Jabuticaba (Myrciaria Jaboticaba) Kôra ako udržateľný zdroj antokyánov a elagitanínov dodávaných fosfolipidovými vezikulami na zmiernenie oxidačného stresu v ľudských keratinocytoch, časť 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

2.3. In vitro štúdie s keratinocytmi

2.3.1.Biokompatibilita vezikúl

Štúdia vykonaná na vyhodnotenie fyzikálno-chemických vlastností transferzómov, najmä tých, ktoré sú obohatené o polyméry, potvrdila ich väčšiu stabilitu a ideálnu veľkosť na aplikáciu na kožu. Akýkoľvek dôležitý rozdiel bol zistený ako funkcia koncentrácií polyméru (1 alebo 2 mg/ml). Aby sa to vyhodnotilo, použili sa vezikuly modifikované najvyššou koncentráciou polyméru (2 mg/ml) na uskutočnenie nasledujúcich štúdií. Ich biokompatibilita bola hodnotená pomocou keratinocytov a tiež bola hodnotená biokompatibilita extraktu vo vodnej disperzii a použitá ako porovnanie. Keratinocyty boli vybrané, pretože sú najreprezentatívnejšími bunkami epidermy a použilo sa vrstvenie, pretože vo svojej špeciálnej diferenciácii tvoria hlavnú bariéru pokožky, ktorá reguluje hydratáciu pokožky a zabraňuje prenikaniu exogénnych látok do a skrz to. Keratinocyty boli ošetrené 48 hodín extraktom v disperzii alebo inkorporovaným do vezikúl v štyroch rôznych riedeniach, po ktorých bola meraná životaschopnosť buniek (obrázok 3). Životaschopnosť buniek inkubovaných s extraktom v disperzii bola ~ 88 percent (str<0.05 versus="" the="" viability="" measured="" using="" extract="" loaded="" vesicles),="" indicating="" that="" the="" extract="" is="" not="" toxic.="" the="" viability="" of="" cells="" treated="" with="" extract-loaded="" transfersomes="" and="" hyaluronan-transfersomes="" at="" higher="" dilutions="" was~100%="" (p="">0.05 v tejto skupine). Ošetrenie transferzómami HEcelulózy a transferzómami hyalurónanu ďalej zlepšilo životaschopnosť buniek. Všetky formulácie boli vysoko biokompatibilné bez ohľadu na použitý polymér a riedenie. V skutočnosti bola životaschopnosť buniek rovná alebo vyššia ako 100 percent, dokonca vykazovala proliferatívny účinok spojený s naložením vezikúl.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

2.3.2. Ochranný účinok extraktu, v disperzii alebo naplnenom vo vezikulách, proti poškodeniu vyvolanému v keratinocytoch peroxidom vodíka

Keratinocyty boli zaťažené peroxidom vodíka a potom ošetrené extraktom buď v disperzii alebo naplnené do transferzómov. Životaschopnosť buniek sa merala po 4 hodinách a to sa použilo na vyhodnotenie ochranného účinku formulácií proti oxidačnému stresu (obrázok 4). Vzorky sa zriedili bunkovým médiom, aby sa dosiahli dve rôzne koncentrácie (4 a 0,4 ug/ml). Stres peroxidom vodíka spôsobil vysokú úmrtnosť buniek a znížil životaschopnosť až o ~ 50 percent (str<0.05 versus="" the="" viability="" of="" cells="" treated="" with="" the="" extract="" in="" dispersion="" or="" loaded="" in="" vesicles)[35].="" hydrogen="" peroxide="" is="" considered="" one="" of="" the="" most="" dangerous="" oxidative="" molecules="" among="" the="" different="" reactive="" oxygen="" species,="" capable="" of="" promoting="" apoptosis="" and="" cell="" death.="" the="" treatment="" of="" stressed="" cells="" with="" the="" aqueous="" dispersion="" of="" the="" extract="" was="" capable="" of="" reducing="" the="" damaging="" effect="" of="" hydrogen="" peroxide="" as="" the="" viability="" increased="" up=""><0.05 versus="" the="" viability="" of="" cells="" treated="" with="" the="" extract="" loaded="" in="" hecelluose-transfersomes="" at="" a="" higher="" dilution="" and="" hyaluronan-transfersomes),="" although="" the="" complete="" restoration="" of="" normal="" conditions="" was="" not="" achieved="" (figure="" 4).="" treatment="" with="" the="" extract-loaded="" transfersomes="" protected="" the="" cell="" to="" the="" same="" extent="" as="" the="" extract="" in="" dispersion="" (~82%,p="">0.05 oproti životaschopnosti buniek ošetrených disperziou). Ošetrením s najlepším výsledkom bol extrakt naplnený HEcelulózovými transferzómami (pri vyššom riedení) a hyaluronanovými transferzómami, ktorý dosiahol životaschopnosť ~ 104 percent (p<0.05 versus="" the="" values="" of="" other="" treatments).="" the="" restored="" normal="" conditions="" and="" even="" slightly="" promoted="" cell="" proliferation,="" probably="" due="" to="" the="" synergic="" effect="" of="" the="" extract="" and="" the="" polymer-immobilized="" vesicles.="" the="" vesicle="" behavior="" was="" not="" affected="" by="" the="" dilution="" levels="" of="" the="">

2.3.3. Účinky na hojenie rán in vitro

In vitro test poškriabania sa uskutočnil s monovrstvou keratinocytov, aby sa overila schopnosť extraktu vo vodnej disperzii alebo inkorporovanom do vezikúl stimulovať proliferáciu a migráciu buniek. Prázdne vezikuly neboli testované, pretože v predchádzajúcej štúdii nebolo zistené žiadne zlepšenie hojenia rán, keď sa použili prázdne hyalurozómy [37]. Uzavretie rany sa monitorovalo počas 48 hodín (obrázok 5) a percento uzavretia sa vypočítalo meraním oblastí lézií (obrázok 6). K uzavretiu rany neošetrených buniek došlo veľmi pomaly – 13 percent po 24 hodinách, 28 percent po 36 hodinách a iba 40 percent po 48 hodinách. Ošetrenie extraktom vo vodnej disperzii mierne zlepšilo proces a prinieslo uzavretie po 48 hodinách na 50 percent. Ošetrenie vezikulami naplnenými extraktom po 48 hodinách dosiahlo 90 percentné uzavretie pri použití transferzómov a HEcelulózových transferzómov a približne 100 percentné uzavretie pri použití hyaluronanových transferzómov. Ako môžeme vidieť, uzavretie rany bolo takmer úplné, čo potvrdilo obnovujúce vlastnosti transferzómov hyalurónanu naplnených extraktom.

Naše celkové výsledky potvrdili vysokú biokompatibilitu transferzómov hyalurónanu, ktoré boli tiež najúčinnejšie pri stimulácii proliferácie a migrácie kožných buniek a pôsobili proti poškodeniu spôsobenému v koži oxidačným stresom.

3. Materiály a metódy 3.1. Materiály

Lipoid S75 (pozostávajúci z ~ 70 percent sójového fosfatidylcholínu, 9 percent fosfatidyletanolamínu a 3 percent lyzo-fosfatidylcholínu) bol zakúpený od Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Nemecko). Hyaluronát sodný s nízkou molekulovou hmotnosťou (200-400 kDa) a polydisperzita 1,4 Mw/Mn, bola zakúpená od DSM Nutritional Products AG Branch Pentapharm (Švajčiarsko). Tween 80, glycerol, radikál DPPH (2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl), hexahydrát chloridu železitého, kyselina galová, kyselina chlorogénová a kyselina askorbová, katechín, tetrazóliová soľ, 3-(4,{ {15}}dimetyltiazol-2-vl)-2,5-difenyltetrazóliumbromid (MTT), kvercetín, neosporín, Folin-Ciocalteuovo fenolové činidlo,2,4,6-tris( 2-pyridyl)-S-triazín (TPTZ) a pvrokatecholová fialová boli zakúpené od Sigma-Aldrich (Milán, Taliansko). Hexakyanoželezitan draselný (ⅢI) sa získal od spoločnosti Merck (Darmstadt, Nemecko). Bezvodý octan sodný, pentahydrát síranu meďnatého a dihydrát chloridu meďnatého boli získané od VWR Chemi-cals BDH⑧ (Frankfurt, Nemecko). Kyanidín 3-O-glukozid (väčší alebo rovný 95 percent) a delfinidín 3--glukozid (väčší alebo rovný 95 percentám) boli zakúpené od spoločnosti Extrasynthese (Lyon, Francúzsko). Ľadová kyselina octová a kyselina fosforečná (85 percent) boli získané od JTBaker (Mallinckrodt Baker Inc., Utrecht, Holandsko). Všetky činidlá a plasty pre bunkovú kultúru boli zakúpené od Life Technologies Europe (Monza, Taliansko).

3.2. Jabuticaba Pees: extrakcia, chemická charakteristika a antioxidačná aktivita

Plody jabuticaba (Myrciaria jabuticaba (Vell.)O.Berg)cv. Sabara bola zozbieraná v štádiu zrelosti v meste Araucaria, Paranå, Brazília（geografické súradnice∶25 stupeň 2924,7" S49 stupeň 2637,8"W) v decembri 2018. Plody boli umyté a dezinfikované (NaOCl pri 100 mg/l/15 min), opláchnuť a ručne rozdrviť. Šupky sa sušili pri 35 stupňoch počas 50 hodín, rozomleli sa na 42 Tyler mesh a extrahovali sa v zrýchlenom rozpúšťadlovom extraktore (ASE-350, Dionex, Sunnyvale, CA, USA) pri tlaku 100 bar (98,7). atm) v dvoch extrakčných cykloch pri 50 stupňoch. Ako rozpúšťadlo sa použila voda okyslená kyselinou citrónovou (pH 2,10) a extrakcie sa opakovali štyrikrát. Potom sa extrakty filtrovali pomocou kvalitatívneho papiera a lyofilizovali sa vo vákuu počas 120 hodín. Potom sa vypočítal výťažok extrakcie vyjadrený v percentách vzhľadom na surovinu použitú v postupe.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

Celkový obsah fenolov (TPC, mg ekvivalentu kyseliny galovej na 100 g, mg GAE/100 g) celkový kondenzovaný tanín (TCT, mg ekvivalentu katechínu na 100 g, mg CE/100 g), celkové flavonoidy (TF, mg CE /100 g) a celkový obsah orto-difenolov (TOD, mg ekvivalentu kyseliny chlorogénovej na 100 g, mg CAE/100 g) sa merali trojmo s použitím UV-Vis spektrofotometrie podľa postupov plne opísaných v do Carmo et al. [20].

Antokyány (kyanidin {{0}}O-glukozid a delfinidín 3-O-glukozid) boli kvantifikované pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) s použitím Agilent 110{{37} } (Agilent Technologies Inc., Espoo, Fínsko) zariadenie vybavené detekciou diódového poľa (DAD). Separácia sa uskutočnila pomocou kolóny Gemini C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm) s gradientovou elúciou acetonitrilu okysleného kyselinou mravčou na 5 percent. Celkový obsah ellagitanínu bol stanovený po kyslej hydrolýze podľa Mattilu a Kumpulainena [38] a kyselina galová bola stanovená pomocou stĺpca Inertsil ODS-3 （150 mm × 4.0 mm , 3 μm) s gradientovou elúciou acetonitrilu do 50 mmol/l H3PO4 (pH 2,5). Analýzy sa uskutočnili trojmo a výsledky sa vyjadrili ako mg/100 g. Ultra-vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (UHPLC) kombinovaná s hmotnostnou spektrometriou s vysokým rozlíšením (MS) bola použitá na charakterizáciu hlavných ellagitanínov a antokyanov. Hmotnostný spektrometer Acquity UPLC-Xevo G2 QTOF (Waters, Milford, MA, USA) bol vybavený kolónou Waters Acquity BEH C18 (1,7 μm, 2,1 mm × 150 mm) a separácia sa uskutočnila s použitím gradientu acetonitrilu do okyslenej vody. s 0,1 % kyseliny mravčej, podľa Santosa a kol. a kladný režim bol použitý s kapilárnym napätím -1 kV a plus 0,5 kV, v tomto poradí. Ako kolízny plyn sa použil argón. MS analýzy sa uskutočňovali pomocou dátového modelu centroidu nezávislého na dátach (MSE) v plnom skenovaní m /z 50-1500 s časom skenovania 0,2 s. Vo funkcii MSE boli prekurzorové ióny MS fragmentované pomocou vysokej kolíznej energie zvýšenej z 25 na 45 V.

Antioxidačná aktivita extraktu sa analyzovala trojmo pomocou rôznych testov: aktivita zachytávania voľných radikálov vo vzťahu k radikálu DPPH, antioxidačná sila redukujúca železo (FRAP), antioxidačná kapacita redukujúca medené ióny (CUPRAC), redukčná sila a Cu2 plus chelatačná schopnosť. Výsledky boli vyjadrené ako mg GAE/100 g (redukčná sila), mg ekvivalentu kyseliny askorbovej na 100 g, mg AAE/100 g (DPPH, FRAP a CUPRAC) a mg ekvivalentu EDTA/100 g (chelatácia kovu). . Všetky použité metódy už predtým podrobne opísali do Carmo et al. a Fidelis a kol. [9,20].

3.3. Príprava vezikúl

Transferzómy, transferzómy obohatené o hydroxyetylcelulózu (HEcelulóza-thansferómy) a transferzómy obohatené hyaluronátom sodným (hyalurónové transferómy) sa pripravili dispergovaním fosfolipidu (S75, 180 mg/ml), extraktu Tween 80 (20 mg/ml). (40 mg/ml) a polyméru (hydroxyetylcelulóza alebo hyaluronát sodný 1 a 2 mg/ml), ak je to vhodné, vo vode a zmes sa nechá niekoľko hodín hydratovať. Potom boli disperzie sonikované (4 cykly 2 zapnuté 5 vypnuté s amplitúdou 15,0 μ), pričom sa medzi každým cyklom čakalo 5 minút, aby sa podporilo chladenie a zabránilo sa prehriatiu vzorky. Na sonikáciu všetkých disperzií sa použil vysoko výkonný sonikátor Soniprep 150 (MSE Crowley, Londýn, Veľká Británia), aby sa získal homogénny systém s malou veľkosťou [15]. Tento postup zabraňuje strate zložiek použitých na prípravu, čo vedie k vytvoreniu účinných vezikúl schopných začleniť vysoké množstvá extraktu.

3.4. Charakterizácia vezikúl

Stredný priemer a index polydisperzity (bezrozmerná miera šírky distribúcie veľkostí) vezikúl sa merali fotónovou korelačnou spektroskopiou s použitím Zetasizer Ultra (Malvern Instrument, UK). Rovnaké zariadenie bolo použité na meranie zeta potenciálu vezikúl meraním elektroforetickej pohyblivosti častíc [40]. Vzorky boli pred meraním vhodne nariedené, aby boli opticky čisté a zabránilo sa redukcii rozptýleného svetla, ktoré je možné detegovať. Na vyhodnotenie množstva extraktu skutočne začleneného do vezikúl sa disperzie purifikovali z nezačleneného extraktu dialýzou. Disperzie vezikúl (1 ml) boli vložené do polykarbonátových dialyzačných skúmaviek (Spectra/Pormembranes:12-14 kDa MW cut-off, s pórmi 3 nm; Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA, USA) a ponorené do destilovanej vody (2 1) pri 25 stupňoch počas 2 hodín za miešania. Voda sa obnovila po jednej hodine, čím sa použili 4 1 vody na solubilizáciu bioaktívnych molekúl nezačlenených do 1 ml disperzie vezikúl (40 mg). Množstvo extraktu v suspenziách vezikúl pred a po dialýze sa kvantifikovalo meraním ich antioxidačnej aktivity pomocou testu DPPH. Účinnosť zachytenia extraktu vo vnútri vezikúl sa vypočítala ako percentuálny pomer medzi antioxidačnou aktivitou vzoriek pred a po procese čistenia [41-43].

3.5. Stabilita vezikúl pri skladovaní

Stabilita vezikúl v disperzii sa hodnotila sledovaním ich priemernej veľkosti, indexu polydisperzity a povrchového náboja počas 90 dní, pričom sa disperzie udržiavali pri teplote miestnosti (25 ± 1 stupeň).

3.6. Meranie antioxidačnej aktivity vzoriek pomocou kolorimetrického testu DPPH Antioxidačná aktivita extraktu zo šupiek jabuticaba naneseného do vezikúl sa merala ako funkcia jeho schopnosti zachytávať DPPH. Disperzie (10 μl) sa zriedili (1-100) metanolovým roztokom DPPH (0,4 ug/ml). Zriedené vzorky sa skladovali pri teplote miestnosti a v tme počas 30 minút, potom sa merala absorbancia roztokov pri 517 nm pomocou UV spektrofotometra. Antioxidačná aktivita formulácií sa vypočítala podľa rovnice (1): (1) Percento antioxidačnej aktivity =[(ABSDPPH-ABS vzorka)/ABSpPPH]×100

3.7. Biokompatibilita a ochranný účinok vzoriek proti oxidačnému stresu v keratinocytoch

Imortalizované ľudské keratinocyty (HaCaT) boli pestované ako monovrstvy pri 37 stupňoch, s 100 percentami vlhkosti a 5 percent CO2 s použitím Dulbeccovho modifikovaného Eagleho média (DMEM) s vysokým obsahom glukózy doplneného fetálnym hovädzím sérom, penicilínom a streptomycín ako rastové médium. Na vyhodnotenie biokompatibility formulácií sa bunky naočkovali do 96-jamkových doštičiek v hustote 7,5 x 10 stupeň buniek/jamku. Po 24 hodinách boli bunky ošetrené počas 48 hodín extraktom jabuticaba vo vodnej disperzii alebo naplnené do vezikúl správne zriedených DMEM, aby sa dosiahli rôzne koncentrácie extraktu (40, 4, 0,4 a 0,04 ug/ml). Na konci inkubácie MTT [3(4,5-dimetyltiazolyl-2)-2, 5-difenyltetrazóliumbromid]（100 μl, 0,5 mg/ml konečná koncentrácia Do každej jamky sa pridalo ） a po troch hodinách sa vytvorené kryštály formazanu rozpustili dimetylsulfoxidom. Absorbancia každej jamky sa merala pri 570 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Synergy 4 Reader, BioTek Instruments, AHSI SpA, Bernareggio, Taliansko). Všetky experimenty sa opakovali aspoň trikrát, zakaždým trojmo. Výsledky sú uvedené ako percento životaschopnosti buniek v porovnaní s neošetrenými kontrolnými bunkami (100 percent životaschopnosti).

Hodnotil sa aj in vitro ochranný účinok formulácií proti poškodeniu spôsobenému oxidačným stresom. Bunky sa naočkovali do {{0}}jamkových doštičiek v hustote 7,5 x 10 buniek/jamku. Po 24 hodinách inkubácie boli bunky zaťažené peroxidom vodíka (30 percent zriedené 1:40, 000 v/o s PBS) a ošetrené extraktom vo vodnej disperzii alebo naplnené do vezikúl a zriedené, aby sa dosiahli dve rôzne koncentrácie (4 a 0,4 ug/ml). Bunky stresované iba peroxidom vodíka boli použité ako negatívna kontrola, zatiaľ čo neošetrené bunky boli použité ako pozitívna kontrola. Po 4 hodinách inkubácie sa bunky premyli čerstvým médiom a ich životaschopnosť sa stanovila testom MTT. Výsledky sú uvedené ako percento neošetrených buniek (100 % životaschopnosť).

3.8. Vlastnosti hojenia rán in vitro

Schopnosť extraktu zo šupky jabuticaba naloženého do vezikúl remodelovať kožné lézie a podporovať ich hojenie bola hodnotená meraním expanzie buniek na lézii v bunkovej monovrstve. Bunky sa kultivovali v 6-jamkových platniach, kým sa nedosiahla úplná a homogénna monovrstva. Lineárna rana sa vytvorila použitím sterilnej plastovej špičky pipety. Rozptýlené fragmenty buniek sa odstránili jemným premytím čerstvým médiom. Vodná disperzia extraktu alebo vezikuly naplnené extraktom sa zriedili bunkovým médiom až na 4 ug/ml extraktu a použili sa na ošetrenie poškodených bunkových monovrstiev. Pozorovali sa bunkové lézie a snímky sa zachytávali po 24, 36 a 48 hodinách inkubácie pomocou optického mikroskopu s 10x objektívom. Neošetrené bunky sa použili ako negatívna kontrola. Plošné lézie na zachytených obrázkoch boli merané softvérom Java Image J (http://rsb.info.nih.gov, dostupný v apríli až júni 2021). Uzavretie rán sa vypočítalo pomocou rovnice (2):

kde ao je oblasť poranenia bezprostredne po poškriabaní a a je oblasť poranenia meraná po 24, 36 a 48 hodinách [44].

3.9. Štatistická analýza

Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka a významnosť bola testovaná na úrovni pravdepodobnosti 0,05 (p). Pre veľkosť, zeta potenciál, viskozitu, akumuláciu liečiva a cytotoxicitu sa na potvrdenie štatistických rozdielov medzi skupinami použila jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Tukeyho test, zatiaľ čo Studentov t-test sa použil na porovnanie dvoch vzoriek pomocou XLStatistic pre Excel.

4. Závery

Lyofilizovaný extrakt šupky jabuticaby bol začlenený do transferzómov a transferzómov obohatených polymérom (hydroxyetylcelulóza a hyaluronát sodný) s cieľom stabilizovať extrakt a zlepšiť jeho terapeutickú účinnosť. Získané vezikuly mali malú veľkosť a boli homogénne dispergované. Pridanie oboch polymérov viedlo len k vytvoreniu mierne väčších vezikúl bez rozdielov medzi použitými polymérnymi koncentráciami. Vezikuly obohatené polymérom sa zdali byť ideálne na topické podávanie a boli schopné začleniť extrakt bohatý na bioaktívne látky vo vysokých množstvách. Najmä kombinácia fosfolipidu Tween 80 a hyaluronátu sodného na získanie hyalurónových transferzómov bola vybraná ako najlepšia formulácia z hľadiska stability a schopnosti interagovať s keratinocytmi, pretože iba tieto vezikuly boli schopné účinne pôsobiť proti poškodeniu. indukované v bunkách pri použití peroxidu vodíka a na podporu hojenia rán v ľudských keratinocytoch. Celkovo naše výsledky naznačujú, že hyaluronan-transferzómy môžu predstavovať sľubný systém na liečbu kožných ochorení alebo kožných rán spojených s oxidačným stresom. Okrem toho po prvýkrát ukazujeme použitie extraktu z jabuticaby v dermatologickom aplikačnom systéme.

Príspevky autora:DG, MLM, MM: konceptualizácia, formálna analýza, spracovanie údajov, písanie a kontrola; IC, MA, JH: formálna analýza a písanie. Všetci autori si prečítali publikovanú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.

Financovanie:Tento výskum nezískal žiadne externé financovanie. Vyhlásenie inštitucionálnej revíznej rady: Neuplatňuje sa. Vyhlásenie o informovanom súhlase: Neuplatňuje sa.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov:K dispozícii sú nespracované údaje a možno ich požiadať priamo od autorov.

Konflikt záujmov:Autori nedeklarujú žiadny konflikt záujmov.

Dostupnosť vzorky:Vzorky extraktu z kôry jaboticaba sú dostupné u autorov.

Tento článok je extrahovaný z Molecules 2021, 26, 6697. https://doi.org/10.3390/molecules26216697 https://www.mdpi.com/journal/molecules