Varianty apolipoproteínu L1 spojené s ochorením obličiek vykazujú zvýšenie funkcie v aktivite katiónového kanála

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Jonathan Bruno a John C. Edwards

Je známe, že varianty apolipoproteínu L1 (ApoL1) sú zodpovedné za zvýšené riziko niektorých progresívnychobličkychorobymedzi ľuďmi afrického pôvodu. ApoL1 je amfitropný proteín, ktorý sa môže vložiť do fosfolipidových membrán a udeliť fosfolipidovým membránam selektívnu aniónovú alebo katiónovo selektívnu permeabilitu v závislosti od pH. Nie je známe, či sa tieto aktivity medzi variantmi líšia alebo či prispievajú k patogenéze ochorenia. Na posúdenie rozdielov medzi izoformami ApoL1 sme použili testy napätím riadeného toku iónov z fosfolipidových vezikúl a asociácie stabilných membrán. Existuje významné (približne dvojnásobné) zvýšenie katiónovo selektívnej iónovej permeázovej aktivity dvoch variantov spojených s ochorením obličiek v porovnaní s referenčným proteínom. Na rozdiel od toho sme medzi izoformami nenašli žiadny rozdiel v aniónovo selektívnej permeázovej aktivite pri nízkom pH. V porovnaní s referenčnou sekvenciou dva varianty spojené s ochorením vykazujú zvýšenú stabilnú asociáciu s fosfolipidovými vezikulami za podmienok, ktoré podporujú aktivitu katiónpermeázy, čo naznačuje, že zvýšená aktivita môže byť spôsobená efektívnejšou membránovou asociáciou a inzerciou. Nie je žiadny rozdiel v membránovej asociácii medzi izoformami za optimálnych podmienok pre aktivitu aniónovej permeázy. Tieto údaje podporujú model, v ktorom zvýšená permeabilita katiónov môže prispieť k progresívnym ochoreniam obličiek spojeným s vysoko rizikovými alelami ApoL1.

Je známe, že dva odlišné varianty v proteíne ApoL1 sú zodpovedné za rozpoznané zvýšené riziko progresívnej proteinuryobličkychorobau ľudí afrického pôvodu, najmä v dôsledku fokálnej segmentálnej glomerulosklerózy, hypertenznej nefrosklerózy a nefropatie spojenej s HIV(1–3). Funkčné úlohy ApoL1 v ľudských bunkách, vplyv variantov spojených s ochorením na tieto funkcie a ako môže nečinnosť takýchto zmien urýchliťochorenie obličieksú nejasné (4, 5).

Jediná biochemická aktivita, o ktorej je známe, že má proteín ApoL1, je fungovať ako iónový kanál. Zistilo sa, že N-koncová doména ApoL1 má štruktúrnu podobnosť s bakteriálnym kolicínom A1 (6). Podobne ako kolicín A1, ApoL1 je amfitropný proteín, ktorý za určitých okolností môže vstúpiť do lipidovej membrány z vodného roztoku a potom fungovať ako iónová permeáza (6–9). Purifikovaný rekombinantný ApoL1 divokého typu je stabilný v roztoku detergentu pri neutrálnom pH (8, 9). Pri nízkom pH môže ApoL1 vstúpiť do fosfolipidových membrán a zvýšiť aniónovo selektívnu permeabilitu membrán (6, 7, 9). Keď sa cis pH zvýši späť na neutrálne, aniónovo selektívna permeabilita je potlačená a aktivuje sa katiónovo selektívny kanál (8, 9). Tieto údaje podporujú model, v ktorom by sa ApoL1, prezentovaný v kyslom kompartmente buď pozdĺž exocytickej alebo endocytovej dráhy, mohol vložiť do obmedzujúcej membrány organely, čo by viedlo k zvýšenej permeabilite aniónov. Následný prenos proteínu do iných membránových kompartmentov, kde by cis pH bolo neutrálne (ako je plazmatická membrána alebo mitochondriálne membrány), by potlačil permeabilitu aniónov a aktivoval katiónpermeázu. Či tieto aktivity iónovej permeázy zohrávajú úlohu v patogenéze ApoL1-spojené sobličkovéchorobyje nejasné.

Použili sme metódy založené na vezikulách na testovanie rozdielov v iónových permeázových aktivitách a membránovej väzbe medzi referenčnou (divokého typu) sekvenciou, označenou G0, a dvomi variantmi spojenými s ochorením, označenými G1 a G2. Zistili sme, že v porovnaní s G0 izoformy G1 aj G2 vykazujú zvýšenú špecifickú aktivitu katiónovej permeázovej aktivity pri neutrálnom pH bez zmeny aniónovo selektívnej permeázovej aktivity pri nízkom pH. Ďalej, izoformy G1 a G2 spojené s ochorením vykazujú zvýšenú stabilnú membránovú asociáciu v porovnaní s G0 za podmienok, ktoré podporujú aktivitu katiónpermeázy, ale nie za podmienok, ktoré podporujú aktivitu permeázy aniónu. Nezistili sme žiadny vplyv na vzorec citlivosti pH ani vo väzbovom kroku, ani v kroku efluxu aktivity katiónového kanála a nezistili sme žiadny vplyv na citlivosť na pH anión-selektívnej permeázovej aktivity. Dospeli sme k záveru, že varianty ApoL1 spojené s ochorením selektívne zvyšujú aktivitu katiónového kanála proteínu, pravdepodobne aspoň čiastočne zvýšením membránovej inzercie. Navrhujeme, aby táto vylepšená aktivita kanála prispela k progresívnostiobličkychorobau ľudí nesúcich vysoko rizikové genotypy.

Cistanche dokáže liečiťochorenie obličiek

Výsledky

Rekombinantné izoformy ApoL1 s odstránenou N-koncovou signálnou sekvenciou a nahradenou 6His/T7 epitopovou značkou boli exprimované a purifikované. Všetky tri vykazovali identické chromatografické vlastnosti počas čistenia a boli nerozoznateľné gélovou elektroforézou Obrázok 1.

Vrcholové frakcie sa zriedili na 100 ug/ml a podrobili sa testom toku vezikúl na schopnosť prenášať chlorid a draslík. Test pozostáva z dvoch samostatných etáp. V asociačnom štádiu sa ApoL1 zmieša s fosfolipidovými vezikulami naplnenými KCl a nechá sa vložiť do membrán. Extravozikulárny KCl a pufor sa potom odstránia prechodom cez odsoľovaciu rotačnú kolónu ekvilibrovanú izotonickou sacharózou, čím sa vytvoria veľké gradienty zvnútra-vonku oboch Kand Cl ióny. Vo fáze efluxu sa eluát z rotačnej kolóny zriedi izotonickým pufrovaným roztokom sacharózy, ktorý udržuje gradient KCl na požadovanom pH. Extravehikulárna koncentrácia Cl sa monitoruje chloridovo selektívnou elektródou. Aj keď je prítomná permeabilita selektívna pre K alebo Cl, ani ión nebude schopný opustiť vezikuly kvôli nedostatku pohybu protiiónu. Napätím riadený eflux iónov sa iniciuje pridaním saturačnej koncentrácie protiiónového ionofóru. Pridanie K-selektívneho ionofóru, valinomycínu (Val), vyvolá veľký vnútorný negatívny membránový potenciál, ktorý, ak je prítomná permeabilita Cl, bude riadiť eflux KCl, ktorý bude detekovaný chloridovo selektívnou elektródou; teda po Val, rýchlosť efluxu Cl odráža permeabilitu Cl. Naopak, pridanie Cl-selektívneho ionofóru, chloridového ionofóru 1 (CI1), vyvolá vnútorný pozitívny membránový potenciál, ktorý bude riadiť eflux KCl, ak je prítomná permeabilita K. Po pridaní CI1 teda rýchlosť efluxu Cl odráža permeabilitu K. Tento test teda môže slúžiť buď ako test permeability Cl alebo K, v závislosti od toho, ktorý ionofór sa použije. Počiatočná rýchlosť toku iónov po pridaní ionofóru sa považuje za špecifickú iónovú permeabilitu vezikúl. Všimnite si, že výtok Cl pred pridaním ionofóru naznačuje určitú permeabilitu pre Kand Cl. Aj za týchto okolností rýchlosť efluxu Cl po pridaní nadbytku protiiónového ionofóru predstavuje permeabilitu pre záujmový ión - Cl po pridaní Val a K po pridaní CI1.

Cistanche dokáže liečiťochorenie obličiek

Chloridová permeázová aktivita

Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že priepustnosť aniónov je najväčšia, keď sa krok membránovej asociácie aj krok efluxu uskutočňujú pri pH 5.0 a tieto podmienky sa použili na porovnanie aktivity priepustnosti Cl troch izoforiem s použitím Val na spustenie Odtok závislý od Cl permeability. Príklady nespracovaných údajov sú znázornené na obrázku 2A, ktorý ukazuje výstup z Cl-selektívnej elektródy v milivoltoch vynesených proti času. Zaznamenávanie sa začína pred pridaním eluátu z kolóny obsahujúceho vezikuly a proteín, pričom hodnota mV odráža koncentráciu Cl 1 0 μM. Eluát z kolóny bez Cl sa pridá k prvej šípke, čím sa Cl zriedi, čo sa prejaví vo vychýlení mV krivky smerom nahor. Pri druhej šípke sa pridá Val, čím sa spustí odtok Cl, ak je prítomná permeabilita Cl, čo sa odráža v progresívnom poklese inmV. Triton X-100 sa pridá k tretej šípke, čím sa uvoľní všetok zostávajúci intravezikulárny chlorid. Po konverzii z mV na koncentráciu chloridu s použitím štandardnej krivky vytvorenej pre elektródu za podmienok testu sa stanoví frakcionovaná rýchlosť uvoľňovania Cl po pridaní Val a berie sa ako priepustnosť pre chloridy. V porovnaní s kontrolou bez proteínu (modrá krivka) vysoká rýchlosť uvoľňovania Cl po pridaní Val naznačuje, že ApoL1 poskytuje podstatnú priepustnosť Cl, ktorá sa zdá byť porovnateľná medzi tromi izoformami (červené, zelené a žlté stopy). Veľmi nízka rýchlosť efluxu pred Val naznačuje, že priepustnosť draslíka je oveľa nižšia ako priepustnosť Cl. Rozsah koncentrácií izoforiem ApoLl sa testoval na Cl permeázovú aktivitu (obr. 2B). Ako už bolo uvedené pre GO, zistili sme, že aktivita Clpermeázy je lineárne spojená s hmotnosťou proteínu v teste pre všetky tri izoformy. Aktivita permeázy pri každej koncentrácii sa medzi týmito tromi izoformami nelíši. Koncentračná krivka sa uskutočnila dvakrát s použitím dvoch rôznych sád proteínových prípravkov, čím sa získal rovnaký výsledok.

Šesť nezávislých prípravkov troch proteínov sa testovalo na aktivitu Cl permeázy pri pH 5.0 ako je zhrnuté na obrázku 2C. V žiadnej zo sérií prípravkov sme nezistili signifikantný rozdiel v aktivite Cl permeázy medzi izoformami (p > 0.{5}}5 na porovnanie G0 s G1 alebo G2 v každom súbore) . Priemerné rýchlosti efluxu všetkých šiestich prípravkov (označených ALL na obr. 2C) boli 1,21 ± 0,32 percent/s pre referenčnú sekvenciu G0, 1,36 ± 0,41 percent/s pre G1 a 1,18 ± 0,34 pre G2 (priemer ± SD, n=6 pre každý; p=0,47 a 0,94 pre porovnanie G0 s G1 a G2, v tomto poradí). Aby sa určilo, či mutácie spojené s ochorením menia citlivosť aniónovej permeázy na pH, bola permeabilita Cl udelená každou izoformou testovaná prostredníctvom rozsahu hodnôt pH s použitím indikovaného pH pre asociačné aj efluxné kroky testu (obr. 2D). významné rozdiely medzi izoformami. Tento experiment sa uskutočnil dvakrát s použitím dvoch rôznych sád proteínových prípravkov, čím sa získal rovnaký výsledok. Aktivita Clpermeázy sa teda významne nelíši medzi dvomi variantmi spojenými s ochorením a referenčnou sekvenciou.

Aktivita permeázy draslíka

Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že priepustnosť katiónov je najväčšia, keď sa krok membránovej asociácie uskutočňuje pri pH 6.0 a krok efluxu sa uskutočňuje pri pH 7,5, a ak nie je uvedené inak, použili sme tieto podmienky. Príklady nespracovaných údajov z K permeázového testu sú znázornené na obrázku 3. Rovnako ako pri testoch permeability Cl sa eluát z kolóny pridá k prvej šípke, ionofor (v tomto prípade Chlorid Ionophore1, CI1) sa pridá k druhej šípke a čistiaci prostriedok sa pridáva podľa tretej šípky. Počiatočné rýchlosti efluxu po pridaní ionofóru, predstavujúce permeabilitu K, sú znázornené sivými prerušovanými čiarami. Modrá krivka je z kontroly bez proteínu, ktorá ukazuje permeabilitu endogénneho pozadia samotných vezikúl. Červená krivka ukazuje aktivitu G0 (divokého typu) variantu, čo jasne demonštruje prítomnosť Kpermeability väčšej ako kontrolné vezikuly udelené proteínom, ako už bolo uvedené (9). Žlté a zelené stopy ukazujú aktivitu variantov G1 a G2. Počiatočné sklony po pridaní ionofóru sú jasne väčšie pre G1 a G2 ako pre G0, čo naznačuje, že varianty spojené s ochorením podporujú väčšiu aktivitu permeázy K ako G0.

Na rozdiel od testu permeability Cl, a ako už bolo uvedené pre izoformu G0 (9), za podmienok testu permeázy K dochádza k určitému odtoku pred ionofórom vo vezikulách obsahujúcich ktorúkoľvek z troch izoforiem, čo predstavuje klesajúci sklon záznamov po pridaní vzorky a pred pridaním ionofóru. Zatiaľ čo vysoká miera efluxu po pridaní ionofóru indikuje prítomnosť podstatnej permeability K, eflux pred ionofórom indikuje tiež prítomnosť určitej permeability Cl, čo umožňuje obom iónom presakovať z vezikúl v neprítomnosti ionofóru. Toto pravdepodobne zodpovedá za otupený nárast výstupu elektródy bezprostredne po pridaní eluátu z rotačnej kolóny a následný sklon smerom nadol pred CI1, ktorý je viditeľný pri všetkých záznamoch obsahujúcich ApoL1. Za predpokladu, že tento únik začína pri prechode vzorky cez odstredivú kolónu, bude tiež zodpovedať za rozdiely v konečnej koncentrácii Cl po pridaní detergentu, pretože akákoľvek strata KCl na rotačnej kolóne by znamenala menej celkového KCl pridaného do testu. Kvantitatívna interpretácia rýchlosti ionofóru nie je jednoduchá, okrem toho, že musí byť funkciou priepustnosti pre Kand Cl. Ako predtým (9), pripisujeme túto aktivitu zvyškovej Cl permeázovej aktivite, ktorú vidíme pri pH 7,5 ako na obrázku 2D (pozri tiež Bruno a kol. (9), obr. 4D).

Testy permeázy draslíka sa uskutočňovali v rozsahu proteínových koncentrácií (obr. 4A). Aktivita bola lineárne úmerná hmotnosti proteínu v teste pre každú izoformu, ale dve izoformy spojené s ochorením vykazovali podstatne zvýšenú efluxnú aktivitu v porovnaní s G0. Táto koncentračná krivka bola reprodukovaná s tromi samostatnými súbormi prípravy proteínov poskytujúcich veľmi podobné výsledky.

Šesť nezávislých prípravkov troch izoforiem sa testovalo na aktivitu efluxu K s použitím 2 ug proteínu v každom teste. V každom zo šiestich súborov bola aktivita pre izoformy G1 a G2 významne vyššia ako aktivita G0 (obr. 4B). Priemer všetkých šiestich súborov údajov priniesol rýchlosti odtoku 0,349 ± 0.063 percent /s pre G{{10}}, {{15} },709 ± 0,176 percent /s pre G1 a 0,673 ± 0,142 percent /s pre G2 (priemer ± SD, n=6 pre každú; p < 0,00001="" pre="" porovnanie="" g0="" s="" g1="" alebo="" g2).="" špecifické="" aktivity="" k="" permeázy="" g1="" a="" g2="" sú="" pri="" tomto="" teste="" 2.{29}}="" a="" 1{31}}krát="" vyššie="" ako="">

Samostatne sa analyzovala závislosť aktivity K permeázy od pH kroku asociácie membrány a kroku efluxu iónov. Hoci sme potvrdili, že celková efluxná aktivita G1 a G2 je väčšia ako aktivita G0 za „štandardných“ podmienok (väzba pri pH 6, eflux pri pH 7,5), nezistili sme žiadny významný rozdiel v tvare krivky medzi aktivitou a vonkajším (cis) pH buď kroku membránovej asociácie (obr. 4C) alebo kroku efluxu iónov (obr. 4D). Tiež sme nezistili žiadne rozdiely medzi izoformami v závislosti aktivity od vysokého intravezikulárneho (trans) pH alebo nevyhnutnosti prítomnosti dvojmocného katiónu (obr. 4E), a ďalej poznamenávame, že vápnik alebo horčík sú rovnako účinné pri poskytovaní potrebného dvojmocného katiónu činnosť. Každý z týchto experimentov sa uskutočnil dvakrát s použitím rôznych súborov purifikovaného proteínu, čím sa získali identické výsledky.

Stabilná membránová asociácia

Už sme predtým demonštrovali, že purifikovaný rekombinantný ApoL1 sa spontánne viaže na fosfolipidové membrány, čo ukazuje podobnú závislosť od pH a fosfolipidového zloženia ako aktivity iónovej permeázy (9). Použitím podobných metód sme porovnávali väzbové vlastnosti lipidových vezikúl referenčnej verzie ApoL1 s variantmi spojenými s ochorením obličiek za podmienok podporujúcich optimálne aktivity Cl alebo K permeázy (obr. 5). Pri podmienkach Clpermeázy sa proteín inkuboval s lipidovým vezikulámom pH 5.0 pred chaotropickou extrakciou na odstránenie proteínov, ktoré neboli stabilne spojené s vezikulami. Proteín viazaný na membránu sa izoloval flotáciou cez sacharosu a vyhodnotil sa kvantitatívnym Western blotom. Výsledky sú znázornené na obrázku 5A. Medzi G{{10}} a izoformami G1 alebo G2 nebol žiadny významný rozdiel v množstve proteínu naviazaného na vezikuly. Z 500 ng proteínu v každej reakcii bolo množstvo viazané na vezikuly 223 ± 33 ng pre G0, 239 ± 38 ng pre G1 a 191 ± 28 ng pre G2 (priemer ± SD n=8 pre každú skupinu, p=0,35 a 0,076 pre porovnanie G0 s G1 a G2, v danom poradí). Približne 40 – 50 percent proteínu v teste sa za týchto podmienok viaže na membrány. Tento experiment bol vykonaný dvakrát s veľmi podobnými výsledkami.

Na posúdenie väzby za podmienok optimálnych pre aktivitu Kpermeázy sa proteín inkuboval s vezikulami pri pH 6.0, potom sa pH posunulo na 7,5 pred chaotropickou extrakciou, aby sa odstránil nestabilne vložený proteín. Proteín naviazaný na membránu sa izoloval flotáciou membránových vezikúl cez acukrózový vankúšik a vyhodnotil sa kvantitatívnym westernovým prenosom. Výsledky sú znázornené na obrázku 5B. Varianty spojené s ochorením vykazujú výrazne účinnejšiu väzbu v porovnaní s G0. Z 500 ng proteínu pridaného do každej reakcie bolo množstvo viazané na vezikuly 43,5 ± 14,5 ng (n=8) pre G{{30}} ,73.0 ± 17,7 ng (n=7) pre G1 a 69,3 ± 10,3 ng (n=8) pre G2 (priemer ± SD; p=0,00076 a 0,0018 na porovnanie G0 s G1 a G2, v danom poradí). Približne 9 percent G0 proteínu v reakcii bolo stabilne spojených s vezikulami v porovnaní s približne 14 percentami G1 a G2 za týchto podmienok. Tento experiment sa uskutočnil dvakrát s použitím nezávislých prípravkov, ktoré poskytli podobné výsledky.

Diskusia

Uvádzame výsledky štúdií iónových permeázových aktivít ApoL1 a jehoobličky-choroba-pridružené varianty, ktoré priniesli niekoľko významných výsledkov. Po prvé, zistili sme, že varianty ApoL1 spojené s ochorením podstatne zvýšili aktivitu Kpermeázy, ktorá je približne dvojnásobná v porovnaní s izoformou G0 v našich testoch. Po druhé, na rozdiel od Kpermeázy neexistujú žiadne významné rozdiely v špecifickej aktivite aktivity Cl permeázy pri pH 5.0 medzi izoformami. Po tretie, medzi izoformami nie sú žiadne rozdiely v pH citlivosti buď K alebo Cl permeázových aktivít, alebo požiadavky na vysoké trans pH a nutnosť dvojmocného katiónu pre Kpermeázovú aktivitu. Po štvrté, za optimálnych podmienok podporujúcich K permeázu varianty spojené s ochorením vykazujú zlepšenú stabilnú membránovú asociáciu v porovnaní s G0, ale žiadny rozdiel v membránovej asociácii za optimálnych podmienok pre aktivitu Cl permeázy.

Naše zistenia preukazujúce zvýšenú permeázu K bez účinku na permeázu Cl sú veľmi robustné. Použitím optimálnych podmienok pre každú aktivitu permeázy sme našli v podstate identické výsledky medzi šiestimi nezávislými súbormi prípravkov, pričom aktivita Kpermeázy variant spojených s ochorením bola významne vyššia ako G0 v každom z nich. Každá sada bola pripravená a testovaná súčasne s použitím bežných činidiel. Platnosť proteínových koncentrácií stanovených testom BCA bola potvrdená porovnateľnou intenzitou farbenia Coomassie na SDS-PAGE. Tieto údaje zahŕňajú všetky úspešné pokusy o simultánne čistenie - nikdy sme úspešne nevygenerovali súbor všetkých troch variantov, v ktorých tieto relatívne aktivity neboli pozorované.

Podobne absencia rozdielov v špecifickej aktivite anión-permeázy pri pH 5 bola konzistentná medzi všetkými súbormi prípravkov. Naším primárnym záverom teda je, že varianty ApoL1 spojené s ochorením poskytujú selektívny zisk funkcie K permeázovej aktivity bez ovplyvnenia Cl permeázovej aktivity, ako bolo testované za optimálnych podmienok pre každú z týchto aktivít. Prítomnosť podstatných rozdielov v aktivite katiónového kanála variantov ApoL1, ktoré korelujú so schopnosťou riadiť ochorenie, má dôsledky na možné patogénne mechanizmy. Selektívna povaha zvýšenej iónovej permeability naznačuje, že zvýšená aktivita katiónovej permeázy variantov spojených s ochorením by mohla prispieť k ochoreniu, ale že aktivita aniónovej permeázy pri nízkom pH, ktorá sa medzi izoformami nelíši, pravdepodobne nebude hrať rozhodujúcu úlohu.

Skúmanie účinkov variantov na pH citlivosti aktivít a na rozsah stabilnej membránovej väzby proteínom objasňuje mechanizmus, ktorým môže byť aktivita K permeázy zvýšená. Po prvé, okrem potvrdenia zvýšenej aktivity K permeázy za optimálnych podmienok sme nezistili žiadne rozdiely v tvaroch kriviek, ktoré ukazujú účinky pH na membránovú asociáciu a efluxné kroky aktivity K permeázy alebo vplyv pH na celkovú aktivitu Cl permeázy. Ďalej, medzi všetkými izoformami neboli žiadne rozdiely v požiadavke na zvýšené pH vo vnútri vezikúl alebo v požiadavke na prítomnosť dvojmocného katiónu v reakcii na aktivitu K permeázy. Preto sme nenašli žiadny dôkaz rozdielu vo vnútorných vlastnostiach samotného kanála. Na rozdiel od toho varianty vykazovali významne zvýšenú stabilnú asociáciu s fosfolipidovými vezikulami za podmienok, ktoré podporujú aktivitu Kpermeázy, pričom rozsah tohto účinku je približne rovnaký ako pri zmene aktivity. Celkovo možno povedať, že údaje naznačujú, že základom zvýšenej aktivity permeázy K je jednoducho efektívnejšia membránová inzercia za podmienok podporujúcich aktivitu, bez potreby vyvolať zásadnú zmenu vlastností vloženého proteínu.

V štruktúre ApoL1 boli identifikované tri domény (6). Predpokladá sa, že aktivita iónového kanála leží v homológnej "pórotvornej" doméne kolicínu, ktorá zaberá asi 60 percent proteínu na jeho N-konci. Sekvenčné variácie spojené s ochorením nie sú v doméne tvoriacej póry, ale ležia v určitej vzdialenosti od nej v coiled-coil doméne, ktorá obsahuje asi 16 percent proteínu na C-konci. Delécia tejto domény nemá žiadny vplyv na trypanolytickú aktivitu, ale je vysoko konzervovaná medzi izoformami Apol v rámci druhu aj medzi druhmi (10). Bolo navrhnuté, že táto oblasť funguje ako kontrolovaná doména (10) a naše údaje naznačujú, že mutanti spôsobujúci ochorenie v tejto doméne skutočne majú zvýšenú membránovú väzbu za podmienok, ktoré podporujú aktivitu katiónových kanálov a zvýšenú aktivitu katiónových kanálov. Jedna interpretácia je, že C-terminálna doména slúži na potlačenie membránovej asociácie/inzercie potrebnej pre aktivitu katiónovej permeázy a mutácia tejto domény túto supresiu uvoľňuje.

Cistanche dokáže liečiťobličkychoroba

Pozorovania membránovej väzby majú ďalšie dôsledky a osvetľujú niektoré aspekty vzťahu medzi aktivitami aniónovej a katiónovej permeázy. Tu sme zistili, že pri optimálnych podmienkach aktivity aniónovej permeázy (pH 5.0) sa na membrány viaže podstatne viac proteínov ako pri podmienkach maximálnej väzby podporujúce aktivitu permeázy katiónov (pH 6.0), a to platí pre všetky izoformy (obr. 5). Všimnite si rozdiel v citlivosti pH aktivity aniónovej permeázy (obr. 2D) a membránového väzbového kroku aktivity katiónpermeázy (obr. 4C): aniónová permeáza sa dramaticky zvyšuje pod pH 6, zatiaľ čo schopnosť proteínu vloženého do membrány podporovať katión permeázová aktivita výrazne klesá. Naše predtým publikované údaje ukázali, že stabilná membránová asociácia G0 podstatne stúpa, keď pH klesá cez rovnaký rozsah pH, ​​a to je rozsah, v ktorom je fluorescencia vlastného proteínu najdramatickejšie potlačená(9), čo naznačuje významný prechod v štruktúre proteínu . Celkovo tieto údaje naznačujú, že membránová inzercia pri pH 6.{12}} je zásadne odlišná od membránovej inzercie pri pH 5.{14}} Pri pH 6.0 sa menšia frakcia proteínov spája s membránami, čo je sprevádzané len malou zmenou vnútornej fluorescencie a obmedzenou permeázovou aktivitou aniónov, ale so schopnosťou prejsť na formu priepustnú pre katión, keď sa cis kompartment titruje na pH 7 .5. Ďalej, účinnosť tejto väzby je väčšia pre varianty spojené s ochorením, paralelne so zvýšenou aktivitou katiónpermeázy po zmene pH. Naopak, pri pH 5.{21}} oveľa väčšia frakcia proteínu je spojená s membránami; toto viazanie je sprevádzané veľkou zmenou vnútornej fluorescencie a objavením sa oveľa väčšej aktivity aniónpermeázy. Ani membránová väzba, ani aktivita aniónpermeázy sa medzi izoformami nelíšia. Kapacita tohto vloženého proteínu prejsť na potvrdenie katiónovej permeázy je značne znížená. Predpokladáme, že predtým uvádzaná zmena vnútornej fluorescencie pri poklese pH zo 6 na 5 odráža štrukturálnu transformáciu na formu, ktorá nie je schopná prejsť na katiónovú permeázovú konformáciu, a rozdiely medzi izoformami nemajú žiadny vplyv na iónové permeázové vlastnosti tejto konformácie.

Ďalším novým pozorovaním je, že ióny vápnika a horčíka sú rovnako účinné pri podpore aktivity katiónového kanála ApoL1. To silne naznačuje, že úloha dvojmocného katiónu nespočíva v nejakej vysokoafinitnej väzbe proteínu, ale skôr v menej špecifickom efekte premosťovania náboja, ktorý umožňuje záporne nabitému proteínu interagovať s negatívne nabitým povrchom fosfolipidových membrán.

Boli publikované ďalšie výskumy hodnotiace rozdiely v aktivite iónových kanálov izoforiem ApoL1. Thompson a Finkelstein (8) použili elektrofyziologické metódy s technikami planárnej lipidovej dvojvrstvy na vyhodnotenie aktivity kanála purifikovaného rekombinantného ApoL1, pričom neuvádzali žiadne rozdiely v charakteristikách kanálov medzi izoformami. Je dôležité poznamenať, že metódy planárnej lipidovej dvojvrstvy a efluxné testy založené na vezikulách, aj keď sú obe kanálové testy, poskytujú rôzne druhy informácií a možno ich považovať za komplementárne experimentálne systémy. Metódy lipidovej dvojvrstvy sú jedinečným prístupom na definovanie jednokanálových vlastností purifikovaného proteínu, ale sú menej výkonnými nástrojmi na kvantifikáciu špecifickej aktivity, zatiaľ čo testy efluxu vezikúl môžu poskytnúť kvantitatívne údaje o aktivite populácie, ale málo informácií o jednokanálových vlastnostiach. Pozorovania Thompa syna a Finkelsteina teda nie sú v rozpore s našimi, ktoré tiež nevykazujú žiadne zjavné rozdiely vo vnútorných vlastnostiach kanála, ale iba približne dvojnásobný rozdiel v špecifickej aktivite, čo je rozsah rozdielov, ktorý by bolo dosť ťažké určiť. detekovať v lipidových dvojvrstvových systémoch.

Výskumy využívajúce purifikovaný proteín a lipidy majú tú výhodu, že odhaľujú vlastnosti, ktoré sú jasne spôsobené samotným proteínom a nie sú zmenené žiadnymi inými zložkami, kinetikou expresie alebo membránovým prenosom, ktoré ohrozujú zložitejšie systémy. O konečnom efekte, ktorý tieto aktivity majú na živé bunky, však nevyhnutne mlčia. Boli hlásené štúdie využívajúce expresné systémy založené na bunkách na testovanie aktivít iónových kanálov ApoL1 (prehľad vo Friedman a Pollak, 2019 (3)). Olabisi et al. (11) exprimovali izoformy ApoL1 v bunkách HEK a hodnotili ustálenú intracelulárnu koncentráciu draslíka. Zistili nižší intracelulárny draslík v bunkách exprimujúcich G1 a G2 v porovnaní s bunkami exprimujúcimi GO. Zatiaľ čo toto pozorovanie by mohlo byť konzistentné so zvýšenou permeabilitou K plazmatickej membrány, nižší intracelulárny K môže byť tiež nešpecifickým dôsledkom väčšieho cytotoxického účinku variantu prostredníctvom akéhokoľvek mechanizmu, čo vedie k menej aktívnej aktivite NaK ATPázy a/alebo narušeniu integrity plazmatickej membrány. O'Toole a kol. (12) starostlivo kalibrovali hladiny expresie v bunkách HEK a hodnotili výskyt aktivity katiónového kanála plazmatickej membrány, pričom našli rozdiely medzi izoformami. Shah a spol. (13) uviedli zacielenie ApoL1 na mitochondrie, kde varianty spojené s ochorením vyvolali otvorenie pórov prechodu mitochondriálnej permeability, čo je v súlade s nedávnymi dôkazmi o cytotoxicite trypanozómov. Či tento účinok vyžaduje aktivitu iónového kanála ApoL1, nie je jasné. Pri každej z týchto štúdií vzhľadom na zložitosť expresných systémov založených na bunkách nie je isté, či nejaké zaznamenané rozdiely sú spôsobené vnútornými vlastnosťami proteínu alebo inými interagujúcimi zložkami prítomnými v bunkách.

Patogénne mutácie so ziskom funkcie zvyčajne vykazujú dominantný vzor dedičnosti, zatiaľ čofenotyp ochorenia obličiekspojený s variantmi ApoL1 je recesívny. Jedným z mechanizmov, ktorým môže byť mutácia so ziskom funkcie recesívna, je, ak proteín funguje ako homomultimér a WT môže mať dominantne negatívny účinok na aktivovaný variant. V súčasnosti nie je známe, či ApoL1 funguje ako kanál ako monomér alebo multimér.

Naše údaje naznačujú, že zvýšená permeabilita katiónov pri podobných úrovniach expresie proteínov by mohla prispievať k tocytotoxicite v podocytoch alebo iných bunkách. Môže sa však zdať nepravdepodobné, že len dvojnásobné zvýšenie aktivity by mohlo premeniť zdanlivo benígnu molekulu na jednu hnaciu chorobu. Choroby spojené s variantmi ApoL1 však majú tendenciu pomaly progresívne a jemné rozdiely počas dlhšieho časového obdobia (mesiace až roky) by mohli mať veľký kumulatívny účinok. Iné potenciálne mechanizmy pôsobenia ApoL1 zodpovedné zaobličkyzranenieboli navrhnuté a sú podporené dôkazmi (3–5, 11–16), vrátane účinkov na onapoptózu, autofágiu, mitochondriálnu funkciu, intracelulárny prenos cez membránu a sprostredkujúce účinky extracelulárnych signálnych molekúl. Relatívna dôležitosť rozdielov v aktivite kanála ApoL1 opísaná v tomto dokumente v porovnaní s inými potenciálnymi mechanizmami účinku pri riadení ochorenia zostáva ešte určiť.

Cistanche dokáže liečiťobličkychoroba

Experimentálne procedúry

Výrazové konštrukty

pET-ApoWT kódujúci N-koncový 6His a T7 epitopom označený ApoL1 (G0 verzia) boli opísané skôr (9). Kódovaný proteín je identický s proteínom prístupového čísla Genbank č. BC143038 (haplotyp 150K, 228I, 255K) od aminokyseliny 28 do 398, čím sa eliminuje signálna sekvencia v aminokyselinách 1–27 as pridaním N-konca {{ 17}} His a T7 epitop tagsen kódovaný plazmidom pET28a. Plazmidy kódujúce varianty G1 a G2 sa generovali z pET-ApoWT substitúciou restrikčného fragmentu AleI za Xhol fragmentmi obsahujúcimi variantné sekvencie, syntetizované Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, a identita výsledných plazmidov bola potvrdená priamym sekvenovaním. Všetky tri konštrukty boli identické s výnimkou substitúcií aminokyselín S342G a I384M v izoforme G1 a delécie N388-Y389 v izoforme G2. Rekombinantné izoformy ApoL1 boli exprimované v baktériách a purifikované tak, ako je opísané (8), s výnimkou toho, že tlmivý roztok kolóny S200 obsahoval 0,03 percent n-dodecyl- -D-maltozidu (DDM) (Millipore-Sigma). Pre všetky sady experimentov porovnávajúce izoformy boli materiály pripravené v rovnakom čase za rovnakých podmienok s použitím rovnakých činidiel. Koncentrácia proteínu sa stanovila pomocou súpravy BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) s použitím štandardu hovädzieho sérového albumínu. Pre celkový proteín ako na obrázku 1 boli gély zafarbené Instant Blue (Expedeon Inc). Proteín v S200 tlmivom roztoku sa bleskovo zmrazil v tekutom dusíku a skladoval pri -80 °C. Alikvóty sa pred testami rozmrazili na ľade a zriedili v tlmivom roztoku S200.

Ionofory

Valinomycín (Millipore Sigma) sa rozpustil v 50 mM v absolútnom etanole a bezprostredne pred použitím sa zriedil na 1 mM v absolútnom etanole. Chlorid Ionophore 1 (MilliporeSigma) sa rozpustil pri 100 mM v 1-hexanole a bezprostredne pred použitím sa zriedil na 0,2 mM v absolútnom etanole.

Membránové vezikuly

Azolektín (sójový fosfatidylcholín typu II, Sigma) bol extrahovaný acetónom, ako je opísané (30), vysušený a potom rozpustený v chloroforme a uskladnený pri -20 °C. Alikvotná časť fosfolipidov v chloroforme bola vysušená pod prúdom dusíka a suspendovaná pri 20 mg/ml v 200 mM KCI, 5 mM HEPES pH 8,0 piatimi cyklami zmrazovania a rozmrazovania a energickým vortexovaním. Táto suspenzia sa skladovala pri teplote -20 stupňov. Na vytvorenie unilamelárnych vezikúl naplnených KCI s priemerom približne 200 nm sa lipidová suspenzia nechala prejsť 15-krát cez 200 nm porépolykarbonátový membránový filter s použitím komory extrudéra (Avanti Polar Lipids) a protokolu poskytnutého výrobcom (17, 18). Extrudované vezikuly sa udržiavali na ľade a použili sa do 24 hodín.

Testy aktivity

Testy aktivity iónovej permeázy s použitím odtoku KCl riadeného membránovým potenciálom detegovaného pomocou chloridovej selektívnej elektródy sa uskutočnili tak, ako bolo opísané vyššie (9). Pridá sa dvadsať mikrolitrov ApoL1 v S2 00 pufri (15{{20}} mM NaCl, 10 mM Tris pH 8,3, 0,3 percenta DDM). do 380 ul reakčnej zmesi zloženej z 82 mM KCl, 127 mM sacharózy, 42,1 mM pufra pri uvedenom pH (MES pre pH 5 – 6,5, HEPES pre pH 7,0 – 8,0), 2,63 mMCa (glukonát)2 a 1,84 mg/ml extrudovaného izolektínu Zmes sa inkubuje pri teplote miestnosti počas 4 minút pred pasážou cez 3 ml Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad) spinkolónu ekvilibrovanú v 330 mM sacharóze. Eluát sa ihneď pridá do 2 ml 330 mM sacharózy, 10-5 M KCl, 2,5 mM Ca(glukonátu)2 a 10 mM pufra (MES pre pH 5–6,5; HEPES pre pH 7–8), ako je uvedené, s kontinuálnym monitorovaním pomocou chloridovej selektívnej elektródy a zaznamenával sa, ako je opísané. Po 20 sekundách sa napätím riadený eflux inicioval pridaním ionofóru (2,5 ul buď 1 mM valinomycínu alebo 0,2 mMCchloridového ionofóru 1 v etanole) a nechal sa pokračovať 30 s nasledovalo pridanie Tritonu X-100 do 0,1 percenta, aby sa uvoľnil zostávajúci intravezikulárny chlorid. Surové údaje v mV boli prevedené na koncentráciu Cl použitím štandardnej krivky vytvorenej pre elektródu za podmienok testu. Počiatočné frakčné rýchlosti uvoľňovania chloridu boli odvodené od 3 s počas maximálnej okamžitej odozvy na pridanie ionofóru.

Všetky porovnania aktivity sa uskutočňovali s použitím materiálu zo simultánnych prípravkov troch izoforiem, ktoré boli pred testom zriedené na 100 ug/ml proteínu v pufri S200. Všetky testy použité na priame porovnanie medzi variantmi sa uskutočnili v rovnaký deň s použitím rovnakých čerstvo pripravených činidiel.

Test asociácie membrán

Membránové asociačné testy sa uskutočňovali oddelene za podmienok optimálnych pre aktivitu Cl permeázy a pre aktivitu K permeázy. Pre podmienky podporujúce aktivitu Clpermeázy 5 ul 100 ug/ml proteínu v 1{{30}} mM Tris pH8,2, 150 mM NaCl 0,03 percent DDM sa pridalo do 95 ul reakčnej zmesi (3,4 mg/ml izolektínové vezikuly (naplnené 200 mM KCI, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 5,0, 2,5 mM Ca (glukonát) 2, 100 mM KCI, 100 mM sacharóza) a inkubovali sa pri teplote miestnosti počas 1 minúty. Pomer proteínu k lipidu v teste je 1:680 hmotnosť/hmotnosť. Vzorka sa zriedila bez zmeny pH pridaním 200 ul 60 mM MES pH 5,0, 2,5 mMCa(glukonátu)2, 100 mM KCI, 100 mM sacharózy a inkubovala sa 20 sekúnd. Pridalo sa 100 mikrolitrov 8 M močoviny, premiešalo sa a potom sa inkubovalo pri teplote miestnosti 15 minút. Koncentrácia sacharózy sa zvýšila na 40 % pridaním 1,6 ml 50 % sacharózy. 2 ml vzorka sa navrstvila pod 1 ml 30 percent sacharózy v 8 mM MES pH 5,0, čo bolo zase pod 1,7 ml bezsacharózy 8 mM MES pH 5,0. Strmé gradienty sa centrifugovali pri 200,{56}}g v Beckman Coulter TLA{57}}rotore počas 90 minút pri teplote 4 °C. Vezikuly sa odobrali z rozhrania s 0 až 30 percentami sacharózy. Rovnaké frakcie vzoriek sa 4-násobne zriedili a centrifugovali pri 100,000g počas 1 hodiny. Membránové pelety sa vysušili, oddelili pomocou SDS-PAGE, blotovali na polyvinylidénfluoridovú membránu a sondovali westernovým prenosom s protilátkou proti T7 epitopu (MilliporeSigma product no. 69522-3) s chemiluminiscenčnou detekciou pomocou digitálneho zobrazovacieho systému. Sériové riedenia purifikovaného proteínu boli zahrnuté do gélu, aby sa vytvorila izotypová a blot-špecifická štandardná krivka pre každý proteín.

Pre podmienky podporujúce aktivitu permeázy K sa 5 ul 100ug/ml proteínu v 10 mM Tris pH 8,2, 150 mM NaCl, 0,03 % DDM pridalo do 95 ul reakčná zmes (3,4 ug/ml izolektínové vezikuly (naplnené 200 mM KCI, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 6,0, 2,5 mM Ca(glukonát)2, 100 mM KCI, 100 mM sacharóza) a inkubované pri teplote miestnosti min. Vzorka sa zriedila s posunom pH na 7,5 pridaním 200 ul 60 mM HEPES pH 8,0, 2,5 mM Ca(glukonátu)2, 100 mM KCI, 100 mM sacharózy a inkubovala sa 20 s. Pridalo sa 100 mikrolitrov 500 mM Na2C03 a inkubovalo sa pri teplote miestnosti 15 minút. Koncentrácia sacharózy sa zvýšila na 40 % pridaním 1,6 ml 50 % sacharózy. 2 ml vzorka sa navrstvila pod 1 ml 30 percent sacharózy v 8 mM Tris pH 8,3, čo bolo zase pod 1,7 ml bezsacharózy 8 mM Tris pH 8,3. Sacharózové vankúšiky sa odstredili a vzorka sa odobrala a spracovala ako je uvedené vyššie.

Štatistiky

Významnosť rozdielov medzi pármi priemerov v súboroch údajov bola stanovená pomocou analýzy rozptylu (ANOVA) (19). Štatistické parametre boli určené pomocou funkcie zabudovanej v Exceli. Hodnoty P boli vypočítané pomocou socscistatistics.com. Všetky údajové body sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka (SD), určená pomocou funkcie STDEV.S Excelu pre každú jednotlivú skupinu replík.

Dostupnosť údajovVšetky údaje podporujúce tento dokument budú na požiadanie zdieľané s Dr. Johnom C. Edwardsom, john.edwards@health.slu.edu.

Cistanche dokáže liečiťobličkychoroba

Poďakovanie—Ďakujeme oddeleniu nefrológie a oddeleniu interného lekárstva Saint Louis University za podporu nevyhnutnú pri vykonávaní tejto práce.

Autorské príspevky—JCE navrhol a dohliadal na štúdiu, zabezpečil financovanie, vykonal efluxné testy, interpretoval údaje a napísal dokument; JB purifikoval proteíny, vykonal membránové asociačné testy, interpretoval údaje, pripravil obrázky a upravil papier.

Financovanie a ďalšie informácie—Práca bola financovaná z inštitucionálnych zdrojov Saint Louis University a grantom National Institutes of Health R01 DK120651 pre JCE Za obsah tohto dokumentu sú výlučne zodpovední autori a nemusí predstavovať oficiálne názory National Institutes of Health.

Konflikt záujmov—Autori vyhlasujú, že nie sú v konflikte záujmov s obsahom tohto článku.

Skratky—Používané skratky sú: ApoL1, apolipoproteínL1; CI1, chloridový ionofór 1; DDM, n-dodecyl- -D-maltozid; PVDF, polyvinylidénfluorid; SD, štandardná odchýlka; Val, valinomycín.

Od: 'Obličky-choroba-asociované varianty apolipoproteínu L1 vykazujú zosilnenie funkcie v aktivite katiónového kanálaJonathan Bruno a John C. Edwards

---J. Biol. Chem. (2021) 296 100238

Referencie

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Uscinski Knob, AL, Bernhardy, AJ, Hicks, PJ, Nelson, GW, Vanhollebeke, B., Winkler, CA, a kol. (2010) Asociácia trypanolytických variantov ApoL1 sobličkychorobau Afroameričanov. Science 329, 841–845
2. Parsa, A., Kao, WH, Xie, D., Astor, BC, Li, M., Hsu, CY, Feldman, HI, Parekh, RS, Kusek, JW, Greene, TH, Fink, JC, Anderson AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP a kol. (2013) APOL1 rizikové varianty, rasa a progresia chronickýchobličkychoroba. N. Engl. J. Med. 369, 2183-2196
3. Friedman, DJ a Pollak, MR (2020) APOL1 aobličkychoroba: Od genetiky k biológii. Annu. Physiol. 82, 323-342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF a Sedor, JR (2017) Identifikácia intracelulárnej funkcie APOL1. J. Am. Soc. Nephrol. 28, 1008-1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H. a Okamoto, K. (2018) Nefropatie apolipoproteínu L1: 2017 v prehľade. Curr. Opin. Nephrol. Hypertenzia. 27, 153-158
6. Perez-Morga, D., Vanhollebeke, B., Paturiaux-Hanocq, F., Nolan, DP, Lins, L., Homble, F., Vanhamme, L., Tebabi, P., Pays, A., Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R., a Pays, E. (2005) Apolipoproteín LI podporuje lýzu trypanozómov vytváraním pórov v lyzozomálnych membránach. Science 309, 469–472
7. Harrington, JM, Howell, S. a Hajduk, SL (2009) Membránová permeabilizácia trypanozómovým lytickým faktorom, cytolytický ľudský lipoproteín s vysokou hustotou. J. Biol. Chem. 284, 13505–13512
8. Thomson, R. a Finkelstein, A. (2015) Ľudský trypanolytický faktor APOL1 tvorí katiónovo selektívne kanály riadené pH v planárnych lipidových dvojvrstvách: Relevantnosť pre lýzu trypanozómov. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 112, 2894–2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J., a Edwards, JC (2017) Apolipoproteín L1 udeľuje fosfolipidovým vezikulám priepustnosť iónov s prepínaním pH. J. Biol. Chem. 292, 18344–18353
10. Vanhollebeke, B., and Pays, E. (2006) The function of apolipoproteins L. Cell Mol. Life Sci. 63, 1937–1944
11. Olabisi, OA, Zhang, JY, Verplank, L., Zahler, N., DiBartolo, S., 3., Heneghan, JF, Schlondorff, JS, Suh, JH, Yan, P., Alper, SL, Friedman, DJ a Pollák, MR (2016) APOL1obličkychorobarizikové varianty spôsobujú cytotoxicitu vyčerpaním bunkového draslíka a indukciou
stresom aktivované proteínkinázy. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 113, 830–837
12. O'Toole, JF, Schilling, W., Kunze, D., Madhavan, SM, Konieczkowski, M., Gu, Y., Luo, L., Wu, Z., Bruggeman, LA a Sedor, JR (2018) Nadmerná expresia ApoL1 riadi cytotoxicitu nezávislú od variantov. J. Am. Soc. Nephrol. 29, 869-879
13. Shah, SS, Lannon, H., Dias, L., Zhang, JY, Alper, SL, Pollak, MR a Friedman, DJ (2019) APOL1obličkyrizikové varianty indukujú bunkovú smrť prostredníctvom mitochondriálnej translokácie a otvorenia prechodového póru mitochondriálnej permeability. J. Am. Soc. Nephrol. 30, 2355-2368
14. Hayek, SS, Koh, KH, Grams, ME, Wei, C., Ko, YA, Li, J., Samelko, B., Lee, H., Dande, RR, Lee, HW, Hahm, E. , Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V., a kol. (2017) Tripartitný komplex suPAR, rizikových variantov APOL1 a integrínu alfavbeta3 na podocytoch sprostredkováva chronickéobličky choroba. Nat. Med. 23, 945-953
15. Ma, L., Chou, JW, Snipes, JA, Bharadwaj, MS, Craddock, AL, Cheng, D., Weckerle, A., Petrovic, S., Hicks, PJ, Hemal, AK, Hawkins, GA, Miller, LD, Molina, AJ, Langefeld, CD, Murea, M., a kol. (2017) Varianty s renálnym rizikom APOL1 indukujú mitochondriálnu dysfunkciu. J. Am. Soc. Nephrol. 28, 1093-1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z. a Hu, CA (2008) Apolipoproteín L1, nová homológna doména Bcl-2 {{4 }} iba proteín viažuci lipidy, indukuje autofagickú bunkovú smrť. J. Biol. Chem. 283, 21540–21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G. a Cullis, PR (1985) Výroba veľkých unilamelárnych vezikúl rýchlym postupom vytláčania: Charakterizácia distribúcie veľkosti, zachyteného objemu a schopnosti udržať membránový potenciál. Biochim. Biophys. Acta 812, 55–65
18. Olson, F., Hunt, CA, Szoka, FC, Vail, WJ a Papahadjopoulos, D. (1979) Príprava lipozómov s definovanou distribúciou veľkosti extrúziou cez polykarbonátové membrány. Biochim. Biophys. Acta 557, 9–23
19. Armitage, P. (1971) Statistical Methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Spojené kráľovstvo