B puncta uložených v bunkách. Defektná lipofágia v poškodených bunkách SH-SY5Y bola zvrátená pôsobením Ka. V dôsledku toho Ka znížil akumuláciu oxidovaných LD, poškodených mitochondrií a tvorbu mtROS v bunkách SH-SY5Y ošetrených MPP#. Dôležité je, že inhibícia autofágie pomocou 3-MA zrušila Ka-sprostredkovanú elimináciu oxidovaných LD a poškodených mitochondrií a zmiernenie poškodenia DA neurónov in vitro. Okrem toho inhibícia autofágie knockdownom Atg5 in vivo zvrátila ochranné účinky degenerácie neurónov Kaon DA v myšom modeli PD indukovanej MPTP. Súhrnne tieto zistenia naznačujú, že Ka inhibuje mitochondriálne poškodenie súvisiace s toxicitou LD podporou autofágie v experimentálnom modeli PD.

Hromadné dôkazy naznačujú, že zvýšená tvorba mtROS je primárnou charakteristikou neurónov s vysokou aktivitou a bola pozorovaná u mnohých NDD vrátane PD [46]. Správy o tom, či je ROS príčinou alebo dôsledkom tvorby LD, sú rozporuplné [47,48]. Je zaujímavé, že naše výsledky in vitro ukázali, že farmakologická inhibícia peroxidácie LD o-tokoferolom zabránila generácii mtROS a abnormalitám potenciálu mitochondriálnej membrány a zmiernila mitochondriálne redukcie, čo dokazuje farbenie Tomm20 v bunkách SH-SY5Y, čo podporuje myšlienku, že peroxidácia LD hrá úlohu príčinnú úlohu v mitochondriálnej dysfunkcii indukovanej MPP a tvorbe mtROS. Je však možné, že zvýšené ROS spočiatku urýchľujú tvorbu LD a následne LD indukujú ďalšiu tvorbu ROS a exacerbujú intracelulárne a mitochondriálne hladiny ROS.

V tejto štúdii sme ukázali, že myši s PD indukovanou MPTP mali vysoké hladiny akumulácie LD, čo bolo sprevádzané zvýšenou stratou DA neurónov, zrýchleným stresom sprostredkovaným ROS a deficitmi správania. Liečba Ka zabránila toxicite LD in vitro a zlepšila stratu DA neurónov a deficity správania v myšom modeli PD a tieto účinky boli závislé od autofágie. Preto je rozumné dospieť k záveru, že Ka podporuje autofágiu a táto zvýšená autofágia znižuje oxidovanú akumuláciu LD, znižuje produkciu mtROS a zmierňuje mitochondriálne poškodenie v DA neurónoch, čo prispieva k inhibícii toxicity LD, čím sa zmierňuje patológia PD (obr. 9).

Financovanie

Tento výskum bol podporený grantmi Národnej nadácie pre prírodné vedy v Číne (č. 81903587), projektom financovaným Čínskou postdoktorandskou vedeckou nadáciou (č. 2019M661807), Nadáciou prírodných vied v provincii Jiangsu (č. BK20190120) a Open Project of Chinese Materia Medica First Class Discipline of Nanjing University of Chinese Medicine (č. 2020YLXK006) a Drug Innovation Major Project (č. 2018ZX09711001-003-007).

Tento článok je extrahovaný z Redox Biology 41 (2021) 101911