Transplantácia obličky

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

ZAVEDENIE

Obličkatransplantáciaje najlepšou voľbou pre liečbu chronického ochorenia obličiek v konečnom štádiu. V súčasnosti sa ako hlavná príčina chronického poškodenia obličkového štepu objavila odmietnutie sprostredkované protilátkou sprostredkovanou protilátkou (AMR), ktorá sa vyznačuje prítomnosťou protilátky špecifickej pre darcu (DSA) zameranej na ľudský leukocytový antigén (HLA), ktorá je hlavnou príčinou chronického poškodenia obličkového štepu, ktoré do značnej miery obmedzuje dlhodobé prežitie štepu. (1, 2). Existujúce systémy však nedosiahli sľubné výsledky v klinickomliečba AMR (1, 3, 4). Preto existuje naliehavá potreba identifikovať potenciálne biomarkery a rizikové faktory pre AMR po transplantácii obličiek, ktorá je rozhodujúca pre liečbu a výsledky pacientov.

Akumulačné dôkazy naznačujú, že za zápalových okolností sa B bunky môžu diferencovať na plazmablasty vylučujúce protilátky a regulačné B bunky (Bregs), čo je špeciálna podmnožina B buniek, ktorá vylučuje imunosupresívne cytokíny, najmä interleukín (IL)-10. (1, 5–7). Plazmablasty teda produkujú aloantibodies, čo vedie k AMR, zatiaľ čo Bregs vykazujú imunoregulačné funkcie a pomáhajú indukovať imunitnú homeostázu. Preto sa uvádza, že Bregs je úzko spojený s rezistenciou na AMR po transplantáciách obličiek (1, 8, 9).

Hoci odlišné povrchové markery podskupín Breg ešte neboli identifikované u ľudí (1), predchádzajúce štúdie hlásili štyri bežné subpopulácie Bregs: pamäť Bregs (mBregs) definovaná s CD19 + CD24 + CD27 + CD27+ (10), prechodné Bregs (tBregs) definované s CD19 + CD24 + CD38+ (10, 11), pamäť Bregs produkujúca IL -10 + (IL-10+ mBregs) definovaná s CD19 + CD24 + CD27 + IL-10+ (12), a vyrába IL-10prechodné bregy (IL-10+ tBregs) definované CD19 + CD24+ CD38 + IL-10+ (13). Laguna-Goya et al. uviedli, že zníženie tBregs a IL-10+ tBregs je pozitívne spojené s akútnym odmietnutím po transplantácii obličiek (14). Zhou a spol. však uviedli, že mBregs, a nie tBregs, sa výrazne znížil u piatich pacientov s akútnym odmietnutím po transplantácii pečene (10). Okrem toho Shabir a spol. uviedli, že tBregs neboli spojené s odmietnutím alograftu obličiek u troch pacientov s AMR (15). Vzhľadom na tieto nekonzistentné výsledky je potrebné ďalej objasniť, ktorá subpopulácia Breg hrá dôležitú úlohu u pacientov s AMR po transplantáciách obličiek.

V tejto štúdii sa podiely štyroch subpopulácií cirkulujúcich bregov porovnávali medzi zdravými, stabilnými (ST) a AMR skupinami. Potom sa určila biodistribúcia B-buniek, IL-10 a chemokínov v obličkových štepoch zdravých pacientov so ST a AMR. Okrem toho sa skúmala dynamika štyroch subpopulácií cirkulujúcich bregov u pacientov ST počas 90 dní po operácii. Tieto súčasné výsledky spolu tie, ktoré boli hlásené v predchádzajúcich štúdiách (1), naznačujú, že cirkulujúce IL-10+ mBregs a IL-10+ tBregs sú vedúcimi subpopuláciami Breg, ktoré prispievajú k rezistencii AMR.

Prášok Cistanche tubulosaZabraňujeochorenia obličiekkliknite sem a získajte vzorku

Kľúčové slová:Fenotypizácia Breg, transplantácia obličiek, odmietnutie sprostredkované protilátkami, homeostáza, dynamická

MATERIÁLY A METÓDY

Pacienti a skupiny

Všetci pacienti poskytli podpísaný informovaný súhlas pred štúdiou. Táto štúdia bola schválená etickou komisiou Prvej pridruženej nemocnice Univerzity Zhengzhou (2018-KY-72). Registračné číslo klinického skúšania je ChiCTR1900022501.

Títo pacienti boli rozdelení do troch skupín: (1) zdravá kontrolná skupina (zdravá, n = 9): zdraví darcovia obličiek do 18 – 55 rokov (bez ochorenia), pozostávajúci zo súrodencov a manželov príjemcov; (2) príjemcovia so stabilnou funkčnou skupinou štepu (ST, n = 25): pacienti vo veku do 18 – 55 rokov, ktorých funkcia obličiek bola stabilná (bez infekcie alebo odmietnutia pred a po transplantácii obličky) počas sledovaného obdobia (≥6 mesiacov); (3) príjemcovia s AMR skupinou (AMR, n = 18): pacienti vo veku do 18 – 55 rokov, ktorým bola diagnostikovaná AMR. Obličkové štepy príjemcov so ST a AMR boli získané odzdravý darca obličieks. Diferenciálnu diagnózu medzi skupinami ST a AMR potvrdili dvaja patológovia obličiek podľa konsenzu Banff 2017 (3, 16).

Periférna krv, obličkové tkanivá a vzorky buniek

Vzorky periférnej krvi zo zdravej skupiny boli odobraté pred operáciou a po 1, 7 a 14 dňoch po operácii. Vzorky získané zo skupiny ST boli odobraté pri predoperácii a po 1, 7, 14, 30 a 90 dňoch po operácii. Vzorky získané zo skupiny AMR boli odobraté, keď došlo k odmietnutiu (pred antirejekčnou liečbou AMR). Periférne krvi mononukleárne bunky (PBMC) boli izolované z

5 ml krvi ficoll-paque gradient odstreďovaním a konzervované 10% dimetylsulfoxidom (Solarbio Inc., Peking, Čína) v tekutom dusíku.

Vzorky biopsie obličiek základnej ihly získané zo zdravej skupiny boli odobraté pred operáciou na biopsiu obličiek darcu s nulovým časovým limitom. Vzorky biopsie obličiek základnej ihly získané zo skupiny ST boli odobraté po 90 dňoch po operácii po stabilizácii funkcie obličiek v dôsledku protokolálnej biopsie. Vo svetle druhého poruchy defektu funkcie obličiek všetci pacienti s AMR odmietli biopsiu obličiek v základnej ihle po antirejekčnej liečbe AMR. Vzorky biopsie obličiek z amr skupiny sa teda odobrali len vtedy, keď došlo k odmietnutiu (pred antirejekčnou liečbou AMR). Celkom traja zdraví darcovia, deväť st pacientov a deväť pacientov s AMR poskytlo podpísaný informovaný súhlas pred biopsiou obličiek základnej ihly. Zvyšných šesť zdravých darcov, 16 st pacientov a deväť pacientov s AMR odmietlo biopsiu obličiek základnej ihly kvôli strachu z veľkého krvácania v súvislosti s biopsiou. Jednotlivé bunky boli izolované zo vzoriek biopsie obličiek základnej ihly troch zdravých darcov, troch pacientov so ST a troch pacientov s AMR kombináciou mechanickej disociácie s enzymatickou degradáciou extracelulárnej matrice, ktorá udržuje štrukturálnu integritu tkanív (Multi Tissue Dissociation Kit 1; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Nemecko). Obličkové bunky sa zachovali s 10% dimetylsulfosoxidom (Solarbio Inc., Peking, Čína) v tekutom dusíku a zvyšné vzorky biopsie obličiek jadra ihly boli vložené do parafínu pri teplote 4 °C.

Prietoková cytometria

Bunky uložené v tekutom dusíku sa rýchlo rozmrazili vo vodnom kúpeli nastavenom na 37 °C po dobu 3 minút. Celkom 2 - 3 × 106 PBMC bolo inkubovaných stimulačným koktailom Roswell Park Memorial Institute 1640 (500×), ktorý pozostával z PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate), ionofóru vápenatého (Ionomycín) a inhibítorov transportu bielkovín Brefeldin A a Monensin (eBioscience, San Diego, CA), pri teplote 37 °C s 5% CO2 počas 5 h. Odumreté bunky boli vylúčené farbením 7-aminoactinomycínom D (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) a povrchové markery Bregov boli zafarbené protilátkami označenými fluorochrómom (Brilliant Violet 421™ protiľudské CD19, fykoerythrin (PE)/Cy7 protiľudské CD24, Alexa FluorR647 protiľudské CD27, Alexa FluorR488

protiľudské CD38 a brilantná Fialová 510™ protiľudské CD45; vhodné ovládanie izotypu: Brilantná fialová 421™ myš

IgG1 k Isotype Control, PE/Cy7 Mouse IgG2a k Isotype Control, Alexa FluorR647 Mouse IgG1 k Isotype Control, Alexa FluorR488 Mouse IgG1 k Isotype Control a Brilliant Violet

510™ Mouse IgG1 k Isotype Control; Biolegend, San Diego, CA,

USA) po dobu 30 minút pri teplote 4 °C, s ochranou pred svetlom. V prípade intracelulárneho zafarbenia boli bunky zafarbené protilátkami zameranými na intracelulárne cytokíny Bregsu (PE anti-ľudský IL-10; príslušné izotypové kontroly: PE Rat IgG1 k Isotype Control; Biolegend, San Diego, CA, USA) po dobu 30 minút pri izbovej teplote, s ochranou pred svetlom. Označené bunky boli analyzované pomocou nástroja BD Biosciences Canto II (BD Biosciences, USA). Celkovo bolo v bráne lymfocytov získaných 100 000 udalostí. Analýza údajov bola vykonaná pomocou softvéru FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA, USA).

Imunohistochémia

Imunohistochémia farbenie CD19, IL-10 a C-X-C motívu chemokínu 13 (CXCL13) v obličkových tkanivách bolo vykonané. Stručne povedané, 4 mm úseky získané zo vzoriek obličkového tkaniva s formalínom fifixovaným parafínom boli inkubované vzorkami obličkového tkaniva s 1:500 zriedeným anti-CD19, 1:1000 zriedeným antiCXCL13 (králik anti-ľudský; Abcam, Cambridge, Spojené kráľovstvo) a 1:500-zriedený anti-IL-10 (králik anti-človek; Absin, Šanghaj, Čína) primárne protilátky cez noc pri teplote 4 °C, po ktorých nasleduje chrenová peroxidáza konjugovaná 1:20 000 zriedená kozia antirabbit sekundárna protilátka (Abcam, Cambridge, UK) počas 1 h pri izbovej teplote a potom 3,3′-diaminobenzidín ďalších 10 minút. DAPI sa objavuje modrou farbou. Snímky imunohistochémie boli získané pomocou Aperio ScanScope AT Turbo (Aperio, Vista, CA). Čísla pozitivít CD19, IL-10 a CXCL13 boli hodnotené nasledovne: 0 pozitivity, skóre = nula; 1 – 5 pozitivít, skóre = jeden; 6 – 10 pozitivít, skóre = dva; 11 – 20 pozitivít, skóre = tri; >20 pozitivita, skóre = štyri

Štatistická analýza

V vnorenej prípadovo-kontrolnej štúdii bola analýza krivky prevádzkovej charakteristiky prijímača (ROC) vykonaná spoločnosťou MedCalc v18.11.3. Zvyšné štatistické analýzy boli vykonané pomocou IBM SPSS 21.0. Normálne distribuované údaje o meraní s homogenitou rozptylu boli vyjadrené ako stredná ± smerodajnej odchýlky (x ± s) a analyzované nezávislým t-testom vzorky (porovnania medzi skupinami) alebo jednosmernou analýzou rozptylu (porovnania medzi skupinami). Údaje o meraní, ktoré nemali normálnu distribúciu alebo homogenitu rozptylu, boli vyjadrené v mediáne s medzikvartilovým rozsahom (IQR) a analyzované Mann-Whitney U testom (porovnania medzi skupinami) alebo Kruskal-Wallisovým testom (porovnania medzi skupinami). Údaje o počte boli analyzované testom c2, opraveným testom c2 alebo Fisherovým presným testom podľa potreby. Jednosmerná analýza opakovaných opatrení rozptylu

Používa sa v rôznych časových úsekoch. Hodnoty P<0.05 were="" considered="" statistically="">

VÝSLEDKY

Východiskové charakteristiky pacientov

Do tejto štúdie bolo zahrnutých celkovo deväť zdravých darcov, 25 st pacientov a 18 pacientov s AMR. Ako je uvedené v tabuľke 1, pohlavie príjemcov, vek, index telesnej hmotnosti (BMI), počiatočná nefropatia, nesúlad HLA, CNI, čas teplej ischémie a čas studenej ischémie sa nelíšili medzi skupinami ani medzi skupinami (P > 0, 05 pre všetkých). Výskyt antitriedy I aj antitriedy II DSA-pozitivita v skupine AMR bol však výrazne vyšší v porovnaní s tými, ktorí boli v skupine ST (P< 0.001="" for="" anti-class="" i="" dsa,="" p="">< 0.001;="" p="0.001" for="" anticlass="" ii="" dsa).="" furthermore,="" compared="" with="" st="" patients,="" amr="" patients="" had="" signifificantly="" higher="" scores="" in="" tubulitis="" (t),="" interstitial="" inflflammation="" (i),="" and="" peritubular="" capillaritis="" (ptc)="" (p="0.012" for="" t;="" p="">< 0.001="" for="" i="" and="" ptc),="" according="" to="" the="" banff="" classifification="" (normal,="" score="0;" mild,="" score="1;" moderate,="" score="2;" severe,="" score="3)" (3,="" 16)="" (supplemental="" tables="" 1="" and="">

cistanche echinacozidza cukrovka