Laccase-mediátorový systém využívajúci prírodný mediátor ako bieliace činidlo na odfarbenie melanínu, časť 1

Abstrakt: V tejto štúdii bol vyvinutý lakázovo-mediátorový systém (LMS) využívajúci prirodzený mediátor ako bieliace činidlo na odfarbovanie melanínu. Sedem prirodzených mediátorov bolo použitých na nahradenie syntetických mediátorov a na úspešné prekonanie nízkeho redoxného potenciálu lakázy a obmedzeného prístupu melanínu k aktívnemu miestu lakázy. Melanínová odfarbovacia aktivita lakáz z Trametes versicolor (lacT) a Myceliophthora thermophila (lacM) bola významne zvýšená použitím prírodných mediátorov vrátane acetosyringónu, syringaldehydu a acetovanilónu, ktoré vykazovali nízku cytotoxicitu. Pri odfarbovaní melanínu hrajú dôležitú úlohu metoxy a ketónové skupiny prírodných mediátorov. Konštanty špecifickosti lacT a lacM pre odfarbenie melanínu sa zvýšili o 247 a 334, keď sa ako mediátor použil acetosyringón. LMS s použitím čipky a acetosyringónu môže tiež odfarbiť melanín prítomný v celulózovom hydrogélovom filme, ktorý napodobňuje stav pokožky. Okrem toho by LMS mohla odfarbiť nielen syntetické analógy eumelanínu pripravené oxidáciou tyrozínu, ale aj prirodzený melanín produkovaný bunkami melanómu.

Podľa relevantných štúdiícistancheje obyčajná bylina, ktorá je známa ako "zázračná bylina, ktorá predlžuje život". Jeho hlavnou zložkou jecistanozid, ktorý má rôzne účinky ako naprantioxidant, protizápalové, apodpora imunitnej funkcie. Mechanizmus medzi cistanche abielenie kožespočíva v antioxidačnom účinku cistancheglykozidy. melanínv ľudskej koži vzniká oxidáciou tyrozínu katalyzovanoutyrozinázaa oxidačná reakcia si vyžaduje účasť kyslíka, takže bezkyslíkaté radikály v tele sa stávajú dôležitým faktorom ovplyvňujúcim produkciu melanínu. Cistanche obsahujecistanozid, čo je antioxidant a môže znížiť tvorbu voľných radikálov v tele, tedainhibícia produkcie melanínu.

Kliknite na Výhody Rou Cong Rong pre bielenie

Ďalšie informácie:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Úvod

Lakázy (EC 1.10.3.2, benzéndiol: dioxygenoxidoreduktázy) sú multimedené proteíny, ktoré katalyzujú oxidáciu rôznych fenolových a nefenolových zlúčenín prostredníctvom radikálovo katalyzovaného reakčného mechanizmu redukciou molekulárneho kyslíka [1,2]. Lakázy sa používajú ako biokatalyzátory pre biodegradačné procesy, ako je bioremediácia farbív [3,4], liečiv [5,6], herbicídov [7] a delignifikácie [8–10]. Lakázy sa tiež používajú na katalýzu polymerizácie prekurzorov farbív a organických zlúčenín [11]. Najmä ich atraktívne vlastnosti, ako je nízka substrátová špecifickosť, použitie kyslíka ako konečného akceptora elektrónov, tvorba vody ako vedľajšieho produktu a žiadna potreba (alebo žiadna produkcia) peroxidov, ich robí zaujímavými v biotechnologických a environmentálne oblasti [1,11,12].

Na katalytickej aktivite lakázy sa podieľajú štyri ióny medi na aktívnom mieste. „Modrá“ meď (miesto T1) oxiduje substrát a trojjadrový klaster medi (T2/T3) prijíma elektróny z miesta T1 na redukciu molekulárneho kyslíka [1,12,13]. Najmä redoxný potenciál T1 miesta Cu sa považuje za hlavný faktor pri určovaní katalytickej schopnosti lakáz [14]. Lakázy majú relatívne nízky redoxný potenciál (0.4–0.8V) v porovnaní s ligninolytickými peroxidázami (viac ako 1V), ako je mangánová peroxidáza a lignínová peroxidáza. Lakázy nedokážu priamo oxidovať nefenolické substráty s redoxným potenciálom nad 1,3 V [13,14]. Preto, aby sa prekonali obmedzenia lakázy, lakázy-mediátorových systémov (LMS) pomocou malých molekulárnych zlúčenín, ako je 2,20 -azinobis(3-etylbenztiazolín-6-sulfonát) (ABTS), { {24}} hydroxybenzotriazol (HOBt), kyselina violurová (VLA), N-hydroxyftalimid (HPI), N-hydroxyacetanilid (NHA) a TEMPO, ktoré pôsobia ako redoxné mediátory [15–17].

Tieto mediátory umožňujú oxidáciu objemných zlúčenín rôznymi oxidačnými cestami. Systém lakáza-ABTS oxiduje substráty vytváraním katiónového radikálu ABTS prostredníctvom mechanizmu prenosu elektrónov (ET). LMS s HOBt, VLA, HPI alebo NHA produkujú nitroxylové radikály mechanizmom prenosu atómov vodíka (HAT) [1,12,17]. Okrem toho mediátory, ako je TEMPO a jeho analógy, reagujú prostredníctvom iónových dráh za vzniku oxoamóniových iónov [1,12,18]. Použitie týchto mediátorov môže oxidovať širokú škálu zlúčenín v rôznych aplikáciách, ako je degradácia farbív [3,4], degradácia liečiv [5,6] a degradácia lignínu [8–10]. Napriek tomu sú aplikácie syntetických mediátorov v priemyselných oblastiach obmedzené kvôli ich potenciálnej toxicite, vysokej cene a účinku na inaktiváciu enzýmov. Nedávno boli študované fenolové molekuly odvodené od lignínu ako prirodzené mediátory (napr. syringaldehyd, acetosyringón, vanilín, acetovanilon, metylvanilát, kyselina ferulová, kyselina sinapová, kyselina p-kumarová atď.), ktoré nahradili syntetické mediátory [1,12]. . Výhodou prírodných mediátorov je nízka cena a nízka toxicita, pretože sa získavajú z prírodných a obnoviteľných zdrojov [19].

Melanín je skupina prírodných pigmentov produkovaných melanogenézou prostredníctvom oxidačnej polymerizácie tyrozínu melanocytmi. Prirodzený melanín možno rozdeliť do piatich kategórií: eumelanín, feomelanín, celý melanín, feomelanín a neuromelanín [20]. Nedávno boli študované rôzne medicínske a elektrochemické aplikácie využívajúce melanín alebo prekurzory melanínu [20,21]. Farba ľudskej kože je väčšinou určená prítomnosťou melanínu. V kozmetickom priemysle bola na vývoj činidiel na bielenie pokožky navrhnutá priama depigmentácia melanínu pomocou enzýmov. Na odfarbovanie melanínu bolo študovaných niekoľko peroxidáz. Woo a spol. ukázali, že syntetický melanín môže byť priamo odfarbený lignín peroxidázou z P. chrysosporium [22]. Skupiny Keneko a Mohorciˇc tiež uviedli enzymatické odfarbenie melanínu mangánovou peroxidázou izolovanou z húb (Sporotrichum pruinose a Phlebia radiata) [23,24]. Kim a spol. uviedli, že surové enzýmové zmesi obsahujúce mangánovú peroxidázu, lignín peroxidázu a lakázu vykazovali depigmentačnú aktivitu melanínu [25]. Keď peroxidázy odfarbujú melanín, vyžadujú peroxid vodíka (H2O2) ako kofaktor, ktorý môže dráždiť pokožku. Na zníženie spotreby H2O2 sa teda do systému kombinácie enzýmov zaviedla glukóza oxidáza alebo lakáza [26,27]. Lakázy dokážu odfarbiť melanín bez použitia peroxidu vodíka. Khammuang a Sarnthima uviedli, že lakáza z Lentinus polycarpous Lév vykazovala aktivitu odfarbovania melanínu pomocou ABTS, vanilínu a kyseliny vanilovej ako mediátorov [28].

2. Materiály a metódy

2.1. Materiály

2.2. Odfarbenie melanínu pomocou LMS

Nasýtený roztok melanínu (1,4 mg/ml) sa pripravil rozpustením 3 mg syntetického melanínu v 1,3 ml 10mM NaOH. Roztok sa centrifugoval pri 8500 ot./min počas 5 minút, aby sa odstránil nerozpustený melanín, a supernatant sa zriedil 0,1 M fosfátovým pufrom kyseliny citrónovej (pH 3, 4, 5, 5.5, 6 alebo 7) a používa sa ako substrátový roztok pre LMS. Koncentrácia melanínu v substrátovom roztoku bola 63 ug/ml a spektrofotometricky potvrdená pri 475 nm. 0,8 ml roztoku melanínového substrátu sa zmiešalo s 0,1 ml roztoku mediátora (0–1 mM) v 1,5 ml Eppendorfovej skúmavke. Melanínová odfarbovacia reakcia sa začala pridaním 0,1 ml roztoku lakázy (15,8 ug (0,6 U) lacT alebo 19,2 ug (1,8 U) lacM) do zmesi melanínu a mediátora pri 25 °C v trepacom vodnom kúpeli pri 120 ot./min. . Po reakcii sa reakčná zmes odstredila a merala sa absorbancia supernatantu pri 475 nm. Výťažok odfarbenia (v percentách) sa vypočítal pomocou nasledujúcej rovnice:

Odfarbenie ( percentá ) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100, (1)

2.3. Kinetická štúdia odfarbovania melanínu pomocou LMS

2.4. Cytotoxicita prírodných mediátorov

Bunková línia melanómu B16F10 (Korea Cell Line Bank, Soul, Kórea) sa použila na stanovenie cytotoxicity prirodzených mediátorov pre LMS. Na meranie cytotoxicity mediátorov sa uskutočnil test neutrálnej červenej (NR) [29]. NR meria životaschopnosť lyzozómov živých buniek. Melanómové bunky s koncentráciou 3 x 104 buniek boli rozdelené do každej jamky 96-jamkovej platne. Po 24 hodinách kultivácie boli bunky ošetrené prírodnými mediátormi (1, 2, 5, 10, 22 a 46 mM). Po ďalšej kultivácii počas 2 dní boli bunky ošetrené 50 ug/ml roztoku NR rozpusteného v DMEM a inkubované počas 3 hodín. Po odstránení supernatantu odsatím sa na extrakciu farby použil NR desorbčný roztok (1 % ľadovej kyseliny octovej, 49 % etanolu a 50 % destilovanej vody). Po procese extrakcie sa merala zmena absorbancie pri 540 nm.

2.5. Príprava a odfarbenie hydrogélového filmu melanín/celulóza

Na meranie odfarbovacej aktivity LMS pre melanín / celulózový film sa pripravený hydrogélový film narezal na hárok s rozmermi 1 x 2 cm. Hydrogélový film sa ponoril do 4 ml 0,1 M fosfátového pufra kyseliny citrónovej (pH 5,5); následne sa do tlmivého roztoku pridalo 0,5 ml 1 mM acetosyringónu a 0,5 ml roztoku čipky (2,5 U). Odfarbovacia reakcia sa uskutočnila vo vodnom kúpeli za trepania pri 120 pm a 25 °C počas 3 hodín. Po reakcii bol film premytý destilovanou vodou a pripevnený k vnútornej strane kyvety, aby sa zmerala zmena v spektrách v rozsahu 400–800 nm pomocou UV/Vis spektrofotometra. Kontrolné reakcie bez lacM alebo mediátorov sa tiež uskutočňovali za rovnakých podmienok. Uvoľňovanie melanínu z filmu alebo zmena farby melanínového/celulózového filmu sa za reakčných podmienok nezistili. Okrem toho sa pomocou kolorimetra (KONICA MI NOLTA, Tokio, Japonsko) zaznamenala aj zmena farebných parametrov (hodnoty L*, a* a b*) filmu melanín/celulóza po odfarbovacej reakcii pomocou LMS. Hodnoty ∆L (metrický rozdiel svetlosti), ∆E (celkový farebný rozdiel), YI (index žltnutia) a WI (index belosti) boli získané pomocou nasledujúcich rovníc [30–32]:

2.6. Príprava prírodného melanínu

Prírodný melanín sa získal z buniek melanómu B16F10. Bunky boli ošetrené hormónom stimulujúcim alfa-melanocyty za vzniku melanínu. Po 4 dňoch inkubácie boli bunky zachytené pomocou trypsín-EDTA a sonikované počas 10 minút. Supernatant sa získal centrifugáciou pri 8000 otáčkach za minútu počas 10 minút a potom sa upravilo pH na 1,5 pomocou 6 M HCl. Roztok sa varil pri 100 °C počas 4 hodín, aby sa hydrolyzovali zvyškové proteínové frakcie. Roztok obsahujúci prírodný melanín sa premyl acetónom, potom chloroformom a etanolom a potom sa premyl deionizovanou vodou, aby sa eliminovali zvyšky, ako sú bunky, zložky média a proteínové frakcie [33,34]. Všetky umývacie procesy sa uskutočňovali viac ako dvakrát. Nakoniec sa lyofilizáciou získal prírodný melanín a použil sa ako substrát pre LMS.

3. Výsledky a diskusia

3.1. Vplyv mediátorov na odfarbovanie melanínu pomocou LMS

Účinok rôznych mediátorov na reakciu odfarbovania melanínu pomocou LMS sa skúmal pomocou dvoch lakáz z T. versicolor (lacT) a M. thermophila (lacM) (obrázok 1).Keď sa lacT použil bez mediátora na odfarbenie melanínu, výťažok odfarbenia bol len 1 percento po 5 hodinách reakcie. Keď sa HOBt použil ako mediátor pre lacT, výťažok odfarbenia sa mierne zvýšil na 2 percentá po 5 hodinách reakcie. Použitie rôznych syntetických mediátorov, ako sú HOBt, ABTS, VLA a TEMPO, pri lakázou katalyzovanej oxidácii fenolových alebo nefenolových zlúčenín významne zvýšilo reakčné rýchlosti [10,15]. Keď je prístup cieľových zlúčenín do aktívneho miesta lakázy obmedzený ich stérickou zábranou, mediátorové radikály tvorené lakázou môžu účinne oxidovať cieľové zlúčeniny mechanizmom prenosu elektrónov alebo atómov vodíka [12]. HOBt je jedným z najčastejšie používaných syntetických mediátorov v LMS vďaka vysokému redoxnému potenciálu (1,1 V) [6]. HOBt však nie je dobrou kozmetickou zložkou pre svoju potenciálnu bunkovú toxicitu a schopnosť inaktivovať lakázu. Vybrali sme teda sedem prírodných mediátorov, acetosyringón, syringaldehyd, kyselinu p-kumarovú, vanilín, kyselinu vanilovú, vanilylalkohol a acetovanilón pre reakciu odfarbovania melanínu pomocou LMS. Je zaujímavé, že všetky prirodzené mediátory pôsobia ako účinnejšie mediátory ako HOBt pri odfarbovaní melanínu nedostatkom. Keď sa použil acetosyringón, syringaldehyd a kyselina p-kumarová, výťažky odfarbenia boli po 5 hodinách reakcie 28 percent, 22 percent a 18 percent. Tieto výsledky demonštrujú užitočnosť prirodzených mediátorov pre reakciu odfarbovania melanínu pomocou LMS. Mediátory v LMS sú lakázou oxidované na mediátorové radikály a mediátorové radikály vyvolávajú oxidáciu a odfarbovanie melanínu. Keď sa nedostatok použil bez mediátora na odfarbenie melanínu počas dostatočnej reakčnej doby, ktorá mohla dosiahnuť rovnovážny stav, výťažok odfarbenia bol 7 percent po 24 hodinách reakcie. Prirodzené mediátory, okrem kyseliny vanilovej, pôsobia ako účinnejšie mediátory ako HOBt pri odfarbovaní melanínu pomocou lacT po 24 hodinách reakcie. Výťažok odfarbenia po 24 hodinách reakcie s použitím kyseliny vanilovej ako mediátora bol nižší ako po 5 hodinách reakcie. To môže byť spôsobené nízkou stabilitou formy oxidovaného radikálu kyseliny vanilovej. Keď sa použil acetosyringón, syringaldehyd a acetovanilón, výťažky odfarbenia boli po 24 hodinách reakcie 34 percent, 30 percent a 31 percent. Kyselina p-kumarová bola účinnejšia pri zvyšovaní počiatočnej rýchlosti reakcie ako acetovanilón, zatiaľ čo acetovanilón vyvolal vyšší výťažok odfarbenia v rovnovážnom stave ako kyselina p-kumarová.

Účinok mediátora na odfarbovaciu reakciu pomocou LMS s použitím lacM bol tiež veľmi podobný účinku získaného pomocou LMS s použitím lacT. Keď sa čipka použila bez mediátora na odfarbenie melanínu, výťažok odfarbenia bol len 2 percentá po 5 hodinách reakcie. HOBt ako mediátor pre lacM nezvýšil výťažok odfarbenia počas 5-hodinovej reakcie. Všetky prirodzené mediátory, okrem kyseliny p-kumarovej a vanilínu, pôsobili ako účinné mediátory odfarbovania melanínu pomocou lacM. Keď sa použil acetosyringón a syringaldehyd, výťažky odfarbenia boli 25 percent, respektíve 22 percent, po 5 hodinách reakcie. Kyselina p-kumarová a vanilín boli použité ako účinné mediátory pre každý z nich, ale nemohli účinne zvýšiť mieru odfarbenia v LMS pomocou čipky. Môže to byť spôsobené nižšou substrátovou špecifickosťou lacM pre kyselinu p-kumarovú a vanilín. Výťažky odfarbenia po 24 hodinách reakcie lacM s kyselinou p-kumarovou a vanilínom boli podobné ako výťažky získané pomocou lacT. To naznačuje, že oxidované formy kyseliny p-kumarovej a vanilínu môžu účinne odfarbovať melanín, hoci ich rýchlosť oxidácie lacM bola oveľa nižšia ako rýchlosť lacT. Keď sa lacM bez mediátora použil na odfarbenie melanínu počas dostatočnej reakčnej doby, výťažok odfarbenia bol 5 percent po 24 hodinách reakcie. Prirodzené mediátory, okrem kyseliny vanilovej, tiež pôsobia ako účinnejšie mediátory ako HOBt pri odfarbovaní melanínu pomocou lacM po 24 hodinách reakcie. Keď sa ako mediátory pre lacM použili acetosyringón, syringaldehyd a acetovanilón, výťažky odfarbenia boli 34 percent, 28 percent a 31 percent, v uvedenom poradí, po 24 hodinách reakcie. Keď sa kyselina vanilka použila ako mediátor pre lacT aj lacM, vykazovala najnižší výťažok odfarbenia. To môže byť spôsobené nízkou stabilitou formy oxidovaného radikálu kyseliny vanilovej. Khammuang a Sarnthima uviedli, že vanilín a kyselina vanilínová môžu byť použité ako mediátory na odfarbenie melanínu pomocou lakázy z Lentinus polycarpous [28]. Vykázali však oveľa nižšiu odfarbovaciu aktivitu pre melanín ako acetosyringón, keď boli použité ako mediátory pre lacT a čipku.

Tieto výsledky naznačujú, že prirodzené mediátory sú účinnejšie pri odfarbovaní melanínu pomocou LMS ako HOBt. HOBt bol považovaný za účinný syntetický mediátor pre lakázu kvôli jeho vysokému redoxnému potenciálu a katalytickej úlohe N OH skupiny HOBt [5]. Účinnosť mediátorov pri oxidácii cieľových substrátov je vysoko závislá od schopnosti vytvárať stabilné radikály, ako aj od stérickej zábrany spôsobenej objemnými alkylovými substituentmi, a nie od redoxného potenciálu mediátorov [19,35]. Nízka stabilita oxidovaného medziproduktu HOBt bola stanovená pomocou cyklickej voltametrie [6]. Preto nízky výťažok odfarbenia pomocou LMS s použitím HOBt môže byť spôsobený nízkou stabilitou HOBt za reakčných podmienok lakázy. Hoci redoxný potenciál syringaldehydu bol nižší ako potenciál HOBt, syringaldehyd vykazoval relatívne vyššiu stabilitu ako HOBt [6].

Ako je znázornené na obrázku 2, prirodzené mediátory použité v tejto práci majú rôzne substituenty (napr. hydroxyl, metoxy, karboxyl, ketón alebo aldehyd) v rôznych polohách na benzénovom kruhu [12,19]. Mediátory s dvoma metoxyskupinami (acetosyringón a syringaldehyd) vykazovali vyššiu mieru odfarbenia ako mediátory s jednou metoxyskupinou. Rýchlosť odfarbenia získaná kyselinou p-kumarovou bez metoxyskupiny bola závislá od typu lakázy. Kyselina p-kumarová s lacT vykazovala vyššiu mieru odfarbenia ako tie s jednou metoxyskupinou, zatiaľ čo kyselina p-kumarová s lacM vykazovala najnižšiu rýchlosť odfarbenia v 5-hodinovej reakcii. Fillat a kol. tiež ukázali podobné výsledky pre odfarbenie flexografických atramentov hubovými lakázami s prírodnými mediátormi [36]. Fenolické prírodné mediátory (acetosyringón, metyl injekčná striekačka a syringaldehyd) s dvoma metoxy substituentami v kruhu boli oxidované lakázou rýchlejšie ako kyselina p-kumarová bez metoxy skupiny. To naznačuje, že metoxyskupiny hrajú dôležitejšiu úlohu ako donory elektrónov ako dvojitá väzba laterálneho reťazca kyseliny p-kumarovej. Keď sa porovnali mediátory s jednou metoxyskupinou, výťažok odfarbenia sa zvýšil v nasledujúcom poradí: acetovanilon > vanilín > vanilylalkohol > kyselina vanilová. Acetovanilón, ktorý má ketónovú skupinu, vykazoval vyššiu rýchlosť odfarbenia a výťažok ako mediátory s aldehydovými, hydroxylovými a karboxylovými skupinami. Acetosyringón s ketónovou skupinou tiež vykazoval vyššiu rýchlosť odfarbenia a výťažok ako syringaldehyd s aldehydovou skupinou.

V nasledujúcich experimentoch boli acetosyringón, syringaldehyd a acetovanilón, ktoré vykazovali vysokú schopnosť odfarbovania melanínu, vybrané ako mediátory pre LMS na odfarbovanie melanínu. Účinok mediátora na odfarbovaciu reakciu pomocou LMS sa skúmal v priebehu času (obrázok S1). Reakcia odfarbenia pomocou lacT s acetosyringónom, syringaldehydom a acetovanilónom viedla k 21 percentám, 18 percentám a 1 percentám výťažkov odfarbenia po 1 hodine reakcie. Reakcia odfarbenia pomocou lacM s acetosyringónom a syringaldehydom viedla k 19 percentám a 18 percentám odfarbenia po 1 hodine reakcie. Obidve lakázy vykazovali podobné reakčné profily, keď sa použil rovnaký mediátor. Acetosyringón a syringaldehyd významne zvýšili rýchlosť odfarbenia počas počiatočnej reakcie. Tieto výsledky ukazujú, že acetosyringón a syringaldehyd obsahujúce dimetoxyskupiny boli účinnejšie pri zvyšovaní počiatočnej rýchlosti odfarbovania pomocou LMS ako acetovanilón obsahujúci jednu metoxyskupinu. Fillat a kol. tiež uviedli, že metoxyskupiny v kruhových štruktúrach mediátorov pôsobia ako urýchľovače oxidácie substrátov [36]. Na druhej strane, výťažok odfarbenia po 24 hodinách reakcie acetovanilónom bol podobný ako výťažok syringaldehydu, hoci acetovanilón mierne zvýšil rýchlosť reakcie.

Viac informácií: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501