Nízke koncentrácie paraquatu indukujú skorú aktiváciu extracelulárnym signálom regulovanej kinázy 1/2, proteínkinázy B a C-Jun N-terminálnej kinázy 1/2 dráhy: Úloha C-Jun N-terminálnej kinázy v bunkovej smrti indukovanej paraquatom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Mireia Niso-Santano, Jose' M. Mora'n, Lourdes Garcı'a-Rubio, Ana Go'mez-Martı'n, Rosa A. Gonza'lez-Polo, Germa'n Soler, § a Jose' M. Fuentes

Abstrakt:

Paraquat je herbicíd s potenciálnym rizikom vyvolania parkinsonizmu v dôsledku jeho preukázanej neurotoxicity a jeho silnej štruktúrnej podobnosti s 1-metyl-4-fenylpyridíniom (MPP plus ), dobre známym neurotoxínom, ktorý spôsobuje podobný klinický syndróm doParkinsonova choroba(PD). V súčasnosti je však veľmi málo známe o signálnych dráhach aktivovaných paraquatom v akomkoľvek bunkovom systéme. V tejto štúdii sme skúmali účinok paraquatu na aktiváciu kináz 1 a 2 regulovaných extracelulárnym signálom (ERK1/2), c-Jun N-terminálnej kinázy (JNK) a proteínkinázy B (PKB) v bunkách E18. Nízke koncentrácie parakvátu stimulovali veľmi skoré zvýšenie fosforylácie ERK1/2, JNK1/2 a PKB. Inhibítory fosfatidylinozitol 3-kinázy (PI-3K) wortmannín a LY 294002 (2-(4-morfolinyl)-8-fenyl-4H{{ 19}}benzopyrán-4-on) inhiboval skoré zvýšenie fosforylácie PKB vyvolané paraquatom. Okrem toho včasné zvýšenie aktivácie ERK1/2 sprostredkované parakvátom bolo citlivé na mitogénom aktivovaný inhibítor proteínkinázy 1 (MEK1) PD 98059 (2#-amino{{{31}#-metoxyflflavón), zatiaľ čo reakcie JNK1/2 boli blokované JNK1/2 inhibítorom SP 600125 (anthra[1-9-cd]pyrazol-6(2H)-ón). Predbežné ošetrenie wortmannínom, LY 294002 alebo PD 98059 neovplyvnilo smrť paraquatových buniek v bunkách E18. Na rozdiel od toho SP 600125 významne znížil bunkovú smrť indukovanú paraquatom v bunkách E18. Na záver sme ukázali, že nízke koncentrácie paraquatu stimulujú silné veľmi skoré zvýšenie fosforylácie ERK1/2, JNK1/2 a PKB v bunkách E18. Okrem toho prezentované údaje naznačujú, že inhibícia JNK1/2 dráhy chráni bunky E18 pred bunkovou smrťou vyvolanou paraquatom a podporujú skutočnosť, že inhibícia včasnej aktivácie JNK1/2 môže predstavovať potenciálnu stratégiu pri liečbe PD. Kľúčové slová: paraquat; nízke koncentrácie; JNK; bunková smrť; Parkinson.

Bylina proti Parkinsonovej chorobe:cistanche

ÚVOD

Parkinsonova choroba (PD)je neurodegeneratívna porucha charakterizovaná smrťou dopaminergných neurónov v sub-Constantia nigra v spojení s intracytoplazmatickými inklúziami známymi ako Lewyho telieska (Olanow a Tatton, 1999). Len 5–10 percent pacientov s PD má familiárnu formu tohto ochorenia s autozomálne dominantným spôsobom dedičnosti (Gasser, 2001). Genetické faktory sú dôležité u pacientov s mladým nástupom, ale pravdepodobne nebudú hrať hlavnú úlohu pri bežnejšej sporadickej PD. Naproti tomu epidemiologické štúdie naznačujú niekoľko environmentálnych faktorov, ktoré zvyšujú riziko vzniku PD (Parkinsonova choroba). Patria sem pesticídy, herbicídy, priemyselné chemikálie, poľnohospodárstvo a život vo vidieckom prostredí (Cory-Slechta a kol., 2005; Gasser, 2001; Landrigan a kol., 2005; Tanner a BenShlomo, 1999). Najpresvedčivejší argument na podporu environmentálneho faktora pri PD sa týka objavu biologických účinkov MPTP (1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6- tetrarchy-dropyridín). Tento toxín centrálneho nervového systému vytvára syndróm, ktorý je klinicky aj anatomicky podobný PD (Kopin a Markey, 1988; Langston a kol., 1983). V tomto zmysle bol široko používaný herbicíd paraquat (1,1#-dimetyl-4,4#-bypiridínium) navrhnutý ako predpokladaný rizikový faktor na základe jeho štrukturálnej homológie s MPP®, aktívnym metabolitom MPTP ( Tanner a Langston, 1990) a o správach o parkinsonizme korelovanom s expozíciou látke (Hertzman a kol., 1990; Hubble a kol., 1993; Jimenez-Jimenezet al., 1992; Liou a kol., 1997; Wang a kol. al., 1992). Zatiaľ čo signálne dráhy zapojené do bunkovej smrti MPPþ sú dobre známe (Halvorsen a kol., 2002; Gomez-Santos a kol., 2002; Gonzalez-Polo a kol., 2003), o aktivovaných signálnych dráhach je známe veľmi málo. paraquatom (Cheng a kol., 2003; Chun a kol., 2001; Peng a kol., 2004) V každom prípade neexistujú žiadne štúdie o skorých udalostiach pozorovaných po vystavení nízkym koncentráciám parakvátu.

Niekoľko stimulov, vrátane MPPþ a paraquatu, môže aktivovať rad intracelulárnych signálnych kaskád, ktoré sú úzko spojené s dráhami bunkovej smrti a prežitia buniek. Napríklad MPPþ (Gomez-Santos a kol., 2002; Halvorsen a kol., 2002) aktivuje členov rodiny mitogénom aktivovaných proteínkináz (MAPK) a proteínkináz B (PKB). Členovia rodiny TheMAPK sú aktivovaní MPPþ alebo paraquatom zahŕňajú extracelulárne signálne regulované kinázy 1 a 2 (ERK1/2), c-Jun N-terminálne kinázy (JNK1 a JNK2) a p38 MAPKs. Všeobecne sa uznáva, že ERK1/2 a aktivácia PKB podporuje prežitie buniek aktiváciou antiapoptotických signálnych dráh, zatiaľ čo aktivácia JNK1/2 a p38 MAPK je spojená so smrťou neurónových buniek (Harper a LoGrasso, 2001; Shin a kol., 2001; Xia a kol., 1995) . Aktivácia fosfatidylinozitol 3-kinázy (PI-3K)/PKB dráhy sa podieľa na prežívaní neurónov (Shin et al., 2001). Najmä aktivácia dráhy JNK1/2 môže hrať rozhodujúcu úlohu v toxicite MPP a paraquatu (Cassarino a kol., 2000; Halvorsen a kol., 2002; Peng a kol., 2004) a následne v bunkových procesoch, ktoré sú ovplyvnené PD(Parkinsonova choroba).

Bylina cistanche: Antiparkinsonova choroba

MATERIÁLY A METÓDY

Bunková línia a kultúra.

V tejto štúdii sa použili spontánne imortalizované mozgové neuroblasty potkanov, bunky E18. Bunková línia E18 bola získaná spontánnou imortalizáciou z kultúr mozgovej kôry 18-deň starých potkaních plodov a láskavo ju poskytol Dr. A. Mun˜oz (Instituto de InvestigacionesBiome´dicas, CSIC, Madrid, Španielsko) . Bunky E18 predstavujú primitívne neuroblasty, ktoré exprimujú NF 68 a primitívny neurónový marker nestín, ale chýba im astrocytový marker, gliový fibrilárny kyslý proteín. Po čiastočnej diferenciačnej indukcii pomocou dibutyryl-cAMP bunky exprimujú ďalšie neurónové markery, ako napríklad NF 145, NF 220 a neurónovo špecifickú enolázu (Mun˜oz, osobná komunikácia). Bunky boli pestované v Hanks' F{10}} (Hyclone, Brevieres, Francúzsko) a doplnené 10 percentami FCS (Hyclone), streptomycínom (100 mg/ml) a penicilínom (100 U/ml). Bunky sa naočkovali pri 5 3 10 5 do 75-cm2 kultivačnej banky pre tkanivové kultúry (TPP, Trasadingen, Švajčiarsko) a inkubovali sa pri 37 °C v atmosfére 5 percent CO2/95 percent vzduchu. Kultúry sa pasážovali raz týždenne trypsinizáciou s použitím roztoku trypsín-EDTA (Hyclone).

Bunkové ošetrenia.

Konfluentné bunky (~ 80 percent) v 75-cm2 bankách na tkanivové kultúry sa trypsinizovali a naočkovali do misiek na tkanivové kultúry v koncentrácii 5 3104 buniek/cm2. O 24 hodín neskôr sa médium odsalo a nahradilo sa samotným čerstvým médiom alebo médiom obsahujúcim uvedené koncentrácie parakvátu. V ďalších experimentoch boli rôzne koncentrácie inhibítorov kinázy (LY 294002, wortmannín, SP 600125 a PD(Parkinsonova choroba)98059, všetky z Tocris, Bristol, Spojené kráľovstvo) boli pridané 30 minút pred vystavením parakvátu. Keďže kinázové inhibítory boli rozpustené v dimetylsulfoxide, boli vyrobené kontroly s najvyššou použitou koncentráciou (0,2 % obj./obj.). Pridanie dimetylsulfoxidu neovplyvnilo hodnoty životaschopnosti kontrolných platní.

Test životaschopnosti buniek.

Životaschopnosť buniek bola stanovená kolorimetrickým testom MTT (Mosmann, 1983). V životaschopných bunkách môže mitochondriálny enzým sukcinátdehydrogenáza metabolizovať MTT na formazánové farbivo, ktoré absorbuje svetlo pri 570 nm. Na tieto experimenty sa použili 24-jamkové testovacie platne. Na konci každého ošetrenia sa na každú platňu pridalo 100 ul MTT pripraveného v koncentrácii 5 mg/ml v PBS. Po 3 hodinách inkubácie sa médium dekantovalo a precipitáty formazanu sa solubilizovali kyslým izopropanolom (0,04–0,1 N HCl v absolútnom izopropanole). Absorbancia konvertovaného farbiva sa merala pri vlnovej dĺžke 570 nm s odčítaním pozadia pri 630–690 nm. Absorbancia neošetrených kultúr bola nastavená na 100 percent .

Na potvrdenie výsledkov získaných testom MTT bola bunková smrť tiež hodnotená meraním uvoľňovania cytosolického enzýmu laktátdehydrogenázy (LDH) do kultivačného média pomocou kolorimetrickej testovacej súpravy LDH (Roche, Indianapolis, IN) podľa pokynov výrobcu. . Únik LDH bol definovaný ako pomer aktivity LDH v kultivačnom médiu k celkovej aktivite na jamku (3100). Porovnateľné údaje boli získané použitím oboch metód.

Príprava bunkových extraktov a analýza Western blot.

Po experimentálnom ošetrení boli bunky (kultivované v 60-mm miskách) dvakrát premyté studeným PBS a odstránené zoškrabaním a potom centrifugované pri 900 3g počas 5 minút pri 4 °C. Bunky boli lyzované v pufri obsahujúci 50 mM HEPES, pH 7,5, 300 mM NaCl, 1 percento Triton X-100, 2 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mMNa3V04 a koktail inhibítora proteázy (Sigma, St Louis, MO). Bunky sa centrifugovali pri 13,{18}} g počas 5 minút pri 4 °C. Supernatanty sa skladovali pri 80 °C až do analýzy Western blotom. Koncentrácia proteínu sa merala podľa Bradforda (1976) s použitím BSA ako štandardu.

Rovnaké množstvá proteínov (10 LG na stav) sa rozdelili v 12-percentnej SDS gélovej elektroforéze a preniesli na PVDF membrány podľa konvenčných čiastočne modifikovaných metód (Fuentes et al., 2000). Stručne povedané, proteíny sa preniesli (250 mA počas 60 minút) na PVDF membrány s použitím zariadenia Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad, Hercules, CA). Postup imunodetekcie zahŕňa prenos a blokovanie membrány (60 minút pri teplote miestnosti) pomocou TTBS (10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl a 0,2 percenta Tween-20) s obsahom 10 percent odtučneného sušeného mlieka. Membrány sa potom inkubovali počas 60 minút pri teplote miestnosti s králičími polyklonálnymi primárnymi protilátkami (všetky od Cell Signalling, Beverly, MA, zriedené 1:1000) v TTBS + 10 percent odtučneného sušeného mlieka alebo 5 percent BSA. Po premytí (na dve 5-minútové periódy s TTBS) sa membrány inkubovali (60 minút pri teplote miestnosti) s peroxidázou konjugovanými anti-králičími sekundárnymi protilátkami (1:5000 v TTBS s 10 percentami odtučneného sušeného mlieka). Po premytí (na dve 5-minútové periódy a jednu 10-minútovú periódu) sa detekcia naviazaných protilátok vizualizovala pomocou chemiluminiscencie s použitím činidla ECL-plus (Amersham Biosciences, Orsay, Francúzsko) a analyzovala sa pomocou kvantity Jeden softvér (Bio-Rad). Obsah aktínu sa analyzoval ako kontrola s použitím králičej polyklonálnej protilátky (od Sigma) zriedenej 1:2500 v TTBS s 10 percentami odtučneného sušeného mlieka).

Štatistická analýza.

Každý experiment sa opakoval aspoň trikrát s uspokojivou koreláciou medzi výsledkami jednotlivých experimentov. Uvedené údaje sú údaje z reprezentatívneho experimentu; každá skupina mala v priemere tri až štyri kultivačné misky. Všetky údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM. Výsledky boli analyzované pomocou ANOVA. Hodnoty p menšie ako 0,05 sa považovali za významné.

Antiparkinsonova choroba:Extrakt z Cistanche

VÝSLEDKY

Cytotoxické účinky paraquatu v bunkách E18

Ako už bolo uvedené (Cappelletti a kol., 1998; Chun a kol., 2001; Gonzalez-Polo a kol., 2004), niekoľko bunkových línií je citlivých na toxické vlastnosti parakvátu. Expozícia parakvátu spôsobila od dávky závislé zníženie životaschopnosti buniek. (Obr. 1.) V tejto štúdii bunky E18 ošetrené 25 1M paraquatom počas 24 hodín vykazovali 50-percentnú stratu životaschopnosti buniek. Životaschopnosť buniek sa hodnotila meraním transformácie na MTT na formazánové farbivo, ktoré absorbuje svetlo pri 570 nm. Tento test sa vo veľkej miere používa na monitorovanie bunkovej smrti v niekoľkých bunkových líniách vrátane buniek E18 (Donaire a kol., 2005; Garcia-Roman a kol., 2001) a rôznych urážok, vrátane paraquatu (Chun a kol., 2001; Gonzalez -Polo a kol., 2004).

Aktivácia ERK1/2 v bunkách E18 indukovaná paraquatom

Zvýšenie aktivácie ERK1/2 v bunkách E18 ošetrených paraquatom sa monitorovalo pomocou Western blotting s použitím fosfošpecifickej protilátky ERK1/2 (Thr202/Tyr204). Expozícia buniek E18 neuroblastov s 25 1M paraquatu spôsobila výrazné zvýšenie stavu fosforylácie (Thr202/Tyr204) ERK1/2 (44/42 kDa) (obr. 2A). Maximálne zvýšenia fosforylácie sa vyskytli po 5 minútach, po ktorých hladiny fosforylácie pomaly klesali na takmer bazálne hladiny. Okrem toho zvýšenie fosforylácie ERK1/2 vyvolané paraquatom nebolo závislé od koncentrácie (obr. 2B). Predbežná liečba inhibítorom MEK1, PD(Parkinsonova choroba)98059 (50 uM; Dudley et al., 1995) úplne inhiboval zvýšenie fosforylácie ERK1/2 vyvolané paraquatom (obr. 3).

Aktivácia PKB v bunkách E18 indukovaná paraquatom

Aktivácia PKB v bunkách E18 sa detegovala Western blotovaním s použitím fosfo-špecifickej (Ser473) protilátky. Stimulácia buniek E18 25 1M paraquatom vyvolala výrazné zvýšenie fosforylácie PKB (obr. 4A). Toto zvýšenie nastáva po 20 minútach, porovnateľné s fosforyláciou ERK1/2 po tom, čo hladiny fosforylácie pomaly klesali na takmer bazálne hladiny (obr. 4A). Okrem toho zvýšenie fosforylácie PKB sprostredkované paraquatom bolo závislé od koncentrácie s maximom pri 25 1M paraquatu (obr. 4A). Keďže PI-3K je potrebný na aktiváciu PKB, úloha PI-3K pri aktivácii PKB vyvolanej parakvátom v bunkách E18 sa preto skúmala pomocou inhibítorov PI-3K wortmannínu a LY 294002.

Paraquatom sprostredkované zvýšenia fosforylácie PKB boli úplne blokované po predbežnom ošetrení (30 minút) buniek E18 100 nM wortmannínom a 30 uM LY 294002 (obr. 5). Tieto pozorovania ukazujú, že dráha závislá od PI-3K sprostredkuje zvýšenie fosforylácie PKB v bunkách E18 vyvolané paraquatom.

Parakvatom indukovaná aktivácia JNK1/2 v bunkách E18

Predchádzajúce štúdie ukázali, že paraquat aktivuje JNK1/2 v neurónoch (Chun a kol., 2001; Peng a kol., 2004) a neneurónové bunky (Bennett a kol., 2001; Cheng a kol., 2003). Použité koncentrácie sú však značne vyššie ako koncentrácie použité v tejto práci. Okrem toho sú časy zvolené na vizualizáciu aktivácie JNK1/2 tiež dlhšie. Aktivácia JNK1/2 v bunkách E18 sa detegovala Western blotom s použitím fosfošpecifickej protilátky JNK (Thr183/Tyr185). Stimulácia buniek E18 25 1M paraquatom vyvolala výrazné a skoré zvýšenie fosforylácie JNK (46/54 kDa) (obr. 6A). Tieto zvýšenia boli maximálne po 5 minútach, po ktorých hladiny fosforylácie klesli smerom k bazálnym hladinám (obr. 6A). Avšak zvýšenie fosforylácie JNK1/2 sprostredkované parakvatom nebolo závislé od koncentrácie (obr. 6B). Paraquatom sprostredkované zvýšenia fosforylácie JNK1/2 boli citlivé na JNK1/2 inhibítor SP 600125 (10 uM; obr. 7; Bennett a kol., 2001). Nakoniec, paraquat (25 uM) nestimuloval merateľné zvýšenie fosforylácie p38 MAPK v bunkách E18 v rovnakých experimentoch s časovým priebehom (údaje nie sú uvedené). Tieto experimenty sa uskutočnili s použitím fosfošpecifickej protilátky p38 MAPK(Thr180/Tyr182).

Meranie životaschopnosti buniek po ošetrení buniek E18 paraquatom a inhibítormi kinázy

Po preukázaní, že parakvát produkuje vo všetkých prípadoch včasnú aktiváciu ERK1/2, PKB a JNK1/2 v bunkách E18, sme následne určili úlohu rýchlej aktivácie týchto kinázových dráh v bunkovej smrti indukovanej nízkymi koncentráciami parakvátu pomocou farmakologicky špecifických inhibítory. Ako je znázornené na obrázku 1, vystavenie buniek E18 25 1M paraquatu vyvolalo významné zníženie životaschopnosti buniek (okolo 50 percent). Aby sa preskúmala úloha ERK1/2, PKB a JNK1/2 pri bunkovej smrti indukovanej paraquatom, bunky E18 sa predinkubovali počas 30 minút s nasledujúcimi inhibítormi kinázy: PD(Parkinsonova choroba)98059 (50 uM; inhibítor MEK1/2), LY 294002 (30 uM; inhibítor PI-3K), wortmannín (100 nM; inhibítor PI{8}}K) a SP 600125 (10 uM; inhibítor JNK1/2). Ako je znázornené na obrázku 8 (a je zhrnuté v tabuľke 1), wortmannín, LY 294002 a PD 98059 nemali žiadny významný účinok na stratu životaschopnosti buniek vyvolanú 25 1M paraquatom.

DISKUSIA

Rôzne štúdie nedávno zvýšili záujem o možnosť, že environmentálne neurotoxíny, ako sú pesticídy, môžu súvisieť s vývojom negenetickej PD.(Parkinsonova choroba)(Cory Slechta a kol., 2005; Landrigan a kol., 2005; Norris a kol., 2004; Ritz a Yu, 2000; Sherer a kol., 2001). PQ je jedným z možných herbicídov, ktoré sa podieľajú na PD, kvôli podobnej chemickej štruktúre ako MPPþ a silnej korelácii medzi výskytom choroby a množstvom použitého PQ (Lanska, 1997; Liou a kol., 1997; Ritz a Yu, 2000). Mechanizmus neuronálnej toxicity, ku ktorej dochádza pri nedostatočnom vystavení nízkym hladinám parakvátu, však nebol stanovený. V každom prípade predchádzajúce práce nezaujímajú raný proces doložený po expozícii paraquatu. Hlavným zistením tejto štúdie je, že sme ukázali, že bunky neuroblastu E18 vystavené nízkym koncentráciám paraquatrapid zvýšili aktivovanú fosforyláciu všeobecne antiapoptotických signálnych dráh PI-3K/PKB a MEK ERK a tiež všeobecne proapoptotických JNK1/ 2 MAPK. Na rozdiel od toho paraquat nestimuloval merateľné zvýšenie fosforylácie p38 MAPK závislé od času alebo koncentrácie. Ako je uvedené vyššie, použili sme nízku koncentráciu parakvátu. Diskutovalo sa o význame skutočnosti, či sa parakvát môže alebo nemôže dostať do mozgu, pretože ide o nabitú molekulu. Nedávne zistenia (Shimizu et al., 2001) však odhalili, že paraquat môže využiť pumpu neutrálnych aminokyselín na to, aby sa dostal do mozgu. Zistenia prezentované v tejto práci naznačujú, že v bunke je potrebná iba nízka koncentrácia paraquatu na rýchlu stimuláciu niekoľkých signálnych dráh vrátane NK, ktoré sa podieľajú na procesoch bunkovej smrti. Tieto skoré aktivácie v dôsledku nízkej koncentrácie parakvátu sú po prvýkrát navrhnuté v tejto práci.

Malá pozornosť bola venovaná štúdiu zmien v hladinách fosforylácie PKB alebo ERK1/2 vyvolaných paraquatom (Cheng a kol., 2003; Peng a kol., 2004). V každom prípade predchádzajúce správy (Peng et al., 2004) používajú relatívne vysoké koncentrácie paraquatu (400 lM), čím sa meria stupeň fosforylácie ERK po 12–18 hodinách expozície. V týchto časoch nepozorovali zmeny v hladinách p-ERK. V našej práci sme zistili skorú (5–10 min.) a dôležitú aktiváciu ERK1/2 (obr. 2A). Táto aktivácia pomaly klesá na bazálnu úroveň. V našich podmienkach sú hladiny fosforylovaného ERK1/2 (po 12–18 hodinách) rovnaké ako v kontrole, čo naznačuje, že táto dráha nie je v týchto časoch aktívna (údaje nie sú uvedené), ako opísali Peng et al. (2004). Táto aktivácia nie je závislá na koncentrácii, čo naznačuje výsledok, že silná stimulácia ERK sa získa a udržiava s veľmi nízkymi koncentráciami paraquatu. Zmeny v hladinách fosforylovaného PKB po expozícii parakvátu stále neboli opísané. Na obrázku 4 ukazujeme, že výsledky sú závislé od času a koncentrácie, čo ukazuje maximálny účinok po 20-minútovej expozícii 25 lM parakvátu. To znamená, že skoré zvýšenia fosforylácie PKB sprostredkované parakvátom sú porovnateľné s tými, ktoré sa pozorovali pre ERK1/2. Tieto údaje odhaľujú skoré zvýšenie aktivácie fosforylácie dráh prežitia PKB aj ERK. Neexistujú žiadne údaje o včasnej aktivácii PKB alebo ERK pri bunkovej smrti indukovanej parakvátom. Predchádzajúce štúdie (Halvorsen et al., 2002) však opisujú podobné skoré zvýšenie oboch dráh v bunkách neuroblastómu SH-SY5Y vystavených MPPþ. V tomto prípade hladiny fosforylácie neklesajú smerom k bazálnej úrovni. Tieto údaje sú obzvlášť zaujímavé kvôli predtým súvisiacej podobnej štruktúre medzi paraquatom a MPPþ, čo naznačuje odlišný začiatok bunkového aparátu, ktorý sa podieľa na účinku oboch molekúl.

Viac pozornosti sa venovalo úlohe JNK1/2 dráhy pri sprostredkovaní signálov prispievajúcich k bunkovej smrti vyvolanej paraquatom. V tejto štúdii sme ukázali, že nízke koncentrácie (25 lM) paraquatu spustili významné zvýšenie fosforylovaného JNK1/2 (obr. 6). Ako sa vyskytuje v prípade PKBor ERK1/2, táto aktivácia je závislá od času s veľmi skorým začiatkom (5 minút) as pomalým návratom k bazálnym hladinám. Predchádzajúce práce (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) ukazujú neskoré (12–18 h) aktivácie JNK1/2 dráhy produkovanej v každom prípade relatívne vysokými koncentráciami paraquatu (od 400 lM [Peng et al., 2004] na 800 uM [Chunet al., 2001]). V našich podmienkach je stupeň fosforylácie JNK1/2 v uvedených časoch porovnateľný s kontrolou. Celkovo tieto výsledky po prvýkrát naznačujú, že vystavenie buniek veľmi nízkej koncentrácii paraquatu spôsobuje skorú aktiváciu dráh PKB, ERK1/2 a JNK1/2.

Po zistení, že paraquat spúšťa skorú aktiváciu PKB, ERK1/2 a JNK1/2 v bunkách E18, sme potom skúmali úlohu týchto proteínkinázových dráh v bunkovej smrti indukovanej paraquatom pomocou niekoľkých farmakologických inhibítorov. Životaschopnosť buniek sa monitorovala meraním transformácie na MTT na formazánové farbivo, ktoré absorbuje svetlo pri 570 nm. Test MTT sa použil na presné meranie poškodenia neurónov po rôznych urážkach vrátane MPPþ alebo paraquatu (Gonzalez Polo a kol., 2003, 2004; Schmuck a kol., 2002; Sheng a kol., 2002; Storch a kol., 2004 ), a je to najpoužívanejšia metóda na určenie bunkovej smrti. Ako je znázornené na obrázku 8, predbežné ošetrenie selektívnym inhibítorom JNK1/2 SP 600125 významne znížilo bunkovú smrť vyvolanú paraquatom. Táto koncentrácia SP 600125 úplne blokovala paraquatom indukovanú aktiváciu JNK1/2 (obr. 7). Tieto údaje naznačujú, že inhibícia včasnej aktivácie JNK1/2 dráhy chráni bunky pred bunkovou smrťou vyvolanou paraquatom. Tieto údaje sú v súlade s predchádzajúcimi štúdiami (Chun a kol., 2001; Peng a kol., 2004), ktoré ukázali, že JNK1/2 sa podieľa na smrti neurónových buniek vyvolanej paraquatom. Tieto štúdie však používajú 15 až 30-krát vyššiu koncentráciu paraquatu, ako sa používa v tejto štúdii. Tiež demonštrujeme, že nízke koncentrácie paraquatu môžu spôsobiť nielen aktiváciu, ale aj skorú aktiváciu tejto dráhy. Ochrana pozorovaná s SP600125 tiež naznačuje, že dráha JNK1/2 sa podieľa na bunkovej smrti indukovanej paraquatom. Okrem toho bola inhibícia JNK1/2 navrhnutá ako potenciálna stratégia pri liečbe PD(Parkinsonova choroba)v niekoľkých modeloch in vivo aj in vitro (Wang et al., 2004).

neuroprotektívny účinok cistanche

Predchádzajúce štúdie ukázali, že dráhy PKB aj ERK sa podieľajú na prežívaní neurónov (Guyton a kol., 1996; Shin a kol., 2001). V tejto štúdii sme ukázali, že nízke koncentrácie paraquatu produkujú a skoro stimulujú PKB aj ERK dráhy. Tieto pozorovania naznačujú, že aktivácia PKB a ERK vyvolaná paraquatom sa môže podieľať na ochrane buniek pred bunkovou smrťou vyvolanou paraquatom. Na preskúmanie tejto možnosti sme použili štrukturálne nepríbuzné PI-3K inhibítory wortmannín a LY 294002 a ERK1/2inhibítor PD(Parkinsonova choroba)98059. Je zaujímavé, že inhibícia PKB aj ERK nezmenila životaschopnosť buniek v prítomnosti paraquatu, čo naznačuje, že v našich podmienkach nie je zvýšená aktivácia PKB a ERK nevyhnutná na prežitie pri bunkovej smrti indukovanej paraquatom v bunkách E18.

Je dobre známe, že mechanizmus neurotoxicity parakvátu je okrem iných faktorov sprostredkovaný oxidačným stresom (Gonzalez-Polo a kol., 2004; Mollace a kol., 2003). V tomto zmysle bol nedávno opísaný veľmi rýchly cytosolický oxidačný stres v skorých apoptotických udalostiach, ktoré sa podieľajú na bunkovej smrti indukovanej paraquatom (Gonzalez-Polo et al., 2004). Keďže oxidačný stres aktivuje členov rodiny MAPK (ako ERK1/2 a JNK1/2) a PKB (Kamata a Hirata, 1999), túto skorú aktiváciu ERK1/2, JNK1/2 a PKB možno pripísať rýchlej oxidačnej stres vyvolaný po expozícii paraquatu.

Stručne povedané, naše výsledky prvýkrát ukazujú, že nízke koncentrácie paraquatu stimulujú veľmi skoré a robustné zvýšenie fosforylácie PKB, ERK1/2 a JNK1/2 v bunkách E18. Okrem toho sme ukázali, že inhibícia včasnej aktivácie JNK1/2 dráhy chráni bunky E18 pred bunkovou smrťou vyvolanou paraquatom. Tento výsledok poukazuje na existenciu niektorých skorých udalostí (ako je rýchla aktivácia JNK1/2), ktoré hrajú zásadnú úlohu v bunkovej smrti vyvolanej nízkymi koncentráciami paraquatu. Tento výsledok tiež otvára novú a vzrušujúcu líniu v štúdiu toxicity parakvátu a jej možného vplyvu na rozvoj PD(Parkinsonova choroba).

POZNÁMKA: Cistancheje tradičná čínska bylina, ktorá má účinky na neuróny a mozgové bunky. cistanche je známy aj ako púštny ženšen, je to potenciálna liečba nervových chorôb ako naprParkinsonova chorobana základe modernej farmakologickej štúdie