Cistanche zlepšuje infekciu obličiek v dôsledku systémového lupus erythematosus
Mar 13, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Pre časť 1 kliknite sem.
DISKUSIA
Charakteristickým znakom je prerušenie tolerancie voči jadrovým antigénomsystémový lupuserythematosusa okrem B buniek sa predpokladá, že autoreaktívne T bunky hrajú ústrednú úlohu v jej patogenéze. Avšak, ako detekcia (auto)antigén-špecifickéCD4plus T bunky stále predstavujú veľkú výzvu vo výskume autoimunity, doteraz je v skutočnosti málo známe o CD4 reaktívnej s jadrovým antigénomplusT bunky vsystémovýlupuserythematosus.
Nedávno boli vyvinuté nové metódy detekcie a počítania antigén-špecifického CD4plusBoli vyvinuté T bunky. Prístup knižnice T-buniek využíva predchádzajúcu polyklonálnu expanziu T-buniek na umožnenie detekcie vzácnych klonov T-buniek špecifických pre antigén. Táto stratégia ponúka vysokú citlivosť a umožňuje prácu s obmedzeným množstvom buniek. Pomocou tejto techniky sme boli schopní demonštrovať reaktívne T bunky proti 5 kanonickým jadrovým antigénom u pacientov s aktívnymisystémovýlupuserythematosus. Nevýhody detekcie založenej na knižnici sú okrem toho, že je náročná na prácu, že nemožno vylúčiť rast alebo stratu určitých klonov počas fázy expanzie a obmedzené možnosti fenotypovej analýzy buniek.
Štandardná spoločná cytometria je obmedzená počtom detegovateľných udalostí, čo zvyčajne obmedzuje analýzu vzoriek na populáciu s frekvenciou nad 0,01 percenta. Naše pozorovanie pomocou knižnice T-buniek odhalilo, že frekvencia cirkulujúceho autoreaktívneho CD4plusT bunky pre konkrétny autoantigén u pacientov so vzplanutím choroby boli w20 bunky v milióne buniek, čo predstavuje frekvenciu 0,002 percenta; teda detekcia autoantigén-špecifického CD4plusT bunky s použitím štandardnej, nemanipulovanej cytometrie je takmer nemožné. Bacher a kol. zavedené predbežné obohatenie CD4plusT bunky, ktoré reagujú na konkrétne antigény pred získaním pomocou inej cytometrie, známej ako metóda ARTE. Prijatie tohto prístupu na detekciu CD4 špecifického pre jadrový antigénplusT buniek, sme boli schopní potvrdiť naše zistenia a preukázať expanziu CD4 reaktívneho na jadrový antigénplusT bunky sú aktívnesystémovýlupuserythematosus. Pozoruhodné je, že frekvencia T buniek reaktívnych s transtyretínom a C. Albicans bola indiferentná medzi zdravými kontrolami a pacientmi ssystémovýlupuserythematosuss rôznou aktivitou ochorenia. Preto pozorované rozšírenieautoreaktívnyT bunkypravdepodobne nie je výsledkom všeobecnej neaktívnej hyperreaktivitysystémovýlupuserythematosusale o expanziu antigén-špecifických T buniek.
Thesystémový lupus erythematosusinfikujeobličky, takže cistanche sa používa na ochranuobličky.
Predchádzajúce správy už preukázali existenciuautoreaktívnyT bunkyvsystémovýlupuserythematosusprimárne pomocou proliferácie, produkcie cytokínov alebo upregulácie aktivačných markerov, aj keď bez toho, aby bolo možné kvantifikovať jasnú populáciu týchto buniek. Najlepší dôkaz o frekvencii T buniek špecifických pre jadrový antigén existuje pre reaktivitu proti malému ribonukleoproteínu U1, ktorý je charakteristickým autoantigénovým cieľom pri zmiešanom ochorení spojivového tkaniva a nachádza sa len u časti pacientov ssystémovýlupuserythematosus. U1 malý jadrový ribonukleoproteín – reaktívny CD4plusT bunky boli stanovené s použitím limitného riedenia a enzýmovej imunospotovej analýzy (ELISPOT) a bolo hlásené, že sa vyskytujú s frekvenciou (40 až 250) 106 T buniek a (20 až 60) 106 PBMC, v tomto poradí, čo je podobné magnitúda ako frekvencia autoreaktívnych buniek v našej štúdii. V našej práci sme skúmali reaktivitu voči niekoľkým charakteristikámsystémovýlupuserythematosus- asociované jadrové antigény. Je zaujímavé, že hoci všetci pacienti s aktívnou LN vykazovali zvýšené frekvencie CD4 reaktívneho na anti-jadrový antigénplusT bunky, pacienti sa líšili vo svojom cieľovom portfóliu a reaktivita bola zameraná proti širšej skupine antigénov v porovnaní s pacientmi s neaktívnymsystémovýlupuserythematosus. Biologický význam tohto nie je v súčasnosti známy. Rôzne CD4plusReaktivity T buniek sa môžu spájať s určitými klinickými prejavmi rôznych reaktivít, ktoré môžu byť pre patogenézu ochorenia nadbytočné.
Podobne ako pri iných autoimunitných ochoreniach sa nám podarilo preukázať aj existenciu autoreaktívneho CD4plusT bunky u zdravých jedincov, aj keď s oveľa nižšími frekvenciami v porovnaní s pacientmi s aktívnym systémovým lupus erythematosus. Tieto bunky boli nedetegovateľné porovnaním počtu aktivovaných buniek so stimuláciou antigénom alebo bez nej, dokonca aj s takými vysoko citlivými technikami, ako sú knižnice T-buniek alebo metódy ARTE. Jednobunkovým klonovaním sme však dokázali preukázať, že signál „pozadia“ skutočne obsahoval autoantigén-špecifický CD4plusT bunky. Ktoré konkrétne udalosti vedú k prelomeniu tolerancie a zvyšovaniu frekvencieautoreaktívnyT bunkyzostáva špekulatívny; naše údaje však ukazujú, že expanzia autoreaktívnych klonov hrá úlohu v patogenéze systémového lupus erythematosus.
Cirkulujúci jadrový antigén-reaktívny CD4plusT bunky produkovali hlavne IFN-g a v menšom rozsahu IL-17 a IL-10. Tento cytokínový profil spolu so slabou/žiadnou koreláciou s produkciou autoprotilátok naznačuje, že úloha CD4 reaktívneho na jadrový antigénplusT bunky nemusia byť výhradným poskytovateľom pomoci pre B bunky. Ukázalo sa, že IFN-g je nevyhnutný v patogenéze LN. Ukázalo sa, že Th1 bunky sa rekrutujú doinfikovaný obličkytkanivo vsystémový lupuserythematosus, čo robí T bunky reaktívne s jadrovým antigénom hlavnými kandidátmi na napadnutieobličky, kde by sa stretli so svojim všadeprítomným príbuzným autoantigénom. Už skôr bolo opísané, že močové T bunky odrážajú aktivitu ochorenia a odzrkadľujú fenotyp intrarenálnych buniek v LN20,33; teda sme použili močové T bunky ako proxy preobličkyT bunky. Močové T bunky odhalili obmedzenú variabilitu TCR, čo je v súlade s pozorovaniami vobličkybiopsie, čo naznačuje obohatenie určitých klonov T-buniek vinfikovanýobličkytkaniva. Medzi močovými T bunkami sme dokázali detegovať T bunky reaktívne na jadrový antigén a ich frekvencia bola v porovnaní s cirkulačnými T bunkami obohatená. V dôsledku toho sa zdá pravdepodobné, že bunky reaktívne s jadrovým antigénom sa priamo podieľajú na šírení lokálneho poškodenia orgánov.
V súhrne tu demonštrujeme, že jadrový antigén-reaktívny CD4plusT bunky sú expandované neaktívnesystémovýlupuserythematosus; fenotypovo sú to hlavne Th1 T bunky produkujúce IFN-g a napádajúinfikovanýcieľové orgány, ako naprobličky.
Cistanche sa môže vyhnúť infekciiobličkykvôlisystémovýlupuserythematosus.
METÓDY
Podrobné metódy sú uvedené v doplnkovom materiáli.
Subjekty a vzorky krvi a moču
Vzorky krvi boli odobraté od 17 zdravých jedincov, 12 pacientov s neaktívnou činnosťousystémovýlupus erythematosus(systémovýlupuserythematosusskóre DAI<10), and="" 20="" patients="" with="" active="">systémovýlupuserythematosus(systémovýlupuserythematosusDAI score >10). Okrem toho boli získané vzorky moču od 12 pacientov s aktívnymsystémovýlupuserythematosusa LN. Všetky subjekty dali svoj informovaný súhlas na základe etického súhlasu získaného inštitucionálnou revíznou radou a etickými orgánmi Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA 1/342/12, EA 1/098/07 a EA 1/036/16 ). PBMC a močové bunky boli pripravené s použitím gradientu hustoty FicollHypaque.
Protilátky a sledovať cytometriu
V závislosti od experimentov sa na bunkách stimulovaných antigénom zafarbilo niekoľko povrchových molekúl v rôznych kombináciách nasledujúcich monoklonálnych protilátok: anti-CD3, -CD4, -CD8, -CD14, -CD20, -CD69 a -CD154; na rozlíšenie živých a mŕtvych buniek súprava LIVE/DEAD Aqua (Life Technologies Ltd.,Paisystémovýlupuserythematosus, Spojené kráľovstvo).
Na zafarbenie intracelulárneho bunkového kompartmentu boli bunky fixované 2 percentami (objem/objem) paraformaldehydom počas 15 minút pri teplote miestnosti a permeabilizované BD FACS permeabilizačným roztokom 2 (BD Biosciences, San Jose, CA); nasledujúce antigény boli zafarbené intracelulárne pomocou štandardného protokolu: CD154, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10 a IL-17.
Vzorky sa získali na BD FACSCanto II a BD LSRFortessa (BD Biosciences) podľa cytometrov v zariadení prietokovej cytometrie Core Facility Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin pomocou softvéru BD FACSDiva (BD Biosciences). Údaje prietokovej cytometrie sa analyzovali pomocou softvéru FlowJo (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA).
Príprava antigénu a antigénového poolu
Na stimuláciu CD4 sme použili nasledujúce antigényplusT bunky v teste knižnice T buniek: {{0}},5 mg/ml ľudského rekombinantného proteínu SNRPD1 (SmD1) (Biorbyt Ltd., Cambridge, Spojené kráľovstvo), 50 ng/ml ľudského SNRP70 (RNP70) rekombinantného proteínu (Abcam Plc., Cambridge, UK), 0,5 mg/ml prirodzeného ľudského histónového proteínu (Abcam Plc.), 0,5 mg/ml ľudského SS -A/Ro rekombinantný proteín (láskavo poskytnutý Euroimmun AG, Lübeck, Nemecko), 0,5 mg/ml ľudského SS-B/La rekombinantného proteínu (láskavo poskytnutý Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Nemecko), 1 mg/ml SEB (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemecko), 1 mg/ml PepTivator Candida albicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Nemecko) a 0,5 mg/ml ľudského transtyretínového rekombinantného proteínu (ATGen, Seongnam, Južná Kórea ).
Knižnice periférnych a močových T-buniek Protokol na generovanie amplifikovaných periférnych a urinárnych knižníc T-buniek bol prijatý a upravený, ako už bolo opísané.14 Stručne, 200,000 periférne CD4plusT buniek alebo 500 až 2000 CD4 v močiplusT bunky boli izolované s použitím anti-humánneho CD4plusMicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) podľa pokynov výrobcu. Čistota CD4plusFrakcia T-buniek bola rutinne kontrolovaná pomocou následnej cytometrie na základe CD3plusCD4plus expression, where the purity always reached >99 percent a 70 percent až 75 percent pre vzorky periférnej krvi a moču. Súbežne s tým boli bunky prezentujúce antigén pripravené zozbieraním buniek CD3 z PBMC po vyčerpaní pomocou anti-humánnych CD3 MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) a konzervované zmrazením. Po 1 až 2 týždňoch kultivácie sa frakcie amplifikovaného CD4plusT bunky boli rozdelené do 96-jamkových doštičiek v závislosti od počtu antigénov, ktoré sa mali analyzovať. Pred stimuláciou antigénmi sa bunky nechali odpočívať aspoň 4 dni. V deň stimulácie boli bunky prezentujúce antigén rozmrazené a distribuované do kultúry T-buniek v pomere aspoň 1 bunka prezentujúca antigén ku 100 CD4plusT bunky. CD4plusDo experimentov boli vždy zahrnuté knižnice T-buniek pre negatívnu kontrolu (nestimulované bunky) a pozitívnu kontrolu (bunky stimulované SEB). CD4plus T bunky boli stimulované antigénom počas 4 dní a proliferácia bola stanovená použitím štandardného [3H]-tymidínového protokolu.
Amplifikované T-bunkové blasty reagovali odlišne na antigény prejavujúce sa vysoko heterogénnou scintiláciou CPM; preto bola potrebná normalizácia prahu proliferácie stanoveného ako z skóre špecifického pre darcu. Z skóre sa vypočítalo ako 5 rozdielov 75. a 25. percentilu nad strednou hodnotou CPM nestimulovaných mikrokultúr. Bunky v mikrokultúrach stimulovaných SEB slúžili ako pozitívna kontrola. Za zmienku stoja mikrokultúry s indexom stimulácie SEB<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="">plusT bunky sa vypočítali pomocou počtu negatívnych mikrokultúr podľa Poissonovej distribúcie a vyjadrili sa na 1 milión buniek, ako bolo opísané vyššie. Použitie Poissonovej distribúcie je založené na pravdepodobnosti, že aspoň 1CD4plusT bunka je prítomná v jedinej mikrokultúre T-bunkových knižníc, keď bol rádioaktívny signál detegovaný po antigén-špecifickej stimulácii.
Periférne a močové metódy ARTE sme postupovali podľa protokolu, ktorý používa súpravu CD154 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec GmbH). V stručnosti, bunky sa stimulovali 7 hodín antigénmi a potom sa označili anti-humánnymi CD154-biotínovými protilátkami a anti-biotínovými mikroguličkami podľa pokynov výrobcu. Označené bunky sa naniesli na kalibrované MS kolóny (Miltenyi Biotec GmbH), aby sa obohatili bunky exprimujúce CD154-. Označenie buniek karboxyfluoresceín diacetátom N-sukcinimidylesterom (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) sa uskutočnilo podľa štandardného protokolu.
Cistanche sa zlepšujeobličkyfunkcie.
Generovanie jednobunkových klonov
Jednobunkové klony boli vytvorené z antigén-reaktívnych buniek, ktoré boli obohatené expresiou CD154 podľa protokolu ARTE. CD154-bunky exprimujúce CD sa prefiltrovali pomocou 30-mm prípravného filtra (Miltenyi Biotec GmbH) a resuspendovali v 1 ml 20-percentného (obj./obj.) studeného fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku, 0,5 % hovädzieho sérového albumínu a 2 mM kyseliny etyléndiamíntetraoctovej. Bunky boli jednotlivé bunky triedené na CD154plusCD69plusfenotypu a jednotlivé triedené bunky sa kultivovali v jednotlivých jamkách 96-jamkových doštičiek v prítomnosti výživných buniek. Bunkové kultúry sa udržiavali 3 až 4 dni, kým nebolo viditeľných niekoľko klonov. Jeden deň pred restimuláciou boli bunky prezentujúce antigén rozmrazené a distribuované do kultúry T-buniek v pomere
aspoň 1 bunka prezentujúca antigén na 100 CD4plusT bunky. Bunky boli stimulované 1 mg/ml antigénu a nestimulované klony slúžili ako negatívna kontrola.
Analýza repertoáru TCR novej generácie na základe sekvenovania
Genómová DNA bola izolovaná z periférneho CD4plusT bunky a močové bunky pomocou súpravy AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen, Venlo, Holandsko). Rekombinovaný lokus TCR-b sa amplifikoval podľa protokolu, ako je opísané vyššie. Čítania boli spracované pomocou IMSEQ a rovnaké klonotypy boli zoskupené a ďalej analyzované.
Štatistiky
Štatistické testy sa uskutočnili pomocou softvéru GraphPad Prism (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Použila sa Bonferroniho úprava pre viacnásobné porovnania. V experimentoch s nezávislým a závislým súborom údajov sa použili Mann-Whitney U test a Wilcoxonov test so znamienkom. Po Bonferroniho úprave pre viacnásobné porovnania bol výpočet kritických hodnôt P opravený, pretože je založený na počte plánovaných porovnaní. P hodnoty<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.01,="" **p="" <="" 0.005,="" and="" ***p="" <="" 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="">systémovýlupuserythematosusHodnoty DAI namiesto zoradených hodnôt, aby sa lepšie porozumelo korelácii medzi počtom buniek a aktivitou ochorenia. Pre korelačnú analýzu, P hodnoty<0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.05,="" **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="">plusT bunky, frekvencie bez pozadia boli definované ako nulové. Log(x þ 1) transformácia sa použila na súbor údajov, keď obsahoval nulové hodnoty. Doplnkové údaje o pacientoch a štatistické údaje sú dostupné v doplnkových tabuľkách S1 a S2.
CD4 reaktívny na jadrový antigénplusbunky expandujú v aktívnom stavesystémovýlupuserythematosus, produkujú efektorové cytokíny a infikujúobličky,cistanche môže chrániťobličky.
DISCLOSURE
Všetci autori nedeklarovali žiadne konkurenčné záujmy.
POĎAKOVANIE
Ďakujeme Toralfovi Kaiserovi a Jenny Kirsch (Flow Cytometry and Cell Sorting Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) za pomoc s prietokovou cytometriou a triedením buniek. Podporu pre tieto štúdie poskytli granty od Deutsche Forschungsgemeinschaft v rámci Sonderforschungsbereich 650 do GR a granty od Deutsche Gesellschaft für Nephrologie a Clinical Scientist Program Charité–Universitätsmedizin Berlin a Berlin Institute of Health na PE.
DOPLŇUJÚCI MATERIÁL Doplnkový súbor (PDF)
Obrázok S1. Autoreaktívny jadrový antigén špecifický CD4plusT bunky boli detegované metódou T bunkovej knižnice. Obrázok S2. CD154plusCD69plusCD4plusT bunky izolované po stimulácii jadrovými antigénmi od zdravých jedincov sú bona-fife antigén-špecifické CD4plusT bunky.
Obrázok S3. Frekvencie autoreaktívneho CD4 produkujúceho cytokínyplusT bunky sa porovnávali s titrom antinukleárnych protilátok (anti-ANA) (A) a s koncentráciou protilátok proti dvojvláknovej DNA (anti-dsDNA) (B).
Obrázok S4. CD4 reaktívny na jadrový antigénplusT bunky boli detegované v moči aktívnychsystémovýlupuserythematosuspacientov s LN.
Tabuľka S1. Klinické údaje.
Tabuľka S2. Súhrn hodnôt mediánu.
Doplnkové metódy.
Razobličkyje infikovaný v dôsledku jadrového antigén-reaktívneho CD4plusbunky expandujúce v aktívnychsystémovýlupuserythematosus,obličkyfunkcia je zničená, cistanche sa používa na zlepšenieobličkyfunkciu.
LITERATÚRA
1. Casciola-Rosen LA, Anhalt G, Rosen A. Autoantigény cielené v r.systémový lupuserythematosussú zoskupené v dvoch populáciách povrchových štruktúr na apoptotických keratinocytoch. J Exp Med. 1994;179: 1317–1330.
2. Arbuckle MR, McClain MT, Rubertone MV, a kol. Vývoj autoprotilátok pred klinickým nástupomsystémovýlupuserythematosus. N Engl J Med. 2003;349:1526–1533.
3. Suarez-Fueyo A, Bradley SJ, Tsokos GC. T bunky vsystémovýlupuserythematosus. Curr Opin Immunol. 2016;43:32–38.
4. Crow MK, DelGiudice-Asch G, Zehetbauer JB, et al. Autoantigén-špecifická proliferácia T buniek indukovaná ribozomálnym proteínom P2 u pacientov ssystémovýlupuserythematosus. J Clin Invest. 1994;94:345–352.
5. Engler JB, Undeutsch R, Kloke L a kol. Odmaskovanie autoreaktívneho CD4plusT bunky depléciou CD25 regulačných T buniek vsystémovýlupuserythematosus. Ann Rheum Dis. 2011;70:2176–2183.
atď.
