Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kliknutím sem získate informácie o časti I (Úvod, materiály a metódy) tohto článku.

Takmer jednobunkové proteomické profilovanie proximálneho tubulu a glomerulu normálnej ľudskej obličky--Časť II

Tara K. Sigdel¹, Paul D. Piehowski², Sudeshna Roy¹, Juliane Liberto¹, Joshua R. Hansen², Adam C. Swensen², Rui Zhao³, Ying Zhu³, Priyanka Rashmi¹, Andrew Schroeder¹, Izabella Damm¹, Svastika Sur¹, Jinghui Luo⁴, Yingbao Yang⁴, Wei-Jun Qian²* a Minnie M. Sarwal¹* pre konzorcium Kidney Precision Medicine Project (KPMP).

Výsledky

OCT odber zmrazených obličiek je preferovanou metódou proteomiky obličkových tkanív

Pre rovnaké množstvo vstupného tkaniva sa OCT zmraziloobličkyposkytli viac bielkovín ako rezy FFPE z tej istej obličky (OCT zmrazené: 1871 ± 92 vs. FFPE: 296 ± 10 ng proteínu; p < 0,0017), čo naznačuje možnú degradáciu proteínu v FFPE, napriek tomu, že tkanivo bolo zaliate v parafíne bloky pre<2 months.="" bulk="" proteomics="" data="" from="" the="" two="" human="">obličky(#1, #2) preukázali významné prekrytie identifikovaných proteínov s 84 percentným prekrytím medzi 2 OCT obličkami (limit reprodukovateľnosti=13.52, 97,96 percentné hodnoty v rámci limitu reprodukovateľnosti) a 83 percentným prekrytím tej istej obličky proteíny medzi 2 obličkami FFPE (limit reprodukovateľnosti=24.43, hodnoty 98,5 percent v rámci limitu reprodukovateľnosti) (doplnková tabuľka 1 a obrázok 2B). V každej obličke, bez ohľadu na spôsob skladovania tkaniva, sa zachovalo ~ 70 percent obličkových štrukturálnych (väčšinou extracelulárnej matrice) proteínov, čo naznačuje, že niektoré proteíny boli prednostnejšie detegované každou metódou. Aby sme vyhodnotili, aké obohatenie proteínov sa pozoruje medzi rôznymi metódami zberu, zistili sme, že proteomika tkaniva pomocou OCT poskytla viac proteínov s vysokými spektrálnymi číslami väčšími alebo rovnými 5 (pomer pravdepodobnosti=1.460601; 95-percentný interval spoľahlivosti {{21} }.238969, 1.722593; p=4.472e-06), čo môže odrážať lepšie uchovanie obličkového tkaniva pri OCT (obrázok 2C). Proteomická analýza tkaniva OCT tiež odobrala vzorky unikátnejších proteínov v porovnaní s tkanivom FFPE (pomer pravdepodobnosti=3.207089; 95-percentný interval spoľahlivosti=2.371221, 4.370600; p=4.985e{{{{101} 38}}) (obrázok 2D). Okrem toho sa zistilo, že mnohé z týchto jedinečných proteínov majú nízky počet a je pravdepodobnejšie, že budú vynechané, dokonca aj pri veľmi krátkych dobách uchovávania obličkového tkaniva pri FFPE. Bez ohľadu na metódu konzervácie tkaniva sme zaznamenali, že bežné biologické cesty sa silne prekrývajú. Tieto dráhy zahŕňali metabolické procesy s malými molekulami (p=2,59E-121 pre OCT a p=2,15E-109 pre FFPE), metabolický proces karboxylových kyselín (p {{47 }},62E-80 pre OCT a p=1,93 E-76 pre FFPE), metabolické procesy organických kyselín (p=1,26E-76 pre OCT a p=3,62E-80 pre FFPE) a procesy metabolizmu liečiv (p=7,90E-83 pre OCT a p=4,01E{{64} } pre FFPE). Tieto údaje zdôrazňujú, ako je proteomika obličkového tkaniva vysoko reprodukovateľná, bez ohľadu na metódu konzervácie tkaniva pre dve testované metódy.

Proteomika obličkového tkaniva je vysoko reprodukovateľná na transportovanom OCT zmrazenom obličkovom tkanive

Analyzovali sme údaje generované na dvoch miestach (UCSF a Ohio State University), ktoré sa riadili rovnakým protokolom na vykonávanie hromadnej proteomiky, ako je opísané v časti o metódach. Je pozoruhodné, že v tom istom bolo bežne identifikovaných ~ 70 percent proteínovobličkyspracované na dvoch rôznych miestach so spektrálnym počtom väčším alebo rovným 5 (r=0,95, P < 0,0001)="" (nespracované="" údaje="" poskytnuté="" v="" doplnkovej="" tabuľke="" 2).="" ešte="" dôležitejšie="" je,="" že="">obličkyodoslané z centrálneho miesta produkovali vysoko korelované údaje (r=0.89, P=0.0001) (doplnková tabuľka 2), čo podporuje, že zavedené analytické protokoly spracovania tkaniva boli dosť robustné.

Cistanche je dobrý preobličky

Optimalizácia zachytávania obličkových buniek pomocou laserovej zachytávacej mikrodisekcie (LCM)

Rôzne hrúbky sekcií OCT namontovaných na PET podložných sklíčkach z rovnakéhoobličky(n=2) boli testované pri hrúbke 5, 10 a 20 μm, trojmo, na opakovateľnosť LCM. Zistilo sa, že 10 μm sekcia je najoptimálnejšia pri sériovom testovaní LCM s použitím systému Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection (Cut Energy, 64; Cut Focus, 75). Odrezané bunky boli zachytené na lepiacich viečkach. Okrem opakovateľnosti procesu LCM sme tiež zistili maximálnu účinnosť zachytávania katapultovaných buniek pri hrúbke sekcie OCT 10 μm.

Proteomika podkompartmentových buniek v normálnej ľudskej obličke identifikuje obohatené a jedinečné glomerulárne a proximálne tubulárne proteíny

Cez 9 normálnych ľudíobličkyprocessed by nscProteomics, with input of an average of 10–40 cells input each/Glom and PT fraction, we identified an average of ~2,560 proteins/sample. Interestingly, ~20% of the total proteins assessed by nscProteomics, from either sub-compartment overlapped across compartments/cells and bulk tissue, representing likely housekeeping or more structural kidney proteins that are not compartment specific. In a direct comparison of the two sub-compartments, 208 proteins were enriched (>2 fold) in Glom, and 67 were completely unique to Glom (absent in PT); and conversely, 247 proteins were enriched (>2-krát) v PT a 25 bolo jedinečných pre PT (neprítomné v Glom) (doplnková tabuľka 3). Napriek relatívne malému súboru vzoriek sme vykonali aj overenie medzi jednotlivými dávkami, pričom každú sériu cyklov sme považovali za nezávislý súbor. Aj s malou unikátnou sadouobličky(2 v dávke 1, 4 v dávke 2), 210 proteínov obohatených Glom vysoko korelovalo medzi dvoma nezávislými súbormi, napriek týmto údajom pochádzajúcim z rôznych kohort normálnychobličky(r=0.83; obrázok 3A) a analyzované v rôznych časoch. 246 proteínov obohatených o PT by tiež mohlo korelovať medzi dvoma rôznymi kohortami normálnych obličiek (r=0,77; obrázok 3B). Výsledky zdôrazňujú, že nscProteomics je schopná reprodukovateľne identifikovať proteíny špecifické pre subkompartmenty konzervované v rôznych funkčných jednotkách obličiek.

Obrázok 3. (A) Korelácia súboru 210 proteínov významne obohatených oglomerulusmedzi dvoma rôznymi šaržami nezávislých vzoriek obličiek. Šarža 1 (beh 1) bola od 2 obličiek a šarža 2 (beh 2) bola od 4 obličiek. Farebná škála bola vybraná na vizuálne zobrazenie hojnosti. Silná pozitívna korelácia 0.83 medzi priemernými abundanciami rovnakej sady proteínov z dvoch rôznych šarží Červené prerušované čiary poskytujú mieru šírenia zobrazením 95-percentného predikčného intervalu pre priemerné hodnoty abundancie týchto proteínov v budúce opakované experimenty. (B) Korelácia 246 proteínov významne obohatených oproximálne tubulyvs.glomerulusmedzi dvoma dávkami. Pozitívna korelácia 0,77 medzi priemernými abundanciami tých istých proteínov medzi dvoma šaržami.

Na zistenie špecifickosti prístupu nscProtoemics preobličkyanalýze podkompartmentov sme porovnali údaje Glom a PT z podkompartmentu obličiek nscProteomics s hromadnou proteomikou rovnakého súboru obličkového tkaniva. Zistili sme, že ~ 25 percent (n=656) proteínov identifikovaných v oboch podkompartmentoch nebolo dokonca detekovaných proteomikou tkaniva, pretože v hromadnej vzorke boli pravdepodobne veľmi nízke; Proteíny obohatené o 118 Glom a 74 PT nebolo možné detegovať v objemových obličkách, čo poukazuje na obmedzenie iba vykonávania proteomiky objemového tkaniva. Len 9 percent proteínov špecifických pre Glom, ale väčší počet 48 percent proteínov špecifických pre PT, bolo identifikovaných objemovou proteomikou obličiek, čo odráža oveľa vyšší počet PT buniek v porovnaní s Glom bunkami v normálnom stave.obličky. V skutočnosti by niektoré známe markery pre glomerulárne bunky, ako je podocin (NPHS2), eva-1 homológ B (EVA1B), MARCKS ako 1 (MARCKSL1), fibroblastový rastový faktor 1 (FGF1) a claudín 5 (CLDN5), mohli neboli identifikované objemovou proteomikou obličiek pri štandardných hĺbkach testu ~2,000.

cistanche na zlepšenieobličkyfunkciu

Validácia Glom a PT markerov podľa hodnotenia nscProteomics

Väčšina podkompartmentových proteínov bola hlásená ako detegovaná vobličkyIHC v predtým publikovaných údajoch (Human Protein Atlas) (25). Proteíny, ktoré buď neboli detegované pomocou IHC (označené *), alebo údaje nie sú dostupné (označené **), sú uvedené na obrázkoch 4A, B. Vzali sme 26 najlepších proteínov obohatených glom a 26 proteínov špecifických pre PT a skúmali sme jednobunkové transkriptomické dáta (dáta scRNA Seq) na integráciu a overenie "cross-omics" (obrázok 4B). Výsledok integračnej analýzy top Glom a PT markerov pomocou proteomiky a transkriptomiky ukázal silnú koreláciu niektorých známych proteínov Glom a PT markerov. Markery podocytov, ako sú PODXL a CLIC5, a markery PT, ako napríklad PDZK1 a ANPEP, boli v oboch súboroch údajov vysoko obohatené. Okrem validácie známych markerov nscProteomics tiež identifikovala proteíny, ktoré sú identifikované v malom množstve buď v súboroch transkriptomických údajov, alebo v súboroch údajov IHC. Napríklad PITPNB je vysoko obohatený glomerulárny marker podľa údajov nscProteomics; avšak detekcia tohto génu bola nízka v transkriptomických údajoch a nebola detegovateľná pomocou IHC (25). Podobný prípad bol pozorovaný pri SLC5A1, ktorého signál bol zosilnený v údajoch nscProteomics, ale nie v súboroch transkriptomických alebo IHC údajov (obrázok 4C).

Obrázok 4. (A) Tepelná mapa znázorňujúca rozdielnu distribúciu nadbytku proteínov v 5 normálnychobličky(šarža 2), z 26 proteínov (z 372) najvýznamnejšie obohatených o G (vs T) a 26 proteínov (zo 411) najvýraznejšie obohatených o T (vs G), pričom na porovnanie sú uvedené zodpovedajúce hodnoty v 2 hromadných vzorkách . Množstvo proteínov sa meria ako log2 transformovaných relatívnych intenzít. Zhlukovanie významných proteínov bez dozoru zvýrazňuje súbory proteínov súvisiacich s euklidovskou mierou podobnosti vzdialenosti v rámci väčších diferencovaných obohatených súborov. Je potrebné poznamenať, že hromadné vzorky sa zhlukujú spolu so vzorkami PT; toto sa očakáva od rproximálne tubulysú hojne rozptýlené vobličky. (B) Korelácia grafu génovej expresie údajov scRNA-seq od človekaobličky. Boli vybrané gény kódujúce Glom-špecifické a PT-špecifické proteíny prezentované na tepelnej mape. Zvyšujúca sa veľkosť bodky zodpovedá väčšiemu percentu buniek v populácii buniek exprimujúcich gén, zatiaľ čo tmavšia farba zodpovedá vyššej expresii génu. PT,proximálny tubulárny; Podo, podocyty; Mes, mezangiálne bunky; LOH, Henleho slučka, imunitné bunky; Endo, endotelové bunky; DT, distálne tubuly; CD, zberný kanál. *Znak vedľa symbolu génu znamená, že proteín nebol detegovaný na glomerulách, ako uvádza Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org), **Údaje nie sú dostupné na Human Protein Atlas (https://www. proteinatlas.org). (C) Reprezentatívne proteíny, ktoré demonštrujú, ako nscProteomics nielen identifikuje pozitívne markery, ako sú PODXL a PDZK1, ale tiež identifikuje proteínové markery, ktoré inak chýbajú transkriptomike alebo imunohistochémii.

Biologický význam proteínov obohatených o Glom a PT

Použili sme údaje generované prostredníctvom vyvinutého protokolu pre nscProteomics, aby sme sa pozreli na proteíny, ktoré boli významne obohatené buď v glomerulárnych bunkách aleboproximálny tubulárnybunky. Proteíny obohatené o 208 Glom boli obohatené o transport sprostredkovaný vezikulami (FDR 3.6E-15) a reguláciu organizácie bunkových komponentov (FDR 9.75E-14) ako ich top biologické procesy a viazanie cytoskeletálnych proteínov (FDR 2.63 E-19) a viazanie aktínu (FDR 2,40E-17) medzi najvyššie hodnotené molekulárne funkcie. Okrem toho, aktínový cytoskelet (FDR 3.73 E-25) a fokálna adhézia (FDR 4.07E-20) boli najvyššie obohatené bunkové zložky. Proteíny obohatené o 247 PT boli obohatené o metabolické procesy s malými molekulami (FDR 7,55E-50) a metabolické procesy liečiv (FDR 5.00E-41) ako špičkové biologické procesy. Proteíny boli obohatené o oxidoreduktázovú aktivitu (FDR 9.07E-34) a katalytickú aktivitu (FDR 1.05E-27) medzi najvyššie hodnotené molekulárne funkcie.

nscProteomics identifikuje jedinečnú sadu proteínov Glom a PT

Okrem obohatených proteínov v sekciách Glom alebo PT bolo 92 proteínov buď jedinečných pre Glom (n=67) alebo jedinečných pre PT (n=25), keďže boli identifikované iba v glomerulárnych bunkách aleboproximálny tubulárnybunky (tabuľka 1). Proteíny identifikované iba v glomerulárnych bunkách boli obohatené o molekulárne funkcie, ako je väzba aktínu (FDR 4.92E-06), väzba cytoskeletálneho proteínu (FDR 3.47E-05), väzba integrínu (3.9E{ {11}}) atď. Tento zoznam sme použili na preskúmanie verejne dostupných údajov, ktoré predtým hlásili svoju prítomnosť vglomerulus. Zo 67 proteínov identifikovaných iba v sekciách Glom sa uvádza, že 41 je prítomných vobličky(25). Z týchto 41 proteínov je podskupina 18 (43,9 percenta) v súlade s nscProteomics a 23 (56,1 percenta) údajne nie je zvýšené v Glom v porovnaní s tubulmi. Spomedzi 25 proteínov identifikovaných iba v sekciách PT sa uvádza, že 20 je prítomných vobličky(25). Tieto proteíny sú obohatené o molekulárne funkcie, ako je aktivita transmembránového transportéra organického aniónu (FDR 6.34E-05), aktivita transmembránového transportéra karboxylových kyselín (FDR 1.4E-04), solut: aktivita symportera sodíka (FDR 1.8E -04) atď. Z 25 proteínov špecifických pre PT podskupina 19 proteínov (95.0 percent ) súhlasí s nscProteomics a iba 1 (5.0 percent ) súhlasí hlásené, že nie je zvýšené v tubuloch v porovnaní s Glom.

Tabuľka 1. Proteíny obohatené o glomerulárne aproximálny tubulárnybunky identifikované pomocou nscProteomics.

Diskusia

S rýchlym pokrokom jednobunkovej genomiky a transkriptomických testov stále existuje nesplnená potreba robiť paralelné jednobunkové štúdie na vzácnych ľudských vzorkách v oblasti proteomiky (27). Proteínové profilovanie z jednej bunky naráža na prekážku v tom, že nemáme schopnosť amplifikácie proteínov tak, ako môžeme amplifikovať nukleotidy. V tejto prvej aplikácii takmer jednobunkovej proteomiky na človekaobličky, demonštrujeme, že robustná proteomická kvantifikácia bez označenia je uskutočniteľná už pre 40obličkybunky, špecifické pre rôzne pododdelenia LCM. Vyvinuté protokoly pre proteomiku takmer jednobunkových obličiek budú prínosom pre ďalších výskumníkov pracujúcich v oblasti ochorení obličiek.

Nedávna štúdia Hoehne et al. demonštrovali použitie technológie prípravy vzoriek s vylepšenou prípravou vzoriek na pevnej fáze (SP3) na proteomickú analýzu renálnych segmentov (4). Použitím jednotlivých mikrodisekovaných glomerulov s ~ 200 bunkami autori ilustrovali heterogenitu proteómov z jednotlivých glomerulov z myších modelov a ľudských pacientov. Ďalšia nedávna štúdia Song et al. (28) využili tkanivo FFPE od príjemcov obličkového transplantátu na vytvorenie molekulárnej diagnostickej platformy pomocou hromadnej proteomiky. V tomto rukopise sme veľmi podrobne optimalizovali a analyzovali proces odberu tkaniva do MS, aby sme vytvorili štandardný protokol na proteomickú analýzu malých vzoriek tkaniva. Najprv sme porovnali metódu ukladania tkaniva FFPE vs. OCT, aby sme ukázali, že zatiaľ čo medzi týmito dvoma súbormi údajov existuje vysoká korelácia, tkanivo OCT poskytuje vyšší obsah bielkovín a čo je dôležitejšie schopnosť identifikovať proteíny s nízkym výskytom. Po druhé, protokoly MS pre hromadnú proteomiku boli optimalizované tak, že vysoko reprodukovateľné (r=0.95) výsledky možno získať na rôznych miestach na sériovo strihaných priľahlýchobličkytkanivové rezy. Po tretie, kde popisujeme prístup k spojeniu mikrodisekcie laserového zachytávania na zníženie množstva vstupnej vzorky na 10–40 buniek pomocou technológie nano POTS pozostávajúcej z robotickej platformy na presné spracovanie pikolitrových objemov. Náš prístup nám umožňuje kontrolovať vstupný počet buniek, čím sa zvyšuje reprodukovateľnosť rôznych vzoriek glom a tubulov. Vzhľadom na jednoduchosť LCM a presnosť technológie nano POTS veríme, že naša štúdia umožní prijatie proteomiky na vzácnych klinických vzorkách reprodukovateľným spôsobom.

cistanche liečiťobličkyfunkciu

Obmedzenia tejto štúdie zahŕňajú malú veľkosť vzorky a obmedzenie tkaniva, čo nám neumožnilo vykonať tkanivovú priestorovú validáciu imunohistochémiou. Na čiastočné zmiernenie tohto obmedzenia poskytujeme integrovanú analýzu údajov s údajmi scRNA Seq z rovnakých tkanív, aby sme potvrdili, že proteíny identifikované vobličkysubkompartmenty sú tiež identifikované v tej istej pôvodnej tkanivovej bunke transkripciou. Ďalším obmedzením je, že pomocou nscProteomics identifikujeme obmedzený počet proteínov, pravdepodobne kvôli malému vstupnému materiálu, čo predstavuje riziko, že niektoré proteíny nebudú identifikované MS, pretože by mohli chcieť pod hranicou detekcie prístroja. Zlepšenie citlivosti prístroja a extrakcia proteínov z malého vstupu vzorky môže pomôcť zlepšiť toto obmedzenie prúdu.

Uvedomujeme si, že existuje veľa premenných, ktoré môžu prispieť ku kvalite údajov. Čas skladovania, fixatíva FFPE (tj PFA vs. glutaraldehyd), dĺžka času vo fixatíve, čas v mrazničke/na suchom ľade/v tekutom dusíku, prístupy k solubilizácii proteínov sú niekoľko faktorov, ktoré by mohli prispieť k výsledkom proteomiky. Je dôležité si uvedomiť, že aj biológia dvochobličkynie je vždy rovnaký a to platí dokonca aj v tých istých obličkách ako glomeruly toho istéhoobličkybiopsie môžu byť v inom funkčnom stave. histologicky,obličkykompartmenty sú extrémne heterogénne aj v rámci rovnakého chorobného stavu. Zachytením rovnakých oblastí obličiek z rôznych vstupných vzoriek umožňuje nscProteomics skúmanie heterogenity v špecifických subcelulárnych kompartmentoch, čo je silnou stránkou tejto technológie.

Zistili sme, že niektoré podkompartmentové proteíny identifikované pomocou nscProtoemics sú potenciálne nové glomerulárne aproximálny tubulárnybielkoviny. Inovácie v integračnej analýze údajov s jednobunkovou RNA Seq toho istéhoobličkyvzorky, aj keď predbežné, by poskytli potvrdenie, že tieto proteíny sú skutočne lokalizované v ich vzorkovaných/predpovedaných subregiónoch.

Táto štúdia poskytuje pohľad na neobjavenú zložitosť molekulárnych vzorov vobličkypododdelenia v oblasti zdravia a podporuje aplikáciu tejto technológie na vzorky ochorení obličiek s cieľom pochopiť poruchy proteínov v rôznych podpriestoroch obličiek, ktoré môžu byť prednostne ovplyvnené pri rôznych poruchách obličiek. Diferenciálna regulácia týchto proteínov pri rôznych ochoreniach obličiek by mohla odhaliť klinickú a prognostickú heterogenitu v komplexných fenotypoch glomerulárnych a tubulárnych ochorení a odhaliť nové spúšťače poškodenia a zotavenia obličiek. Okrem toho, vzhľadom na nedostatok akýchkoľvek liekov na ochranu obličiek, odhalenie týchto nových ciest v špecifických oblastiach obličiek môže poskytnúť dôležité nové ciele pre racionálny dizajn liekov na riešenie špecifických poranení rôznych podkompartmentov pri rôznych poruchách obličiek.

Na záver teda uvádzame pracovný postup nscproteomics na spracovanie 10–40obličkybunky; zlepšenie tejto technológie nesie v sebe prísľub redukcie vstupného materiálu v budúcnosti na úroveň jednočlánkov. Budúci vývoj, ako sú optimalizované objemy spracovania a ďalšie vylepšenia platformy LC-MS, prebiehajú.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov

Súbory údajov vygenerované pre túto štúdiu možno nájsť v PRIDE PXD015058 a 10.6019/PXD015058.

Autorské príspevky

TS a MS konceptualizovali štúdiu. TS, JLi, JH, ACS, RZ, YZ, PR, ID, SS, JLu a YY pomohli pri spracovaní vzoriek a generovaní experimentálnych údajov, TS, PP, SR, AS, W-JQ a MS prispeli k analýze údajov a príprava rukopisu. Všetci autori prispeli k článku a schválili predloženú verziu.

Financovanie

Financovanie tejto práce bolo zObličkyProjekt presnej medicíny, NIDDK NIHUG3 -DK114937 (MS) a R01 DK109720-02 (MS), DP3 DK110844 (W-JQ), R01 DK122160 (W-JQ) a podpora od divízie Multi - Transplantácia orgánov (MS).

Konflikt záujmov

Autori vyhlasujú, že výskum bol vykonaný bez akýchkoľvek obchodných alebo finančných vzťahov, ktoré by mohli byť chápané ako potenciálny konflikt záujmov.

Poďakovanie

Oceňujeme pomoc Zoltana Laszika a Gyulu Szaba z UCSF za pomoc pri spracovaní tkaniva. Samirovi Parekhovi a Bradovi Rovinovi z Ohio State University (OSU) za hromadnú spoluprácu v oblasti hromadnej proteomiky a QC pre hromadné proteomické tkanivo zdieľané medzi UCSF a OSU a Jeffovi Hodginovi a Matthiasovi Kretzlerovi z University of Michigan za láskavé poskytnutie prístupu k odkazobličkyvzorky. Časť experimentálnych prác opísaných v tomto dokumente bola vykonaná v Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, národnom vedeckom používateľskom zariadení sponzorovanom Ministerstvom energetiky na základe zmluvy DEAC05-76RL0 1830.

Doplnkový materiál

Doplnkový materiál k tomuto článku možno nájsť online na: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2020.00499/full#supplementary-material

Skratky

nscProteomics, takmer jednobunková proteomika; KPMP,ObličkyProjekt presnej medicíny; PT,proximálny tubulárny; Glom, glomerulárny; LCM, laserová záchytná mikrodisekcia; μPOTS, mikrolitrové spracovanie v jednej nádobe pre stopové vzorky; OCT, Optimálna teplota rezania; FFPE, vo formalíne fixovaný parafín zaliaty; UM, University of Michigan; OSU, štátna univerzita v Ohiu; DDM, n-dodecyl-D-maltozid; scRNA Seq, jednobunkové RNA sekvenovanie; IHC, imunohistochémia.

Z: „Proteomické profilovanie proximálnych tubulov a glomerulov normálnej ľudskej obličky v blízkosti jednej bunky“ odTara K. Sigdel¹, Paul D. Piehowski², Sudeshna Roy¹, Juliane Liberto¹, Joshua R. Hansen², Adam C. Swensen², Rui Zhao³, Ying Zhu³, Priyanka Rashmi¹, Andrew Schroeder¹, Izabella Damm¹, Svastika Sur¹, Jinghui Luo⁴, Yingbao Yang⁴, Wei-Jun Qian²* a Minnie M. Sarwal¹* pre konzorcium Kidney Precision Medicine Project (KPMP).

---PÔVODNÝ VÝSKUM článok Predná strana. Med., 17. septembra 2020|https://doi.org/10.3389/fmed.2020.00499

Referencie

1. Lee JW, Chou CL, Knepper MA. Hlboké sekvenovanie v mikrodisekovaných obličkových tubuloch identifikuje transkriptómy špecifické pre segment nefrónu. J Am Soc Nephrol. (2015) 26:2669–77. doi: 10.1681/ASN.2014111067 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

2. Cisek K, Krochmal M, Klein J, Mischak H. Aplikácia multi-omiky a systémovej biológie na identifikáciu terapeutických cieľov u chronickýchobličkychoroba. Transplantácia nefrolového číselníka. (2016) 31: 2003–11. doi: 10.1093/ndt/gfv364 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

3. Wu H, Humphreys BD. Prísľub jednobunkového sekvenovania RNA preobličkyvyšetrenie choroby. Kidney Int. (2017) 92:1334–42. doi: 10.1016/j.kint.2017.06.033 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

4. Hohne M, Frese CK, Grahammer F, Dafinger C, Ciarimboli G, Butt L a kol. Jednonefrónové proteómy spájajú morfológiu a funkciu v proteinuriiobličkychoroba. Kidney Int. (2018) 93:1308–19. doi: 10.1016/j.kint.2017.12.012 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

5. Wu H, Malone AF, Donnelly EL, Kirita Y, Uchimura K, Ramakrishnan SM a kol. Jednobunková transkriptomika človekaobličkyvzorka biopsie aloštepu definuje rôznorodú zápalovú odpoveď. J Am Soc Nephrol. (2018) 29:2069–80. doi: 10.1681/ASN.2018020125 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

6. Wilson PC, Humphreys BD. Obličky a organoidná jednobunková transkriptomika: koniec začiatku. Pediatr Nephrol. (2019) 35:191–7. doi: 10.1007/s00467-018-4177-y PubMed Abstract|CrossRef Celý text|Študovňa Google

7. Wu H, Kirita Y, Donnelly EL, Humphreys BD. Výhody jednojadra oproti jednobunkovému sekvenovaniu RNA u dospelýchobličky: vzácne typy buniek a nové stavy buniek odhalené pri fibróze. J Am Soc Nephrol. (2019) 30:23–32. doi: 10.1681/ASN.2018090912 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

8. Shen Y, Tolic N, Massillon C, Pasa-Tolic L, Camp DG, Hixson KK a kol. Ultracitlivá proteomika využívajúca vysokoúčinnú on-line mikro-SPE-nanoLC-nanoESI MS a MS/MS. Anal Chem. (2004) 76:144-54. doi: 10.1021/ac030096q PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

9. Sun L, Zhu G, Zhao Y, Yan X, Mou S, Dovichi NJ. Ultracitlivá a rýchla analýza zdola nahor femtogramových množstiev komplexných štiepení proteómov. Angew Chem Int Ed Engl. (2013) 52:13661–4. doi: 10.1002/anie.201308139 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

10. Zhu Y, Piechowski PD, Zhao R, Chen J, Shen Y, Moore RJ a kol. Platforma na spracovanie nanokvapôčok na hlboké a kvantitatívne profilovanie proteómov 10-100 buniek cicavcov. Nat Commun. (2018) 9:882. doi: 10,1038/s41467-018-03367-w

PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

11. Xu K, Liang Y, Piechowski PD, Dou M, Schwarz KC, Zhao R, et al. Pracovný postup spracovania vzoriek kompatibilný so stolným počítačom na profilovanie proteómu<100 mammalian="" cells.="" anal="" bioanal="" chem.="" (2018)="" 411:4587–96.="" doi:="">

PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

12. Waanders LF, Chwalek K, Monetti M, Kumar C, Lammert E, Mann M. Kvantitatívna proteomická analýza jednotlivých pankreatických ostrovčekov. Proc Natl Acad Sci USA. (2009) 106:18902–7. doi: 10.1073/pans.0908351106 PubMed Abstract|CrossRef Celý text|Študovňa Google

13. Wisniewski JR, Ostasiewicz P, Mann M. FASP s vysokou výťažnosťou aplikovaná na proteomickú analýzu mikrodisektovaných vo formalíne fixovaných v parafíne zaliatych rakovinových tkanív získava známe markery rakoviny hrubého čreva. J Proteome Res. (2011) 10:3040–9. doi: 10.1021/pr200019m PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

14. Chen Q, Yan G, Gao M, Zhang X. Ultrasenzitívne profilovanie proteómu pre 100 živých buniek priamou injekciou buniek, online štiepením a analýzou nano-LC-MS/MS. Anal Chem. (2015) 87:6674–80. doi: 10.1021/acs.analchem.5b00808 PubMed Abstract|CrossRef Celý text|Študovňa Google

15. Li S, Plouffe BD, Belov AM, Ray S, Wang X, Murthy SK a kol. Integrovaná platforma na izoláciu, spracovanie a proteomické profilovanie vzácnych buniek v plnej krvi na báze hmotnostnej spektrometrie. Mol Cell Proteomics. (2015) 14:1672–83. doi: 10.1074/MCP.M114.045724 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

16. Chen W, Wang S, Adhikari S, Deng Z, Wang L, Chen L a kol. Jednoduchá a integrovaná technológia na báze spin tipu aplikovaná na hlboké profilovanie proteómu. Anal Chem. (2016) 88:4864–71. doi: 10.1021/acs.analchem.6b00631 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

17. Huang EL, Piechowski PD, Orton DJ, Moore RJ, Qian WJ, Casey CP a kol. SNaPP: zjednodušená nanoproteomická platforma pre reprodukovateľnú globálnu proteomickú analýzu množstva nanogramových proteínov. Endokrinológia. (2016) 157:1307–14. doi: 10.1210/en.{7}} PubMed Abstract|CrossRef Celý text|Študovňa Google

18. Steffes MW, Schmidt D, McCrery R, ​​Basgen JM, International Diabetic Nephropathy Study G. Počet glomerulárnych buniek u normálnych subjektov a u pacientov s diabetom 1. typu.ObličkyInt. (2001) 59:2104-13. doi: 10.1046/j.{6}}.2001.00725.x

PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

19. Tyanova S, Temu T, Cox J. Výpočtová platforma MaxQuant pre brokovnicovú proteomiku založenú na hmotnostnej spektrometrii. Nat Protoc. (2016) 11:2301–19. doi: 10.1038/nprot.2016.136 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

20. Perez-Riverol Y, Csordas A, Bai J, Bernal-Llinares M, Hewapathirana S, Kundu DJ a kol. Databáza PRIDE a súvisiace nástroje a zdroje v roku 2019: zlepšenie podpory pre kvantifikačné údaje. Nucleic Acids Res. (2019) 47:D442–50. doi: 10.1093/var/gky1106 PubMed Abstract|CrossRef Celý text|Študovňa Google

21. Norma I. Základná metóda na stanovenie opakovateľnosti a reprodukovateľnosti štandardnej metódy merania, presnosť (pravdivosť a presnosť) metód a výsledkov merania. Int Organ Standard Part. (1994) 2:5725.

22. Bland JM, Altman GR. Štatistické metódy na hodnotenie zhody medzi dvoma metódami klinického merania. Lancet. (1986) ​​1:307–10. doi: 10.1016/S0140-6736(86)90837-8 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

23. Lundgren DH, Hwang SI, Wu L, Han DK. Úloha spektrálneho počítania v kvantitatívnej proteomike. Expert Rev Proteomics. (2010) 7:39–53. doi: 10.1586/epr.09.69 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

24. Webb-Robertson BJ, Mccue LA, Waters KM, Matzke MM, Jacobs JM, Metz TO, a kol. Kombinované štatistické analýzy intenzít a výskytu peptidov zlepšujú identifikáciu významných peptidov z proteomických údajov na báze MS. J Proteome Res. (2010) 9:5748–56. doi: 10.1021/pr1005247 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google

25. Uhlen M, Fagerberg L, Hallstrom BM, Lindskog C, Oksvold P, Mardinoglu A, et al. Proteomika. Tkanivová mapa ľudského proteómu. Veda. (2015) 347:1260419. doi: 10.1126/science.1260419 PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Google Scholar 26. Schroeder AW, Sur S, Rashmi P, Damm I, Zarinsefat A, Kretzler M, et al. Román ČlovekObličkyPodmnožiny buniek identifikované pomocou Mux-Seq. bioRxiv [Predtlač]. (2020) doi: 10.1101/2020.03.02.973925 CrossRef Celý text|Študovňa Google

27. Marx V. Sen o jednobunkovej proteomike. Metódy Nat. (2019) 16:809–12. doi: 10.1038/s41592-019-0540-6 PubMed Abstract|CrossRef Celý text|Študovňa Google

28. Song L, Fang F, Liu P, Zeng G, Liu H, Zhao Y a kol. Kvantitatívna proteomika na monitorovanie poškodenia obličkového transplantátu. Proteomics Clin Appl. (2020) 14:e1900036. doi: 10.1002/prca.201900036

PubMed Abstrakt|CrossRef Celý text|Študovňa Google