Krüppelovým faktorom 6 – sprostredkovaná strata katabolizmu BCAA prispieva k poraneniu obličiek u myší a ľudí
Feb 25, 2022
Zmenený bunkový metabolizmus vobličkyBunky proximálneho tubulu (PT) hrajú rozhodujúcu úlohu pri akútpoškodenie obličiek (AKI). Transkripčný faktor Krüppel-like faktor 6 (KLF6) je rýchlo a silne indukovaný skoro v PT po AKI. Zistili sme, že knockdown Klf6 špecifický pre PT (Klf6PTKD) chráni pred AKI aobličkyfibróza u myší. Kombinovaná sekvenčná analýza imunoprecipitácie RNA a chromatínu ukázala, že expresia génov kódujúcich katabolické enzýmy rozvetvených aminokyselín (BCAA) bola zachovaná u myší Klf6PTKD, pričom KLF6 zaberá promótorovú oblasť týchto génov. Naopak, indukovateľná nadmerná expresia KLF6 potlačila expresiu génov BCAA a zhoršila sapoškodenie obličieka fibróza u myší. In vitro mali poškodené bunky nadmerne exprimujúce KLF6 podobné zníženie expresie katabolického génu BCAA a boli menej schopné využívať BCAA. Okrem toho knockdown BCKDHB, ktorý kóduje jednu podjednotku enzýmu obmedzujúceho rýchlosť v katabolizme BCAA, viedol k zníženej produkcii ATP, zatiaľ čo liečba zosilňovačom katabolizmu BCAA BT2 zvýšila metabolizmus. Analýzafunkcie obličiekexpresia génov KLF6 a BCAA u ľudí chronickýchochorenie obličiekpacienti vykazovali významné inverzné korelácie medzi KLF6 a obomafunkcie obličiek a expresiou BCAA. Zacielenie na KLF6-sprostredkovanú supresiu katabolizmu BCAA teda môže slúžiť ako kľúčový terapeutický cieľ pri AKI aobličkyfibróza.
CISTANCHE ZLEPŠÍ ZLYHAVOVANIE OBLIČIEK/RENÁL
Chronickýochorenie obličiek(CKD) spôsobuje významnú morbiditu a mortalitu a má prevalenciu v dospelej populácii USA ~ 15 percent. CKD môže byť výsledkom opakovaných záchvatov akútpoškodenie obličiek(AKI) možno pripísať environmentálnym alebo toxickým urážkam alebo byť sekundárny k iným chorobám alebo ich liečbe. Vo väčšine prípadov je proximálny tubulus (PT) primárnym miestom poškodenia v AKI, pretože vysoká metabolická aktivita PT buniek ich robí náchylnými na ischemické poškodenie a ich úloha pri vylučovaní liekov a toxínov vyžaduje tok potenciálne škodlivých látok. prostredníctvom PT buniek (1). Jednou takouto triedou činidiel sú chemoterapeutiká poškodzujúce DNA, ktoré sa akumulujú v PT bunkách a spôsobujú stratu AKI a nefrónov. Po poranení sa PT bunky de-diferencujú a vylučujú rozpustné faktory, ako sú členovia rodiny Wnt a Hedgehog a cytokíny (1–4). Prežívajúce dediferencované PT bunky môžu znovu vstúpiť do bunkového cyklu a proliferovať, aby opravili poškodené PT, po čom nasleduje rediferenciácia na plne funkčné PT bunky (2). Avšak bunky, ktoré namiesto toho podliehajú zastaveniu bunkového cyklu v kontrolnom bode G2/M, sa nemusia zotaviť, čo vedie k atrofii a up-regulácii profibrotickej signalizácie (5), čo spúšťa fibrózu stimuláciou diferenciácie rezidentných fibroblastov na myofibroblasty, ktoré vylučujú proteíny extracelulárnej matrice, a nábor imunitných buniek, ako sú makrofágy a T bunky (1).
Kľúčové slová:obličky; akútne poškodenie obličiek; proximálny tubul; transkripčný faktor; aminokyseliny s rozvetveným reťazcom
Okrem indukcie patogénnych signálnych dráh vykazujú poškodené PT bunky aj drasticky zmenený bunkový metabolizmus. Nezranené PT bunky sa pri produkcii ATP do veľkej miery spoliehajú na mitochondriálnu oxidáciu mastných kyselín, cyklus trikarboxylových kyselín (TCA) a oxidačnú fosforyláciu. Avšak pri poranení je potlačená oxidácia mastných kyselín, len s miernou kompenzačnou up-reguláciou glykolýzy, takže celkové hladiny ATP sú znížené v poranenom PT (6). Okrem toho inhibícia oxidácie mastných kyselín in vitro spôsobila dediferenciáciu a apoptózu tubulárnych epitelových buniek a in vivo zhoršilapoškodenie obličiekpo liečbe kyselinou listovou (6). Je zaujímavé, že zvýšená regulácia buď mitochondriálnej oxidácie mastných kyselín alebo peroxizomálnej oxidácie mastných kyselín (FAO) môže chrániť predpoškodenie obličiek(6, 7), čo naznačuje, že zachovanie bunkového metabolizmu môže byť terapeutickým cieľom v AKI. Transkriptomické štúdie v biopsiách obličiek s ľudským CKD, ako aj po ischemickom reperfúznom poškodení (IRI) u myší demonštrujú dysregulovaný metabolizmus mastných kyselín, ako aj metabolizmus aminokyselín (6, 8). Hoci úloha oxidácie PT mastných kyselín bola už skôr opísaná v AKI, úlohu metabolizmu PT aminokyselín v AKI je potrebné preskúmať. Okrem toho sa doteraz opísané mechanizmy poškodenia PT do značnej miery skúmali pomocou myších modelov s knock-outom a nadmernou expresiou jednotlivých signálnych molekúl, ale mechanizmami, ktorými sa globálne dráhy, fibrotické/zápalové a metabolické, a prepínanie medzi normálnym zotavením a atrofiou sú regulované v AKI nie sú dobre charakterizované.
Transkripčné faktory pôsobia ako hlavné regulátory základných biologických procesov vďaka svojej schopnosti regulovať expresiu viacerých downstream cieľov a vytvárať slučky spätnej väzby. V AKI sú dobre preštudované transkripčné faktory, ako sú členovia rodiny FOS a JUN, vysoko regulované. Nedávne štúdie molekulárnych reakcií na IRI v ľudských vzorkách a PT translačné profilovanie po unilaterálnej ureterickej obštrukcii (UUO) u myší tiež identifikovali transkripčný faktor zinkového prsta Krüppel-like faktor 6 (KLF6) ako podobný gén včasnej reakcie na poranenie (9, 10 ). KLF zahŕňajú rodinu transkripčných faktorov so zinkovým prstom s vysoko konzervovanými C-terminálnymi doménami viažucimi DNA a variabilnými N koncami, ktoré sú široko exprimované, vrátaneobličky(11). KLF6 má úlohy vo viacerých procesoch, ako je bunková proliferácia a diferenciácia, apoptóza, reakcie na poškodenie DNA a mitochondriálna funkcia (12) a zistilo sa, že hrá úlohu v pečeni, srdcovom aobličkyfibróza, s kontextovo závislými účinkami (13, 14). V rámciobličkyKLF6 je exprimovaný v glomerulárnych podocytoch a je základným regulátorom mitochondriálnej funkcie v podmienkach fokálnej segmentálnej glomerulosklerózy (FSGS) (15). Okrem svojej expresie v glomerulárnych podocytoch je KLF6 tiež variabilne exprimovaný v PT, ale jeho úloha v PT bunkách, či už pri normálnej funkcii alebo po poranení, nie je známa. Nadmerná expresia KLF6 v HK-2 bunkách viedla k dediferencovanému fenotypu so zníženým E-kadherínom a zvýšenou expresiou vimentínu a tiež viedla k zvýšenej expresii makrofágového zápalového proteínu-3 (16). Okrem toho sa expresia KLF6 zvýšila v reakcii na vysokú hladinu glukózy a tento účinok bol blokovaný knockdownom TGFB1 alebo pôsobením neutralizačnej protilátky TGF- 1. Priama liečba TGF- 1 tiež vyvolala expresiu KLF6, čo naznačuje možnú pozitívnu spätnú väzbu v HK-2 bunkách (16). Ukázalo sa tiež, že KLF6 je indukovaný v rakovinových bunkách in vitro subapoptickými dávkami chemoterapeutického liečiva cisplatiny poškodzujúceho DNA (17). Aby sme určili úlohu PT KLF6 v reakcii na poškodenie DNA, použili sme prirodzene sa vyskytujúci toxín aristolochovú kyselinu I (AAI). Nefropatia spojená s AAI je klinicky relevantná (18) a toxicita AAI je vysoko špecifická pre PT, čo umožňuje študovať úlohu PT KLF6 špecificky v reakcii na poškodenie PT. Okrem toho AAI spoľahlivo spôsobuje AKI aj prechod do fibrózy u myší, na rozdiel od väčšiny režimov s cisplatinou (19). AAI vstupuje do PT buniek cez bazolaterálne transportéry organických aniónov (OAT) 1 až 3 a má genotoxické účinky prostredníctvom tvorby aristolaktámových (AL)-DNA aduktov a cytotoxické účinky, ktoré spôsobujú mitochondriálne poškodenie, ktoré vytvára reaktívne formy kyslíka a špecificky inhibuje normálne Funkcie PT, ako je receptorom sprostredkovaná endocytóza (18–20). Tu demonštrujeme prostredníctvom modulácie expresie KLF6 špecificky v PT prostredníctvom štúdií zisku funkcie a straty funkcie u myší, že KLF6-sprostredkované potlačenie katabolizmu aminokyselín s rozvetveným reťazcom (BCAA) prispieva k AKI a následnéobličkyfibróza.
Výsledky
Liečba AAI zvyšuje expresiu renálneho PT Klf6. Pretože niekoľko členov rodiny KLF je exprimovaných v epitelových bunkách vobličky(21), pôvodne sme vykonali qRT-PCR pre tieto epitelové Klfs vobličkykôra zozbieraná 24 hodín po jednej dávke PT-špecifického toxínu, AAI, oproti vehikulu (dimetylsulfoxid [DMSO]) u myší C57BL/6. Klf4, Klf5 a Klf6 boli signifikantne up-regulované, zatiaľ čo Klf15 boli signifikantne down-regulované (obr. 1A), a tieto zmeny v génovej expresii nastali pred významným zvýšením sérového kreatinínu (obr. 1B). Aby sme určili, či je up-regulácia Klf6 prechodná alebo predĺžená, podávali sme AAI vo viacerých injekciách 3 po sebe buď dve injekcie alebo 3 týždne (aktívna fáza) alebo 3 týždne, po ktorých nasledovali 3 týždne bez AAI (fáza remodelácie) (obr. 1C) . PT zostal neporušený 24 hodín po jednej injekcii, ale po dvoch injekciách PT bunky podstúpili bunkovú smrť a myši liečené viacerými dávkami AAI preukázali stratu PT, zápalové infiltráty, proteín
sadry a fibróza na konci fázy remodelácie (obr. 1D). Expresia Klf6 zostala významne zvýšená v aktívnych a remodelačných fázach poranenia (obr. 1E), čo naznačuje úlohu KLF6 počas akútnej a fibrotickej fázy poranenia. KLF6 je exprimovaný v glomerulárnych, tubulárnych a zápalových bunkách a na určenie príspevku PT-špecifickej expresie Klf6 k pozorovanému zvýšeniu renálnej kortikálnej expresie Klf6 sme vykonali sekvenovanie RNA (RNA-seq) v mikrodisekovaných segmentoch S2/S3 PT 24 h po jednej injekcii AAI, pred stratou PT buniek. Klf6 bol vysoko regulovaný na úrovni porovnateľnej s dobre známymi transkripčnými faktormi včasnej odozvy Fos a Jun, čo naznačuje, že skorá indukcia expresie Klf6 messenger RNA (mRNA) vobličkyje riadená jeho expresiou v PT bunkách (obr. 1F). Tieto zistenia sú v súlade s nedávno publikovanými údajmi jednobunkovej / jadrovej RNA-seq, ktoré ukazujú upreguláciu Klf6 v PT bunkách u zranených myší a ľudíobličky(22, 23). Nakoniec, dolovanie údajov z expresných polí z predtým uvádzaných štúdií časového priebehu IRI (8) potvrdilo skorú indukciu expresie KLF6 do 2 hodín od AKI, podobne ako u Fos a Jun (obr. 1G). Tieto údaje naznačujú, že Klf6 je skorý indukovateľný gén odozvy na poranenie po liečbe PT-špecifickým toxínom AAI a po IRI a zostáva zvýšený napriek zastaveniu AAI.
PT-špecifická strata KLF6 zmierňuje poškodenie obličiek v aktívnej a remodelačnej fáze po liečbe AAI.Aby sme určili príspevok PT-špecifického KLF6 k AAI-indukovanému poškodeniu, vytvorili sme myši s PT-špecifickým knockdownom Klf6 (Klf6PTKD) krížením Klf6fl/fl myší (24) s Pepck-Cre myšami (25). Klf6PTKD myši boli životaschopné a plodné, s významným znížením PT-špecifickej expresie proteínu KLF6, ale bez zmeny v expresii Klf6 mRNA v pečeni v porovnaní s myšami Klf6fl/fl (príloha SI, obr. S1 A–C). Neboli v tom žiadne zjavné rozdielyobličkyhistológia alebo funkcia medzi myšami Klf6fl/fl a Klf6PTKD vo veku 24 týždňov (príloha SI, obr. S1 D a E) a hladiny expresie OAT 1 až 3 (Slc22a6, Slc22a7 a Slc22a8), cesta vstupu AAI PT, sa významne nelíšili (príloha SI, obr. S1F).
Kontrolné myši (Klf6fl/fl) a Klf6PTKD boli liečené vehikulom (DMSO) alebo 3 mg/kg AAI intraperitoneálne každé 3 dni počas 3 týždňov a usmrtené 3 dni po poslednej injekcii AAI, aby sa vyhodnotila aktívna fáza poranenia alebo 3 týždne po posledná injekcia AAI na posúdenie fázy remodelácie poranenia (obr. 1C). Myši Klf6fl/fl a Klf6PTKD mali podobné množstvá aduktov AL-DNA po jednej injekcii aj na konci aktívnej a remodelačnej fázy (príloha SI, obr. S1 G a H), čo naznačuje podobné vychytávanie AAI PT a opravu AL -DNA adukty u myší Klf6fl/fl a Klf6PTKD. Počas podávania injekcií myši, ktoré dostávali AAI, schudli v porovnaní s tými, ktoré dostávali DMSO, s podobným znížením o ~ 18 percent oproti východiskovej hodnote u myší Klf6fl/fl a Klf6PTKD pri poslednej injekcii AAI, po čom nasledovalo opätovné získanie podobného množstva telesnej hmotnosti ( Príloha SI, obr. S2A).Obličkyhmotnosti relatívne k počiatočnej (deň {0}}) telesnej hmotnosti boli podobné medzi myšami Klf6fl/fl a Klf6PTKD liečenými DMSO a AAI na konci aktívnej fázy (príloha SI, obr. S2B). Vo fáze prestavby,obličkyz myší Klf6fl/fl liečených AAI vážili výrazne menej ako z myší liečených DMSO, ale u myší Klf6PTKD liečených AAIobličkyhmotnosti boli zachované (príloha SI, obr. S2B).Funkcia obličiekbola hodnotená meraním koncentrácií sérového kreatinínu (obr. 2A) a močovinového dusíka (obr. 2B). Koncentrácie sérového kreatinínu a močovinového dusíka boli významne zvýšené u myší dostávajúcich AAI oproti DMSO; avšak zvýšenia boli významne menšie u myší Klf6PTKD v porovnaní s myšami Klf6fl/fl (obr. 2 A a B). Histologická analýza s použitím hematoxylínu a eozínu a farbenia kyselinou jodistou podľa Schiffa ukázala, že myši Klf6fl/fl aj Klf6PTKD liečené AAI vylučovali tubuly so zvyškami bazálnych membrán, zápalové infiltráty, ktoré boli prevažne lokalizované v
vonkajšia kôra a viaceré proteínové odliatky v kôre aj dreni (obr. 2 C a D). Tieto znaky však boli menej závažné u myší Klf6PTKD v porovnaní s myšami Klf6fl / fl, so zachovaním tubulov a menších zápalových infiltrátov. Analýza oblasti PT bola vykonaná pomocou fluorescenčného farbenia lektínom Lotus na identifikáciu neporušených PT kefových lemov v plne diferencovaných PT bunkách a imunofluorescencie pre cytokeratín-20 (KRT-20) na identifikáciu poranených PT (8). V porovnaní s myšami liečenými DMSO mali myši Klf6fl/fl aj Klf6PTKD liečené AAI významnú stratu zrelého PT, čo dokazuje strata farbenia lektínom Lotus a indukcia expresie KRT-20, čo naznačuje poškodenie PT v oboch aktívnej a remodelačnej fázy (obr. 2E a príloha SI, obr. S2C). Myši Klf6PTKD liečené AAI mali významné zachovanie zrelého PT v porovnaní s myšami Klf6fl/fl, sprevádzané podobnými hladinami indukcie KRT- 20 v aktívnej aj remodelačnej fáze. Trichrómové farbenie fázy remodelácieobličkyvykazovali rozsiahle ukladanie fibrotického materiálu u myší Klf6fl/fl, s výrazne menšou fibrózou u myší Klf6PTKD (obr. 2F, modré farbenie; príloha SI, tabuľka S1). Depozícia kolagénu I, komponentu fibrotickej matrice, detegovaná pomocou imunofluorescencie (obr. 2G a SI príloha, obr. S2D), ukázala, že kolagén I bol významne zvýšený u myší Klf6fl/fl s AAI, ale nie u myší Klf6PTKD s AAI v porovnaní s DMSO v r. aktívna fáza. Vo fáze remodelácie bol kolagén I významne zvýšený u myší Klf6fl/fl a Klf6PTKD s AAI, s výrazne nižšou percentuálnou plochou u myší Klf6PTKD s AAI v porovnaní s myšami Klf6fl/fl s AAI. Intersticiálne zápalové bunky pozostávajúce z CD68 plus makrofágov a GR-1 plus myeloidných monocytov boli prítomné v Klf6fl/fl
a Klf6PTKD myši liečené AAI, ale boli významne menej hojné u Klf6PTKD myší v aktívnej aj remodelačnej fáze (obr. 2H). Strata KLF6 špecifického pre PT teda chráni pred poranením PT, fibrózou a zápalom vyvolaným AAI, napriek prítomnosti podobných množstiev aduktov AL-DNA v porovnaní s kontrolnými myšami liečenými AAI. PT-špecifická strata KLF6 znižuje zápalovú signalizáciu a zachováva bunkový metabolizmus po liečbe AAI. Snažili sme sa pochopiť mechanizmy, ktorými strata PT KLF6 chráni pred zranením, a preto sme prijali RNA-seq.obličkycortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.{1} alebo<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">
Aby sme určili dráhy potenciálne priamo a nepriamo regulované pomocou KLF6, ďalej sme analyzovali diferencovane exprimované gény ich klasifikáciou na základe prítomnosti a umiestnenia väzbových miest KLF6 pomocou údajov KLF6 chromatínového imunoprecipitačného sekvenovania (ChIP-Seq) z projektu Encyclopedia of DNA Elements. . Gény triedy 2 boli definované tak, že majú aspoň 1 väzbové miesto KLF6 v rozmedzí ±1 kb od miesta začiatku transkripcie (TSS), gény triedy 1 majú aspoň 1 väzbové miesto KLF6 medzi ±1 a 10 kb od TSS a gény triedy 0 ako bez väzbového miesta KLF6 v rámci ±10 kb od TSS. Existovalo 538 génov, ktoré boli v aktívnej fáze upregulované u myší Klf6fl / fl a významne znížené u myší Klf6PTKD oproti Klf6fl / fl. Analýza obohatenia dráhy týchto 538 génov ukázala, že dráhy súvisiace s vrodenou imunitou (napr. TYROBP, fagozóm a makrofág) a bunkovou adhéziou (napr. integrín, fokálna adhézia) boli významne obohatené (obr. 3A). Klasifikácia génov podľa väzbových miest KLF6 ukázala, že väčšina DEG (428/538) nemala väzbové miesta KLF6 (trieda 0), a analýza obohatenia génov triedy 2 (72) a génov triedy 0 oddelene ukázali, že význam týchto dráh bol silne poháňaný génmi triedy 0, čo naznačuje, že nižšia expresia týchto génov u myší Klf6PTKD bola pravdepodobne nepriamym účinkom menšieho poškodenia PT v dôsledku PT špecifického knockdownu Klf6 (obr. 3A).
CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCIU OBLIČIEK/RENÁL
Existovalo 388 génov, ktoré boli down-regulované u myší Klf6fl/fl a významne zachované (up-regulované) u myší Klf6PTKD oproti myšiam Klf6fl/fl. Analýza obohatenia dráhy ukázala, že tieto gény predstavujú metabolické dráhy, pričom metabolizmus aminokyselín a metabolizmu mastných kyselín sú prominentné (obr. 3B a príloha SI, obr. S4). Analýza obohatenia génov triedy 2 (1{{1{19}}}}3) a génov triedy 0 (246) ukázala, že napriek tomu, že iba ~25 percent génov má väzbové miesta KLF6 v rozmedzí ±1 kb od TSS ( trieda 2), táto podskupina génov bola hnacím motorom pre vysoko významné hodnoty P týchto dráh. Prekvapivo, metabolické dráhy špecifických aminokyselín (Val, Leu a Ile [BCAA] a Gly, Ser a Thr) boli rovnako významné, keď sa analyzovali iba gény triedy 2, čo naznačuje potenciálnu priamu reguláciu týchto dráh pomocou KLF6 (obr. 3B). . Naopak, vysoký význam metabolických dráh mastných kyselín a signálnej dráhy PPAR bol do značnej miery riadený génmi triedy 0, čo naznačuje nepriame zachovanie týchto dráh v dôsledku PT-špecifického knockdownu Klf6. Analýza obohatenia génovej sady pre špecifické metabolické cesty Kjótskej encyklopédie génov a genómov (KEGG) (degradácia mastných kyselín, metabolizmus aminokyselín, cyklus TCA a glykolýza) s použitím všetkých rozdielne regulovaných génov potvrdila, že sú významne upregulované (zachované) v Klf6PTKD verzus Klf6fl/fl myši (obr. 3C).
Indukcia KLF6 exacerbujePoranenie obličieka potláča katabolické gény BCAA po liečbe AAI. Aby sme určili, či nadmerná expresia KLF6 bude mať opačné účinky, použili sme systém "tet-on" na vytvorenie myšacieho modelu s doxycyklínom (DOX) indukovateľnou expresiou ľudského KLF6 (hKLF6OE; dvojito transgénne CAG-rtTA, TRE-hKLF6 myši) (príloha SI, obr. S5A). Myši hKLF6OE mali silnú indukciu expresie hKLF6 po doplnení stravy s DOX počas 7 dní bez významných rozdielov v expresii myšieho Klf6 (príloha SI, obr. S5B) aobličkynepreukázalo zjavné histologické poškodenie alebo stratufunkcie obličiekpo kontinuálnej liečbe DOX počas 15 týždňov (príloha SI, obr. S5 C a D) v porovnaní s kontrolnými myšami (TRE-hKLF6 s liečbou DOX). Avšak na zistenie, či indukcia hKLF6 v PT exacerbovala AKI aobličkyfibróza, hKLF6OE a kontrolné myši boli liečené nižšou dávkou 1 mg/kg AAI alebo DMSO každé 3 dni počas 2 týždňov, po ktorých nasledovala eutanázia po ďalších 3 dňoch (aktívna fáza) alebo ďalších 2 týždňoch (fáza remodelácie) (príloha SI, obr. S6A). Kontrolné myši a myši hKLF6OE, ktoré dostávali AAI, stratili podobné množstvo telesnej hmotnosti (príloha SI, obr. S6B) aobličkyhmotnosti boli podobné medzi všetkými skupinami (príloha SI, obr. S6C). Myši hKLF6OE mali významne zvýšený sérový kreatinín a dusík močoviny v porovnaní s kontrolnými myšami po liečbe AAI v aktívnej fáze (obr. 4 A a B). Toto bolo sprevádzané stratou zrelého PT s vyšším podielom KRT-20-pozitívneho PT, ktorý bol u myší hKLF6OE exacerbovaný v oboch časových bodoch (obr. 4 C–E a dodatok SI, obr. S6D) a zvýšený fibróza v oboch fázach (obr. 4F a SI príloha, obr. S6E). qRT-PCR analýza génov kódujúcich enzýmy v metabolickej dráhe BCAA ukázala supresiu génov BCAA po liečbe AAI u kontrolných myší a myší hKLF6OE s ďalšou supresiou u myší hKLF6OE v porovnaní s kontrolnými myšami (obr. 4G). Okrem toho expresia niekoľkých génov BCAA bola tiež buď významne znížená (Hibch) alebo vykazovala trend smerom k nižšej expresii u hKLF6OE oproti kontrolným myšiam aj bez liečby AAI (liečené DMSO) (obr. 4G). Tieto údaje naznačujú, že indukcia hKLF6 u dospelých myší spôsobujeobličkynáchylnejší na AKI a prípadnú fibrózu s významnou dysreguláciou génov kódujúcich katabolizmus BCAA.
Indukcia KLF6 potláča katabolizmus BCAA, čo je dôležitý substrát pre produkciu ATP in vitro.Mitochondriálny BCAA katabolizmus môže prispieť k oxidatívnej fosforylácii produkciou acetyl-CoA a sukcinyl-CoA (príloha SI, obr. S4B). Aby sme zistili, či KLF6 reguluje BCAA a bunkový metabolizmus in vitro, najprv sme hodnotili expresiu metabolických génov BCAA v bunkách HK-2 s nadmernou expresiou KLF6 (KLF{6}}OE), s liečbou AAI alebo bez nej. Rovnako ako u myší hKLF6OE, nadmerná expresia KLF6 v samotných bunkách HK-2 viedla k trendu k supresii niekoľkých génov kódujúcich enzýmy BCAA, najmä BCKDHB. Ošetrenie kontrolných buniek KLF6-Con s 25 μM AAI počas 6 hodín významne potlačilo expresiu niekoľkých enzýmov a tieto boli ďalej potlačené v bunkách KLF6-OE ošetrených AAI (obr. 5A). Komu
Obr. 3. Strata KLF6 potláča profibrotické dráhy a zachováva metabolické dráhy po liečbe AAI. (A) Klasifikácia a analýza obohatenia dráhy génov upregulovaných u myší Klf6fl/fl po AAI, ale výrazne menej upregulovaných u myší Klf6PTKD po AAI podľa triedy väzbových miest: trieda 2 s väčším alebo rovným 1 väzbovému miestu KLF6 v rámci ±1 kb TSS; trieda 1 s väčším alebo rovným 1 väzbovému miestu KLF6 vo vzdialenosti ±1 až 10 kb od TSS; a trieda 0 bez väzbového miesta KLF6 v rozmedzí ± 10 kb od TSS. (B) Klasifikácia a analýza obohatenia dráhy génov znížených u myší Klf6fl/fl po AAI, ale výrazne menej znížených (tj zachovaných) u myší Klf6PTKD po AAI podľa triedy väzbových miest: trieda 2 s väčším alebo rovným 1 väzbové miesto KLF6 v rámci ±1 kb od TSS; trieda 1 s väčším alebo rovným 1 väzbovému miestu KLF6 vo vzdialenosti ±1 až 10 kb od TSS; a trieda 0 bez väzbového miesta KLF6 v rámci ±10 kb od TSS. (C) Grafy analýzy obohatenia génovej sady s použitím všetkých odlišne exprimovaných génov pre degradáciu KEGG mastných kyselín (FA DEGRAD), metabolizmus aminokyselín (AA METAB) a cyklus TCA (KEGG_TCA).
určiť, či toto potlačenie expresie génu BCAA v prítomnosti AAI viedlo k zmenám v katabolizme BCAA, merali sme intracelulárne koncentrácie BCAA. Po ošetrení AAI bunky KLF{0}} Con vykazovali pokles BCAA v súlade so zvýšeným katabolizmom BCAA, potenciálne ako kompenzácia straty oxidácie FA (obr. 5B). Tento účinok sa však stratil v bunkách KLF6-OE, u ktorých nedošlo k poklesu intracelulárnych BCAA po liečbe AAI, čo je v súlade so zníženou schopnosťou katabolizovať BCAA (obr. 5B), čo korelovalo so zníženou produkciou mitochondriálneho ATP v porovnaní s bunkami KLF6-Con ošetrenými AAI (obr. 5C).
Štandardné médium používané na meranie produkcie ATP obsahuje vysoké koncentrácie glukózy (10 mM glukózy, 1 mM glutamínu a 2 mM pyruvátu) a aby sme určili, či samotná nadmerná expresia KLF6 môže zmeniť použitie rôznych zdrojov energie, namiesto toho sme vykonali testy rýchlosť spotreby kyslíka (OCR) v energeticky obmedzených médiách (média bez séra s 1 mM glukózy, bez glutamínu a bez pyruvátu). Bunky KLF6-OE mali znížený mitochondriálny OCR (definovaný ako počiatočný OCR mínus nemitochondriálny OCR stanovený po podaní rotenónu/antimycínu A), ale mali podobnú kompenzáciu po blokovaní glykolýzy 2-deoxyglukózou (2-) DG) a podobné FAO (zníženie OCR po blokovaní FAO etomoxirom) (obr. 5 D a E). Keďže mitochondriálna odpoveď na stratu glykolýzy a OCR v dôsledku oxidácie FA sa v bunkách KLF6-OE nezmenili, naznačuje to, že celková funkcia mitochondrií nebola ovplyvnená, ale skôr neschopnosť použiť BCAA ako zdroj zodpovedajú za základné zníženie mitochondriálnej OCR v týchto energeticky obmedzených podmienkach. Aby sme určili, či strata katabolizmu BCAA povedie k zníženiu mitochondriálnej produkcie ATP, vytvorili sme bunky HK-2 s knockdownom BCKDHB (príloha SI, obr. S7). BCKDHA a BCKDHB kódujú dve z podjednotiek veľkého proteínového komplexu rozvetvenej ketokyselinovej dehydrogenázy (BCKDH), ktorá katalyzuje prvý ireverzibilný a rýchlosť obmedzujúci krok v katabolizme BCAA a je inhibovaná fosforyláciou BCKDH kinázou (BCKDK) (28). Na posunutie kontrolných buniek BCKDHB-SCR a knockdown buniek BCKDHB-sh smerom k mitochondriálnej produkcii ATP sa tieto predinkubovali v 2-DG, aby sa zablokovala glykolýza počas 1 hodiny pred vykonaním testu rýchlosti produkcie ATP. Knockdown BCKDHB viedol k významnému zníženiu produkcie ATP, čo ukazuje, že BCAA sa používajú na tvorbu ATP u ľudí.obličkybunky (obr. 5F). Naopak, do
Obr. 4. U myší hKLF6OE došlo k exacerbáciipoškodenie obličieks potlačením génov BCAA. (A a B) Koncentrácie sérového kreatinínu (A) a močovinového dusíka (B) u kontrolných myší a myší hKLF6OE liečených DMSO alebo AAI v aktívnej fáze. n=4 až 9 na skupinu; $P < 0.05,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.0{="" {26}}1="" oproti="" rovnakému="" genotypu="" s="" dmso;="" **p="">< 0.01="" verzus="" kontrola="" s="" aai;="" jednosmerná="" anova="" s="" korekciou="" sidak="" pre="" viacnásobné="" testovanie.="" (c="" a="" d)="" reprezentatívne="" histologické="" obrazy="" zafarbené="" pomocou="" farbenia="" hematoxylínom="" a="" eozínom="" (c)="" a="" kyselinou="" jodistou="" schiff="" (d).="" žlté="" šípky:="" vylučujúce="" tubuly;="" čierne="" šípky:="" zvyšky="" bazálnych="" membrán;="" žlté="" šípky:="" proteínové="" odliatky;="" a="" čierne="" šípky:="" zápalové="" infiltráty.="" (stupnice,="" 100="" μm.)="" (e)="" imunofluorescenčné="" farbenie="" na="" cytokeratín-20="" (krt-20)="" ako="" marker="" poranenej="" pt="" (červená)="" s="" farbením="" lektínom="" lotus="" (ll="" )="" ako="" marker="" nezraneného="" pt="" (zelený).="" (stupnice,="" 250="" μm.)="" (f)="" imunofluorescenčné="" farbenie="" pre="" -sma="" (zelená)="" s="" kofarbením="" pre="" edu="" (purpurová).="" (stupnice,="" 100="" μm.)="" (g)="" expresia="" mrna="" génov="" bcaa="" u="" kontrolných="" a="" hklf6oe="" myší="" liečených="" dmso="" alebo="" aai="" v="" aktívnej="" fáze.="" n="5" až="" 9="" na="" skupinu;="" $p="">< 0,01,="" $="" $="" p="">< 0,001="" oproti="" kontrole="" s="" dmso;="" všetky="" hklf6oe="" s="" aai="" sú="" p="">< 0,001="" oproti="" hklf6oe="" s="" dmso;="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" oproti="" kontrole="" s="" rovnakou="" liečbou;="" viacnásobné="" t="" testy="" s="" korekciou="" chybnej="" miery="" objavenia="" pomocou="" dvojstupňového="" step-up="" modelu="" benjaminiho,="" kreigera="" a="" yekutieliho.="" údaje="" sú="" priemer="" ±="" sem,="" pričom="" n="" označuje="" počet="" biologických="">
na zvýšenie katabolizmu BCAA sme bunky HK{0}} ošetrili BT2, ktorý inhibuje BCKDK, čím blokuje inhibičnú fosforyláciu BCKDH. Za podmienok s obmedzením energie liečba BT2 zvýšila OCR v bunkách ošetrených DMSO, čo bolo trvalé po inhibícii glykolýzy a nie v dôsledku zmeny FAO alebo nemitochondriálnej OCR (obr. 5 G a H). Tieto zistenia naznačujú, že KLF6-sprostredkovaná supresia katabolizmu BCAA znižuje mitochondriálnu produkciu ATP, čo by pravdepodobne zhoršilo poškodenie PT v prostredí bunkového stresu, v ktorom existujú podobne energeticky obmedzené podmienky v dôsledku narušenia FAO.
Expresia génov BCAA je u rôznych myší a ľudí zníženáPoranenia obličiek. Aby sme určili, či k strate expresie génu BCAA dochádza pred stratou PT a zvýšenými hladinami kreatinínu pri poranení vyvolanom AAI, vykonali sme qRT-PCR u myší C57BL/6 liečených jednou dávkou AAI a usmrtených po 24 hodinách. Bckdhb, Hibch a Mccc2 už boli v tomto časovom bode výrazne down-regulované, pričom iné gény (napr. Acadm) vykazovali silný trend smerom k down-regulácii (obr. 6A). Na štúdium expresie génu BCAA u iných myšípoškodenie obličiekU myší liečených cisplatinou (obr. 6B) alebo u myší liečených UUO (obr. 6C) sme vykonali qRT-PCR. V oboch modeloch bola expresia Klf6 vysoko regulovaná oproti vehikulu/kontrole. U myší liečených cisplatinou bolo niekoľko testovaných génov BCAA významne znížených, s trendmi smerom k downregulácii ostatných génov (obr. 6B). U myší podliehajúcich UUO boli všetky testované gény významne znížené 3 aj 7 dní po UUO (obr. 6C), čo naznačuje, že zníženie génov BCAA nastáva skoro po poranení.
Obr. 5. Nadmerná expresia KLF6 potláča expresiu génu BCAA, produkciu ATP a využitie BCAA in vitro. (A) Expresia metabolických génov KLF6 a BCAA v HK-2 bunkách stabilne exprimujúcich kontrolné plazmidy (Con) alebo plazmidy s nadmernou expresiou KLF6 (OE), ošetrené DMSO alebo AAI. n=4 na skupinu; *P < 0.05,="" **p="">< {{10}}.01,="" ***p="">< 0.{101}="" {21}}01="" verzus="" con="" aai;="" $p="">< 0.{{3{{40}}}}5,="" $$p="">< 0,01,="" $$$p="">< 0,001="" oproti="" rovnakej="" bunkovej="" línii="" s="" dmso;="" dvojcestná="" anova="" s="" tukeyho="" korekciou="" pre="" viacnásobné="" testovanie.="" (b)="" kvantifikácia="" celkových="" bcaa="" v="" con="" a="" oe="" bunkách="" ošetrených="" dmso="" alebo="" aai.="" n="6" na="" skupinu;="" $p="">< 0,05="" oproti="" con="" dmso;="" jednosmerná="" anova="" so="" sidakovou="" korekciou="" pre="" viacnásobné="" testovanie.="" (c)="" percentuálna="" zmena="" rýchlosti="" mitochondriálnej="" produkcie="" atp="" v="" con="" a="" oe="" bunkách="" ošetrených="" aai="" oproti="" dmso.="" n="27" až="" 30="" na="" skupinu;="" *p="">< 0,05,="" ***p="">< 0,001="" oproti="" dmso,="" $="" p="">< 0,05="" oproti="" con="" aai;="" jednosmerná="" anova="" so="" sidakovou="" korekciou="" pre="" viacnásobné="" testovanie.="" (d)="" merania="" ocr="" pre="" bunky="" con="" a="" oe="" v="" obmedzených="" médiách.="" ak="" je="" to="" uvedené,="" pridal="" sa="" 2-dg,="" etomoxir="" (eto)="" a="" kombinácia="" rotenónu/antimycínu="" a="" (rot).="" n="16" na="" skupinu.="" (e)="" kvantifikácia="" bazálneho="" mitochondriálneho="" ocr="" (počiatočné="" ocr="" mínus="" post-rot="" ocr),="" nemitochondriálneho="" ocr="" (post-rot="" ocr)="" a="" zmien="" v="" ocr="" po="" pridaní="" 2-dg="" (mitochondriálna="" kompenzácia="" po="" 2-dg)="" a="" etomoxir="" (fao).="" n="16" na="" skupinu;="" **p="">< 0,01="" oproti="" con;="" dvojcestná="" anova="" s="" tukeyho="" korekciou="" pre="" viacnásobné="" testovanie.="" (f)="" mitochondriálna="" rýchlosť="" produkcie="" atp="" v="" bunkách="" bckdhb-scr="" a="" bckdhb-sh.="" n="14" na="" skupinu;="" **p="">< 0,05,="" nepárový="" t="" test.="" (g)="" ocr="" merania="" v="" hk-2="" bunkách="" v="" obmedzených="" médiách="" v="" neprítomnosti="" alebo="" prítomnosti="" bt2.="" tam,="" kde="" je="" to="" uvedené,="" boli="" pridané="" 2-dg,="" eto="" a="" rot.="" (h)="" kvantifikácia="" bazálneho="" mitochondriálneho="" ocr,="" nemitochondriálneho="" ocr="" a="" zmien="" v="" ocr="" po="" pridaní="" 2-dg="" a="" etomoxiru="" v="" hk-2="" bunkách="" v="" neprítomnosti="" alebo="" prítomnosti="" bt2.="" n="8" na="" skupinu;="" *p="">< 0,05="" oproti="" žiadnemu="" bt2;="" dvojcestná="" anova="" s="" tukeyho="" korekciou="" pre="" viacnásobné="" testovanie.="" údaje="" sú="" priemer="" ±="" sem,="" pričom="" n="" označuje="" počet="" biologických="">
Podobne dolovanie údajov zo skôr publikovaného expresného poľa z tubulointersticiálneho kompartmentu 36 ľudských pacientov s CKD (hypertenzívnych a diabetických pacientov).ochorenia obličiek) v porovnaní s kontrolnými pacientmi (6) ukázali, že niekoľko génov BCAA je downregulovaných podobným spôsobom ako u myší liečených AAI (obr. 6D). Pre bližšie objasnenie vzťahu medzifunkcie obličiek, expresiu KLF6 a expresiu génov BCAA v ľudskom CKD sme použili publikované expresné pole z tubu lointersticiálneho kompartmentu série 164 pacientov s rôznymiochorenia obličiek (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>90 ml/min/1,73 m2) (P < 0,001="" pre="" všetky="" gény),="" čo="" dokazuje,="" že="" tieto="" zmeny="" v="" génovej="" expresii="" sa="" môžu="" vyskytnúť="" skoro="" v="" súvislosti="" s="" funkčnými="" zmenami.="" súhrnne="" tieto="" údaje="" naznačujú,="" že="" klf{6}}sprostredkovaná="" supresia="" génov="" kritických="" pre="" katabolizmus="" bcaa="" môže="" hrať="" rozhodujúcu="" úlohu="" pri="">poškodenie obličiekv myšacích modelochobličkyfibrózy, ako aj u ľudí s CKD.
Diskusia
V tejto štúdii demonštrujeme in vivo úlohu PT-špecifického KLF6 v prostredípoškodenie obličiek.KLF6 je silne a dôsledne regulovaný na začiatku PT v reakcii napoškodenie obličiek, ale ide o maladaptívnu odpoveď, čo dokazuje ochranný účinok straty PT Klf6 po liečbe klinicky relevantným a vysoko PT-špecifickým toxínom AAI. Okrem toho demonštrujeme potenciálny význam dysregulovaného metabolizmu BCAA v poranenom PT ako možného prispievateľa k AKI a následnej fibróze. Strata Klf6 viedla k zachovaniu expresie katabolických enzýmov BCAA, pričom niekoľko génov kódujúcich tieto enzýmy malo väzbové miesta KLF6 v tesnej blízkosti ich TSS, čo naznačuje, že KLF6 môže byť transkripčným supresorom katabolizmu BCAA. Hoci sa predtým ukázalo, že ďalší člen rodiny KLF, KLF15, reguluje expresiu aminotransferázy 2 s rozvetveným reťazcom (Bcat2) kostrového svalstva (30), regulácia iných enzýmov BCAA nebola hlásená. Predpokladáme, že KLF6 pôsobí na potlačenie expresie viacerých génov kódujúcich enzýmy BCAA.
V nepoškodenom PT je expresia Klf6 nízka a variabilne exprimovaná v niektorých PT bunkách a nie v iných. Rýchla a robustná up-regulácia, ku ktorej dochádza po viacerých typoch poranenia, naznačuje fyziologicky dôležitú úlohu KLF6. Vo fibroblastoch sa nedávno ukázalo, že KLF6 je up-regulovaný v reakcii na onkogénny aj oxidačný stres, čo vedie k starnutiu buniek, zatiaľ čo umlčanie KLF6 viedlo k akumulácii markerov poškodenia DNA a genómovej nestability (31). Fyziologická úloha KLF6 pri poranení teda môže byť indukcia bunkového starnutia, čo umožňuje opravu poškodenia DNA, ktoré môže byť výsledkom toxických alebo oxidačných/ischemických urážok. Zdá sa však, že v poškodených PT bunkách je druhým dôsledkom up-regulácie Klf6 potlačenie katabolizmu BCAA, čo je najmä v PT bunkách pravdepodobne škodlivé. Je zaujímavé, že napriek čiastočnému zníženiu PT-špecifického Klf6 na začiatku u myší Klf6PTKD to bolo stále schopné poskytnúť jasný ochranný účinok po poranení. To má dôležité terapeutické dôsledky, pretože to naznačuje, že iba malá manipulácia s hladinami alebo aktivitou KLF6 (napr. použitím inhibítora s malou molekulou) by mohla preukázať terapeutickú účinnosť. Transkripčné faktory sú skutočne pravdepodobnejšie ako iné génové rodiny
v ľudskom genóme mať citlivosť na dávku (32). Podobne je jedným z obmedzení nášho myšacieho modelu indukovateľnej nadmernej expresie KLF6 to, že nejde o obmedzené PT bunky, a preto sa budúce štúdie budú musieť zamerať na použitie bunkovo špecifického indukovateľného modelu na objasnenie úlohy KLF6 závislej od bunkového kontextu.
Predtým sme demonštrovali, že strata Klf6 v glomerulárnych podocytoch bola škodlivá pri nastavení FSGS kvôli jeho úlohe pri transkripčnej aktivácii syntézy cytochróm c oxidázy 2 (Sco2). Strata Klf6 vo FSGS viedla k horšej fibróze so zvýšenou aktiváciou vnútornej apoptotickej dráhy (15). Interogácia dostupných súborov údajov jednobunkovej RNA-seq ukazuje, že u zdravých myšíobličky,Klf6 je exprimovaný v oveľa väčšom podiele podocytov ako PT buniek a na oveľa vyššej úrovni (odkaz 33; https://susztaklab.com/). KLF6 preto pravdepodobne hrá dôležitejšiu fyziologickú úlohu v normálnych podocytoch ako v PT bunkách, zatiaľ čo iné známe mitochondriálne hlavné regulátory (napr. Ppara) sú exprimované oveľa viac v PT bunkách ako podocyty. Strata Klf6 v podocytoch má teda pravdepodobne škodlivejší účinok ako v PT bunkách. Kontrastné úlohy KLF6 v rôznych typoch buniek v rámciobličkyparalelne s predchádzajúcimi zisteniami bunkovo špecifických účinkov v srdci a pečeni. Knockdown Klf6 v srdcových myocytoch u myší teda oslabil srdcovú fibrózu po nadmernom zaťažení angiotenzínom II, čo naznačuje úlohu KLF6 pri šírení fibrózy, ale knockdown Klf6 v srdcových myofibroblastoch nemal žiadny vplyv na fibrózu (14). Naopak, v pečeni, knockdown Klf6 v myších hepatocytoch nemal žiadny vplyv na pečeňovú fibrózu po chronickom podávaní CCl4, ale nadmerná expresia KLF6 v pečeňových hviezdicových bunkách viedla k zníženej fibróze, čo naznačuje, že KLF6 je ochranný (13).
CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESŤ OBLIČIEK/OBLIVÍN
Strata FAO počaspoškodenie obličiekje teraz známe, že je dôležitou udalosťou v patológiipoškodenie obličieka skutočne môže priamo prispievať k fibróze. Pri absencii FAO, ktorá je hlavným zdrojom energie pre nepoškodené PT, môžu mať iné potenciálne zdroje energie väčší význam. BCAA prispievajú k cyklu TCA prostredníctvom produkcie acetyl-CoA a sukcinyl-CoA. Nedávna štúdia preukázala, že nielen BCAA značené 13C prispievajú k medziproduktom cyklu TCA vobličkyaleobličkymali štvrté najvyššie začlenenie 13C do medziproduktov cyklu TCA z testovaných orgánov, po pankrease, svaloch a bielom tukovom tkanive (34), čo naznačuje, že BCAA sú potenciálne dôležitým prispievateľom do cyklu TCA. Význam katabolizmu BCAA v prispievaní k cyklu TCA, či už u normálnych alebo zranenýchobličky, nebol predtým preskúmaný. Napríklad nie je známe, či by samotná strata katabolizmu PT BCAA spôsobila zmeny v homeostáze a/alebo oprave PT a tieto štúdie si budú vyžadovať vytvorenie nových myších modelov, ako sú PT-špecifické Bckdhb knockdown myši. V prostredíobličkyzranenia, keď je FAO výrazne potlačená, dodatočné potlačenie
gény kódujúce metabolické enzýmy BCAA môžu pripraviť tubulárne bunky o dôležitý alternatívny potenciálny zdroj energie. Je dôležité poznamenať, že expresia génu BCAA bola znížená už 24 hodín po jednej injekcii, pred akýmikoľvek zmenami v sérovom kreatiníne alebo strate PT, čo naznačuje, že tieto zníženia boli špecifickým dôsledkom poškodenia PT a nesúviseli so zníženým dopytom po energii PT. zo zníženej GFR a následne zníženej požiadavky na absorpciu rozpustenej látky. Tieto dráhy boli zachované u myší Klf6PTKD, ktoré boli chránené pred zranením a ďalej potlačené u myší hKLF6OE, ktoré mali horšie poškodenie. Okrem toho bunky KLF6-OE znížili produkciu mitochondriálneho ATP po liečbe AAI v porovnaní s bunkami KLF6-Con a zatiaľ čo intracelulárne BCAA boli v bunkách KLF6-Con znížené, čo je v súlade s ich katabolizmom , tento pokles nebol zistený v bunkách KLF6-OE. Okrem toho knockdown BCKDHB v HK-2 bunkách viedol k zníženiu mitochondriálnej produkcie ATP. Zachovaná expresia génov BCAA u myší Klf6PTKD teda môže poskytnúť ochranu pred zranením dodaním životne dôležitých medziproduktov cyklu TCA v prostredí výrazne zníženej oxidácie FA. Budúce štúdie s použitím myší s genetickými manipuláciami katabolizmu BCAA a/alebo liečbou BT2 by nám umožnili preskúmať dynamiku medzi katabolizmom BCAA a FAO vpoškodenie obličiek.
Ukázali sme, že strata expresie génov BCAA vedie k zníženiu mitochondriálneho dýchania a produkcie ATP, čo predstavuje jeden mechanizmus, ktorým môže strata katabolizmu BCAA prispieť kpoškodenie obličiek. Alternatívnym mechanizmom môže byť akumulácia BCAA, ktorá môže mať toxický účinok. V skutočnosti sa to ukázalo pri nastavení srdcového IRI. Ukázalo sa, že akumulácia BCAA v dôsledku straty katabolizmu inhibuje využitie mitochondriálneho pyruvátu posttranslačnou inaktiváciou pyruvátdehydrogenázy, čím sa odstraňuje ďalší zdroj bunkovej energie a zhoršuje sa poškodenie (35). Toto sa zvrátilo buď zvýšením katabolizmu BCAA ošetrením myší BT2 alebo zvýšením metabolizmu glukózy nadmernou expresiou GLUT1. Nedávna štúdia tiež ukázala exacerbáciu srdcového IRI stratou katabolizmu BCAA u diabetických myší. Toto bolo sprevádzané zvýšeným oxidačným stresom a opäť bolo zvrátené reaktiváciou katabolizmu BCAA (36). Je známe, že BCAA a najmä leucín aktivujú signalizáciu cicavčieho cieľa rapamycínového (mTOR) komplexu 1 (mTORC1). V myšom modeli polycystickýchochorenie obličiek,v ktorých bunky obklopujúce cysty majú aktiváciu mTOR
signalizácia, suplementácia BCAA ďalej aktivovala signalizáciu mTORC1, čo vedie k zvýšenej proliferácii (37). Transkripčné profilovanie hepatocelulárnych karcinómov odhalilo zníženú expresiu génu BCAA, čo viedlo k akumulácii BCAA v nádorovom tkanive. Toto bolo spojené so zvýšenou signalizáciou a proliferáciou mTORC1, ktorá bola znížená obmedzením BCAA alebo liečbou BT2 a bola exacerbovaná u myší kŕmených diétou s vysokým obsahom BCAA (38). Pre funkciu PT je potrebná signalizácia mTORC1 a štúdie využívajúce inhibítory mTOR vpoškodenie obličiekukázali protichodné výsledky, pravdepodobne kvôli rôznym dávkovacím režimom, načasovaniu liečby a modelom zranení (39–42). Signalizácia mTORC1 vedie k množstvu bunkových reakcií vrátane bunkového rastu a proliferácie, syntézy lipidov, mitochondriálnej syntézy a potlačenia autofágie (43). Je pravdepodobné, že buď nedostatočná alebo nadmerná aktivácia signalizácie mTORC1 by mohla byť škodlivá a že pre správnu bunkovú funkciu je potrebná rovnováha. Napríklad nadmerná aktivácia signalizácie mTORC1 pri poškodení PT môže viesť k škodlivému potlačeniu autofágie, ktorá je potrebná na odstránenie poškodených mitochondrií, a ukázalo sa, že je dôležitá pre zotavenie po PTzranenie (39, 42, 44, 45). Akumulácia leucínu môže mať teda škodlivú úlohupoškodenie obličieknadmernou aktiváciou signalizácie mTORC1 a potlačením autofágie. Na záver sme ukázali, že robustná up-regulácia Klf6, ku ktorej dochádza vpoškodenie obličiekje škodlivý, pri ktorom strata PT-špecifického Klf6 zachovala expresiu génu BCAA a zoslabila AKI a prípadnú fibrózu. Naopak, indukcia KLF6 u myší potlačila expresiu génu BCAA a spôsobilaobličkycitlivé napoškodenie obličiek.Okrem toho gény kódujúce viaceré enzýmy BCAA majú väzbové miesta KLF6, čo naznačuje, že KLF6 môže byť transkripčným regulátorom katabolizmu BCAA. Down regulácia katabolizmu BCAA in vitro nadmernou expresiou KLF6 a liečbou AAI alebo knockdownom BCKDHB, viedlaznížená produkcia mitochondriálneho ATP. Spoločne tietoúdaje naznačujú, že terapeuticky zamerané na zachovanieKatabolizmus BCAA môže poskytnúť alternatívnu mitochondriuzdroj energie v prostredípoškodenie obličiekv ktorej FAOje znížená.
